Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11 Характеристика ТоИ-подобных рецепторов 12
Сигнальные пути ТоИ-подобных рецепторов 18
Лиганды ТоИ-подобных рецепторов 22
Лиганды TLR2 - пептидогликан и зимозан А 22
Лиганд TLR4 - липополоисахарид (ЛПС) 26 Лиганды TLR3 и TLR9 32
Значение Toll-подобных рецепторов в норме и при патологии 34
Возрастные особенности функционирования Toll-подобных 34 Иммунодефицита, связанные с Toll-подобными рецепторами 39
Глава II. Материалы и методы исследования 45
2.2. Клиническая характеристика обследованных больных 45
2.3. Реактивы 46
2.5 Выделение МНК из периферической крови человека 47
2.6. Культивирование МНК периферической крови человека 48
2.7. Определение концентрации цитокинов в культуральныхсупернатантах методом иммуноферментного анализа 51
2.8. Фенотипический анализ клеток 54
2.9. Статистическая обработка результатов 55
Глава III. Результаты и обсуждение 57
3.1. Влияние лигандов ТоИ-подобных рецепторов на выработку ФНОос мононуклеарными клетками периферической кровиздоровых доноров 57
3.1.1. Изучение выработки ФНОа МНК периферической кровичеловека при стимуляции разными концентрациями лигандовTLR 57
3.1.2. Сравнительный анализ продукции ФНОа МНК периферической крови здоровых доноров в ответ на различные 67
3.2. Влияние лигандов ТоИ-подобных рецепторов на выработкуИФН-а МНК периферической крови здоровых доноров 72
3.3. Влияние лигандов ТоИ-подобных рецепторов на выработку ФНОа МНК больных ОВИН 77
3.3.1. Определение спонтанной продукции ФНОа МНКпериферической крови больных ОВИН 77
3.3.2. Определение стимулированной лигандами TLRпродукции ФНОа МНК больных ОВИН 78
3.4. Влияние лигандов TLR на выработку ФНОа МНКбольных Х-АГГ 81
3.4.1. Определение спонтанной продукции ФНОа МНК 83
3.4.2. Определение стимулированной лигандами TLRпродукции ФНОа МНК больных Х-АГГ 84
3.5. Влияние лигандов TLR на выработку ИФН-а МНКбольных ПИД с дефектами антителообразования 88
3.6. Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхностимоноцитов периферической крови человека 91
3.6.1. Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхности 91
3.6.2. Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхностимоноцитов периферической крови больных ОВИН 92
3.6.3. Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхностимоноцитов периферической крови больных Х-АГГ 96 104
Список литературы 106
- Лиганд TLR4 - липополоисахарид (ЛПС) 26 Лиганды TLR3 и TLR9
- Определение концентрации цитокинов в культуральныхсупернатантах методом иммуноферментного анализа
- Влияние лигандов ТоИ-подобных рецепторов на выработкуИФН-а МНК периферической крови здоровых доноров
- Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхностимоноцитов периферической крови человека
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем фундаментальной и клинической иммунологии является изучение врожденного иммунитета. Врожденный иммунитет является первой линией защиты организма от патогенов. Он реализуется через клеточные и гуморальные факторы. Факторы врожденного иммунного ответа предсуществуют или индуцируются быстро (минуты, часы) после инфекции. Компоненты врожденного иммунного ответа не изменяются в процессе жизни организма, контролируются генами зародышевой линии и передаются по наследству.
Важным компонентом системы врожденного иммунитета являются паттерн-распознающие рецепторы (ПРР), участвующие в распознавании консервативных молекулярных структур микроорганизмов, так называемых PAMP (паттерны, ассоциированные с микроорганизмами).
Реализация специфичности врожденной иммунной системы ложится, в большей степени, на семейство эволюционно консервативных рецепторов, известных как Toll-подобные рецепторы (TLR), которые играют решающую роль в ранней защите организма от патогенов. TLR являются сигнальными ПРР и рассматриваются исследователями, как ключевые рецепторы врожденного иммунитета [R.Medzhitov, CJ Janeway, 1997]. Изучение TLR выявило связь между врожденным и приобретенным иммунитетом. Распознавание микробных компонентов TLR инициирует активацию сигнальных путей, в результате чего происходит экспрессия генов цитокинов (ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, ИФНa/b и других), костимуляторных молекул и некоторых других генов. Продукты этих генов контролируют систему врожденного иммунитета и, в дальнейшем, направляют развитие адаптивного иммунного ответа [T.Kawai, S.Akira, 2007, L.C. Parker et al, 2007, F. Sandor et M. Buc, 2005]. Характер и интенсивность ответа, опосредуемого TLR, определяется несколькими компонентами, составляющими систему TLR. Система TLR включает лиганды TLR, сами рецепторы (гены, кодирующие TLR, мРНК, белок), молекулы, осуществляющие трансдукцию сигнала – адаптерные белки, а также эффекторные молекулы, которые вырабатываются в результате активации TLR и опосредуют их дальнейшие эффекты.
В последние годы накапливается все больше сведений о патологиях, связанных с Toll-подобными рецепторами. Широкий спектр лигандов TLR и представленность этих рецепторов на большинстве клеток организма способствуют вовлечению TLR в патогенез многих заболеваний. Дефекты в системе TLR: нарушения распознавания лигандов, экспрессии TLR, трансдукции сигнала, выработки эффекторных молекул, а также полиморфизм генов TLR могут приводить к развитию тяжелых инфекционных заболеваний (сепсис, менингит), аутоиммунных заболеваний, атеросклероза, аллергопатологии и др. Выявленные дефекты молекул, участвующих в трансдукции сигнала от TLR, лежат в основе повышенной восприимчивости к инфекциям, как, например, у больных с дефектом гена, кодирующего IRAK4 киназу.
Для выявления состояний, связанных с нарушением функционирования системы TLR необходимы адекватные и надежные методы оценки компонентов системы TLR, которые могут быть воспроизведены в условиях стандартной клинической лаборатории.
Первичные иммунодефициты с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) характеризуются частыми реккурентными бактериальными инфекциями. Иммунопатогенез ОВИН до конца не ясен. Нарушения, выявляемые при ОВИН, вызваны множественными дефектами иммунной системы и на данный момент нет единого мнения о молекулярных механизмах этих нарушений. В последнее время в литературе появляются данные о дефектах созревания антигенпрезентирующих клеток у больных ОВИН [Bayry J. et al, 2004, Cunningham-Rundles C., Radigan L., 2005, Yong P.F. et al, 2008]. Изучение механизмов нарушений функционирования врожденной иммунной системы у этих больных позволит прояснить иммунопатогенез ОВИН.
На кафедре иммунологии РГМУ (зав. кафедрой – профессор Л.В. Ковальчук) с 2005 года проводится работа по оценке системы TLR в норме и при различных иммунопатологических состояниях.
Изучить функциональное состояние экспрессирующих TLR мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров и больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования.
-
Отработать оптимальные условия оценки функциональной активности МНК периферической крови человека, экспрессирующих TLR in vitro.
-
Оценить эффективность действия различных лигандов TLR на цитокинсинтезирующую функцию МНК периферической крови здоровых доноров.
-
Изучить влияние лигандов Toll-подобных рецепторов на выработку ФНОa МНК периферической крови больных ПИД с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ).
-
Оценить экспрессию TLR на поверхности моноцитов периферической крови здоровых доноров и больных ОВИН и Х-АГГ методом проточной цитофлуорометрии.
Работа содержит новые данные о дефектах в системе Toll-подобных рецепторов у больных ПИД с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ). Показано, что при данных ПИД нарушена выработка ФНОa в ответ на стимуляцию лигандами TLR2 и TLR4. Выявлен дисбаланс индуцированной лигандом TLR4 ЛПС выработки ФНОa, ИЛ-12 и ИФН-a МНК больных ОВИН.
Показаны различия в экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови здоровых доноров и больных ПИД с дефектами антителообразования. Обнаружены различия количества моноцитов, несущих на своей поверхности исследуемые TLR, у здоровых доноров и больных ПИД и плотности экспрессии TLR2 и TLR4 на одной клетке.
Полученные данные позволяют предположить, что дефекты созревания антигенпрезентирующих клеток, выявляемые у больных ОВИН, могут быть связаны с нарушениями в системе TLR.
В данной работе определены оптимальные условия оценки цитокинсинтезирующей функции активированных лигандами TLR МНК периферической крови здоровых доноров и больных с иммунопатологией. Оценена выработка ФНОa и ИФН-a МНК в ответ на лиганды TLR у здоровых доноров. Выявлено, что максимальным стимулирующим влиянием на выработку ФНОa МНК обладают лиганды TLR2 и TLR4, а на выработку ИФН-a лиганды TLR4, TLR3 и TLR9. Полученные данные позволяют оценить состояние рецепторов врожденного иммунитета у больных с иммунопатологией. У больных ПИД с дефектами антителообразования в ходе настоящего исследования выявлено снижение выработки ФНОa в ответ на лиганды TLR2 и TLR4 и нарушение экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОВИН, что свидетельствует о новых молекулярных дефектах в системе врожденного иммунитета у больных ОВИН и позволяет уточнить иммунопатогенез ОВИН.
Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедре иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, используются в практике лечебно-диагностической работы в отделении клинической иммунологии РДКБ.
Материалы диссертационной работы докладывались на научных заседаниях кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в 2005 году на Конференции молодых ученых Института иммунологии, в 2006 году на II Всероссийском конгрессе по детской аллергологии и иммунологии, в 2007 году на VI Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», в 2006, 2007 и 2008 году в Москве на XIII, XIV и XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» и на Объединенном иммунологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008).
По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ
Лиганд TLR4 - липополоисахарид (ЛПС) 26 Лиганды TLR3 и TLR9
TLR4 (9q32-33) рецептор для липополисахарида (ЛПС). Экспрессируется в организме на поверхности макрофагов, нейтрофилов, дендритных клеток, Т-и В-лимфоцитов и других. ЛПС - это компонент стенки грамотрицательных бактерий. Молекула ЛПС состоит из ядра, О-антигена и липида А. Липид А, или эндотоксин, единственный участок ЛПС, который распознается врожденной иммунной системой [105]. На модели мышей, дефектных по tlr4-гену, показано, что TLR4 является основным рецептором для .проведения сигнала от ЛПС. Выявленные мутации tlr4 связаны со снижением чувствительности к ЛПС [124]. Многие субстанции немикробного происхождения способны действовать через TLR4. Например; таксол, алкалоид из коры тихоокеанского тиса, является эффективным противоопухолевым агентом, блокирующим митоз, действует через TLR4 [94]. Белки HSP60 человека также взаимодействуют с TLR4 и индуцируют экспрессию генов провоспалительных цитокинов [143].
TLR5 (lq33) экспрессируется на клетках селезенки и лейкоцитах периферической крови, эндотелиальных клетках. TLR5 распознают флагеллин грамположительных и грамотрицательных бактерий [17,115]. Флагеллин - это главный компонент бактериальных жгутиков, и он является фактором вирулентности, который распознается врожденной иммунной системой разнообразных организмов: растений, насекомых и млекопитающих. Активация TLR5 ведет к активации транскрипционного фактора NF-кВ И стимулирует продукцию ФНОа (фактор некроза опухоли а) иИЛ-6[65].
TLR6 (4р) экспрессируется на клетках селезенки, лейкоцитах периферической крови. Образует димеры с TLR2 и распознает пептидогликаны и зимозан [140].
TLR7 (Хр22.3) в изобилии экспрессируется в клетках легких, плаценты, селезенки и лейкоцитах периферической крови. В сравнении с TLR1-6 имеет высокий молекулярный вес за счет большого внеклеточного домена. Работы, выполненные на TLR7 дефектных мышах, показали, что TLR7 распознают имидозольные соединения, такие как R848, обладающие антивирусными свойствами [136].
TLR8 (Хр22), идентифицированный вместе с TLR7 и TLR9, экспрессируется в большом количестве в лейкоцитах периферической крови и клетках легких. Естественный лиганд еще не обнаружен, подобно TLR7 чувствителен к имидозольным соединениям с антивирусной активностью (имидазохинолин и локсорибин). В недавних исследованиях было показано, что TLR7 и TLR8 распознают гуанозин- или уридин-богатые повторы одноцепочечной РНК (ssRNA) вирусов, таких как вирус иммунодефицита человека, вирус гриппа- и вирус везикулярного стоматита [30,67,140]. Особое внимание привлекают исследования роли TLR9 в иммунных процессах. По последним данным TLR9 (Зр21.3) локализуется внутриклеточно, на эндоплазматическом ретикулуме, с последующим перемещением после стимуляции в эндосомы [75,90]. TLR9 вовлечен в распознавание CpG, которыми бактериальная и вирусная ДНК отличается от ДНК млекопитающих [120,128,131].
TLR10 и TLR11 идентифицированы совсем недавно. Функции и лиганд TLR10 до сих пор неизвестны. Он экспрессируется преимущественно на иммунокомпетентных клетках, например, на В-лимфоцитах после активации В-клеточного рецептора [17]. Полагают, что TLR10 также как другие Toll-подобные рецепторы вовлечен в иммунный ответ и может действовать как корецептор, подобно TLR1 и TLR6.
TLR11 экспрессируется на эпителиальных клетках почек и мочевого пузыря мыши и опосредует устойчивость к уропатогенным инфекциям [160]. Последовательности TLR11 присутствуют в геномах многих млекопитающих, в том числе и человека. Однако у человека в регионе, кодирующем TLR11 обнаружены стоп-кодоны, что препятствует экспрессии TLR11 на клетках человека. Возможно, что наличие стоп-кодонов в области TLR11 является формой генетического полиморфизма [159].
Имеются данные о том, что Toll-подобные рецепторы распознают эндогенные лиганды такие, как белки теплового шока HSP60, HSP70, gap96 и многие другие, включая фибриноген, домен А фибронектина, Р-дефензин 2 из различных источников, что в конечном итоге ведет к выработке провоспалительных цитокинов, хемокинов моноцитами, макрофагами и дендритными клетками [126,143]. Индукция провоспалительных цитокинов эндогенными лигандами через Toll-подобные рецепторы может играть роль в развитии хронического воспаления, патогенезе ряда аутоиммунных заболеваний, таких как болезнь Крона, диабет 1 типа, атеросклероз [152,154]. Сигнальные пути Toll-подобных рецепторов
В литературе накапливается все больше данных о том, что Toll-подобные рецепторы играют важную роль не только в противоинфекционной защите, нарушение их функции приводит к развитию целого ряда патологических процессов в организме животных и человека с локализацией дефектов на разных уровнях сигнальной трансдукции. На сегодняшний день достаточно полно охарактеризованы молекулярные механизмы проведения сигналов через Toll-подобные рецепторы.
После связывания лиганда TLR димеризуются и претерпевают конформационные изменения, необходимые для привлечения сигнальных молекул вовлекаемых в каскад [15,58]. Они включают, как правило, адаптерную молекулу MyD88 (белок первичного ответа миелоидной дифференцировки 88), TIRAP (адапторный белок, содержащий TIR домен), IRAK киназы (киназы, ассоциированные с рецептором ИЛ-1), ТАК1(киназа, активированная трансформирующим факторов роста (3), TAB 1 и ТАВ2 (ТАК связывающие белки 1 и 2, соответственно), TRAF6 aKTOp 6, ассоциированный с рецептором ФНО).
Стимуляция TLR приводит к перемещению адапторного белка MyD88 к цитоплазматическому TIR домену, где он облегчает связывание IRAK4 с рецепторным комплексом через DD (домен смерти) (рис. 1).
Следующим компонентом сигнального каскада являются киназы семейства IRAK. У млекопитающих обнаружены четыре члена семейства IRAK - IRAKI, IRAK2, IRAK4 и IRAK-M [82]. IRAK киназы имеют N-концевой DD домен и центральный серин/треониновый-киназный домен. Важным этапом является связывание MyD88 с IRAK4, без которого не развивается дальнейший сигнальный каскад. ШАК4-опосредованное фосфорилирование оснований в IRAKI индуцирует ее киназную активность. Активированная IRAKI киназа аутофосфорилируется по основаниям на N-конце, что дает возможность TRAF6 присоединиться к этому комплексу.
Определение концентрации цитокинов в культуральныхсупернатантах методом иммуноферментного анализа
Инфекция, вызванная Salmonella, у инбредных линий мышей одна из лучших моделей для изучения брюшного тифа, и экспрессия флагеллина обычно учитывается как вирулентный фактор [38]. Недавние исследования, проведенные на кроликах раскрыли потенциальную роль жгутиков в начальном взаимодействии Salmonella с М-клетками аппендикса. Более того, флагеллин требуется для инвазии Salmonella в культуру клеток и для индукции инфильтрации полиморфноядерных лейкоцитов в модели инфекционного процесса.
Флагеллин распознается клетками организма-хозяина с помощью TLR5. TLR5 экспрессируется на моноцитах, незрелых дендритных клетках и эпителиальных клетках [23,128]. Флагеллин как лиганд TLR5 рецептора был определен в исследованиях по выделению стимулирующих компонентов из культуральных супернатантов Listeria методом жидкостной хромотографии высокого давления (HPLC). В ходе параллельных исследований изучалась активация эпителиальных клеток в ответ на Salmonella и флагеллин также был идентифицирован как стимулирующий лиганд TLR5. Таким образом, TLR5 распознает флагеллин Cram+ и Gram" бактерий, обеспечивая организму простую стратегию защиты от жгутиковых бактерий.
В отличие от многих других лигандов TLR флагеллин является белковой молекулой, и это способствовало детальному изучению структурных особенностей взаимодействия флагеллина и TLR5. Двумя группами ученых была подтверждена активность флагеллина, полученного в эукариотической экспрессирующеи системе, и это демонстрирует, что стимулирующая способность флагеллина не зависит от источника его происхождения или получения.
После проведения делеционного, инсерционного и аланин-сканирующего мутагенеза был точно определен сайт распознавания TLR5 на флагеллине. Он представляет собой кластер из 13 аминокислот, которые участвуют во внутримолекулярных взаимодествиях жгутиковых протофиламентов, что требуется для подвижности бактерий. Сайт распознавания расположен в жгутиковых филаментах и именно мономерный флагеллин, а не молекулы филаментов стимулируют TLR5 [137]. Таким образом, бактерии не могут s избежать распознавания клетками врожденного иммунитета, изменив структуру флагеллина посредством мутации, т.к. это может привести к нарушению движения. Однако до сих пор остается неясным, каким образом происходит распознавание внутренней структуры жгутикового филамента. Возможно, что олигомеры или мономеры флагеллина становятся доступными для клеточного распознавания после расщепления в фагосоме, либо распознавание происходит в период репликации бактерий [127]. Лиганды TLR3 и TLR9 Бактериальная и вирусная ДНК стимулирует клетки иммунной системы. Эта стимуляция вызывает продукцию многочисленных цитокинов, включая ИЛ-12, ИФН-у, ФНО-сс и ИЛ-6 моноцитами/макрофагами, дендритными клетками, экспрессию костимуляторных молекул, пролиферацию В лимфоцитов, продукцию иммуноглобулинов [80,107,131].
Полиинозиновая:полицитидиновая кислота — Р(1:С), лиганд TLR3, является синтетическим аналогом двухцепочечной вирусной РРЖ [99]. Поскольку большинство вирусов в процессе своей репликации синтезируют двуцепочечную РНК, Р(1:С) используется в экспериментах in vitro для воспроизведения эффектов, возникающих при вирусной инфекции [95,53]. Р(1:С) является мощным индуктором ИФН I типа (ИФН а и Р), но также показано, что под его действием лейкоциты способны вырабатывать ИЛ-12, ИЛ-6 и ФНОа [53]. NK-клетки активируются под действием лиганда TLR3, стимулиркутся их цитотоксическая функция, индуцируется выработка провоспалительных цитокинов и ИФНу. Таким образом, способность NK-клеток напрямую распознавать вирусные продукты играет большую роль в развитии противовирусного ответа.
TLR9 вовлечен в распознавание бактериальной и вирусной ДНК, так как все CpG-индуцируемые эффекты отменялись на клеточных линиях и мышах, дефектных по TLR9 [32,117,123]. Получены синтетические олигодезоксинуклеотиды (ОДН), содержащие цитозин полигуаниновые мотивы (ОДН CpG). Среди них выделяют три типа: тип А, способный стимулировать дендритные клетки и макрофаги, а у человека эти ОДН стимулируют плазмацитоидные дендритные клетки, вызывая синтез ИФНа. ОДН CpG типа В вызывают стимуляцию В-клеток и макрофагов, но не индуцируют выработку ИФНа дендритными клетками человека. ОДН CpG типа С комбинируют свойства, присущие типам А и В [13,92].
CpG содержащие мотивы способны активировать широкий спектр клеток (В-лимфоциты, моноциты, NK-клетки, макрофаги, пДК) и вызывают продукцию ИЛ-12р70, что приводит к повышению экспрессии костимуляторных молекул CD80, CD86, CD 40, молекул МНС II класса. Известно, что ИЛ-12р70 является биоактивной формой ИЛ-12 и способен поляризовать иммунный ответ в сторону ТЫ [131]. Данные эффекты, вызываемые применением CpG, объясняют его использование в качестве адъюванта в вакцинах против инфекционных заболеваний и рака [83,84,151].
Влияние лигандов ТоИ-подобных рецепторов на выработкуИФН-а МНК периферической крови здоровых доноров
Активация TLR запускает сигнальный каскад, приводящий к активации NF-кВ, ЧТО, в свою очередь, приводит к синтезу ФНОа и других провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1, ИЛ-6 и др.[15,77]. ФНОа — один из основных эффекторных цитокинов, обеспечивающих развитие воспалительной реакции. Функциональную активность клеток, экспрессирующих TLR, оценивали по выработке ФНОа МНК периферической крови человека в ответ на лиганды TLR.
Для этого выделяли из периферической крови здоровых доноров МНК, культивировали их 24 часа в присутствии лигандов TLR. В качестве стимуляторов продукции ФНОа были выбраны пептидогликан, зимозан, ЛПС, флагеллин и CpG, действующие через TLR1/2, TLR2/6, TLR4, TLR5 и TLR9, соответственно. Мы остановили свой выбор на представленных лигандах, так как они являются ключевыми лигандами соответствующих TLR. ЛПС - это главный компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий, пептидогликан представляет собой основной компонент мембраны грамположительных бактерий, зимозан является компонентом клеточной стенки грибов, флагеллин входит в состав флагелл жгутиковых бактерий, а CpG характеризует ДНК микроорганизмов (бактерий и ДНК-содержащих вирусов), Р(1:С) является синтетическим аналогом вирусной двуцепочечной РНК. Таким образом, выбранные нами лиганды отражают практически весь спектр микроорганизмов, с которыми сталкивается организм хозяина. Мы использовали высокоспецифичные лиганды TLR, приобретенные у фирм изготовителей (см. Глава II). Для разработки метода мы выделяли МНК, а не использовали цельную кровь, так как растворимые ингибиторы TLR, цитокины, предсуществующие в плазме, могут негативно влиять на оценку функций клеток, экспрессирующих TLR.
При выборе времени инкубации МНК клеток для оценки их функциональной активности мы ориентировались на литературные данные. Многими авторами показано, что оценка уровня ФНОа после 24 часов инкубации является оптимальной и в супернатантах МНК содержится максимальное количество цитокина [45,58,99]. На рис. 13 показана зависимость концентрации ФНОа от времени инкубации.
Зависимость выработки различных цитокинов от времени инкубации клеток. Материал взят с сайта компании SuperArray Bioscience corporation. Оценивали спонтанную и стимулированную выработку ФНОа МНК периферической крови здоровых доноров. При анализе спонтанной выработки ФНОа МНК здоровых доноров нами были выявлены 2 группы: с нормальным и повышенным исходным уровнем секреции цитокина. Средняя спонтанная продукция ФНОа в I группе доноров составила 46,74±26,53 пг/мл, а во II группе - 261,86±111,08 пг/мл (рис. 14). Группа I включает 30 человек, группа II - 7 человек.
Гетерогенность исходного уровня продукции цитокина известна также по литературным данным [2,10,45,50]. Высокая спонтанная продукция ФНОа может быть связана с предстимуляцией in vivo, а также с физиологической гетерогенностью в группе здоровых доноров.
Для отработки метода оценки функциональной активности МНК периферической крови человека, экспрессирующих TLR, мы использовали следующие концентрации лигандов TLR: Пептидогликан: 1,0 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 5,0 мкг/мл (табл. 3 и рис. 15); Зимозан: 1,0мкг/мл, 10,0 мкг/мл, 100 мкг/мл (табл. 4 и рис.16); ЛПС: 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1,0 мкг/мл (табл. 5 и рис. 17); Флагеллин: 0,1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1,0 мкг/мл (табл. 5 и рис. 18); ОДН CpG: 1,0 мкг/мл и 10,0 мкг/мл (табл. 6 и рис. 19); Р(1:С): 5,0 мкг/мл, 10,0 мкг/мл, 20 мкг/мл, 40,0 мкг/мл (табл.8 и рис. 20).
При исследовании влияния различных лигандов TLR на продукцию ФНОа МІЖ принимали спонтанную выработку ФНОа за 1 и стимулирующее влияние различных лигандов на продукцию ФНОа оценивали, используя коэффициент стимуляции (КС). КС рассчитывали как отношение концентрации ФНОа в супернатантах стимулированных лигандами МНК к концентрации ФНОа в супернатантах нестимулированных МНК. Относительные единицы вводились для выявления прироста уровня цитокинов под действием лигандов по отношению к спонтанной выработке цитокинов, а также для повышения стандартизации метода.
Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхностимоноцитов периферической крови человека
Система TLR играет важную роль в активации врожденного и приобретенного иммунитета. Запуск сигнальных путей TLR приводит к выработке широкого спектра эффекторных молекул, вовлеченных в развитие воспалительного ответа на патогенные факторы, однако, неадекватная (чрезмерная или наоборот, недостаточная) активация TLR может приводить к негативным последствиям. В связи с нарастающим количеством патологий, в развитие которых вовлекаются TLR, необходимо разрабатывать надежные и воспроизводимые в клинической лаборатории методы оценки функционирования TLR.
Нами разработан подход к оценке функциональной активности мононуклеарных клеток периферической крови человека, экспрессирующих TLR, in vitro. Взаимодействие TLR с лигандами приводит к запуску MyD88-зависимых и МуБ88-независимых сигнальных путей, в результате активируя выработку провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-8 и др), хемокинов, а также ИФН I типа и продуктов ИФН-индуцибельных генов. В работе исследована выработка ФНОа и ИФН-а МНК в ответ на лиганды TLR у здоровых доноров. Мы определили оптимальные условия оценки цитокинсинтезирующей функции активированных лигандами TLR МНК периферической крови здоровых доноров и больных с иммунопатологией. Наиболее информативным является определение ФНОа в 24-х часовых супернатантах культур МНК периферической крови, стимулированных различными лигандами TLR. В качестве стимуляторов TLR мы использовали высокоспецифичные лиганды TLR: пептидогликан, зимозан, ЛПС, флагеллин, ОДН CpG и Р(1:С). ФНОа является одним из основных провоспалительных цитокинов, обеспечивающих развитие воспалительной реакции в организме. Выявлено, что все лиганды TLR стимулируют выработку ФНОа МНК периферической крови здоровых доноров, тогда как продукция ИФН-а активировалась только лигандами TLR3, TLR4 и TLR9.
Максимальным стимулирующим влиянием на продукцию ФНОа МНК периферической крови обладают лиганды TLR2 и TLR4.
Отмечены индивидуальные особенности выработки ФНОа, но не ИФН-а, в ответ на различные лиганды TLR. Индивидуальные различия продукции ФНОа среди здоровых доноров, возможно, определяются несколькими причинами: различной экспрессией TLR на мононуклерных клетках, полиморфизмом генов как TLR, так и ФНОа, исходным функциональным состоянием клеток, участвующих в синтезе ФНОа и других цитокинов.
Данный метод позволяет оценить состояние рецепторов врожденного иммунитета у человека. В работе впервые изучена опосредованная лигандами TLR цитокинсинтезирующая функция МНК больных ОВИН.
Молекулярно-генетические дефекты, локализуемые при ОВИН, касаются в основном адаптивного звена иммунной системы [86,132]. В последнее время появились публикации, сообщающие о дефектах врожденного иммунитета у больных ОВИН [16,25,]. В том числе обсуждаются нарушения в функционировании антигенпрезентирующих клеток (рис 40). Описываются дефекты созревания и дифференцировки дендритных клеток, нарушение экспрессии костимулирующих молекул CD80/86, CD83, CD40, различных активационных маркеров дендритных клеток, таких как HLA-DR, CD la, CD 11с [24,134], также у некоторых больных отмечается снижение содержания дендритных клеток (в особенности плазмацитоидных) в периферической крови по сравнению с здоровыми людьми [148,157]. Дендритные клетки больных ОВИН характеризуются сниженной выработкой ИЛ-12 в ответ на различные стимуляторы (ЛПС, CD40L и ФНОа) [21,24,25,40]. В ходе настоящего исследования выявлено снижение выработки ФНОа в ответ на лиганды TLR2 и TLR4. Полученные нами данные свидетельствуют о дефекте выработки ФНОа МНК периферической крови под влиянием лигандов TLR2 и TLR4 и сниженной плотности экспрессии этих рецепторов на моноцитах больных ОВИН и позволяют предположить, что выявляемые дефекты антигенпрезентирующих клеток у больных ОВИН, связаны с нарушениями в системе TLR. В нашем исследовании мы показали, что индуцированная лигандами TLR4 и TLR9 выработка ИФН-а МНК периферической крови больных ОВИН не нарушена. Полученные нами результаты свидетельствуют о наличии дисбаланса индуцированной ЛПС выработки ФНОа, ИЛ-12 и ИФН-а, который возможно обусловлен нарушением сигнальных путей, ведущих к активации транскрипционного фактора NF-KB.
Экспрессия TLR2, TLR4 и корецепторной молекулы CD 14 на поверхности моноцитов периферической крови больных ОВИН существенно ниже по сравнению с группой здоровых доноров. Вероятно, снижение плотности экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОВИН вносит свой вклад в развитие клинической картины, наблюдаемой у больных ОВИН. В литературе имеются противоречивые данные о выработке цитокинов в ответ на лиганды TLR и уровне экспрессии TLR на клетках иммунной системы больных с различными заболеваниями и наблюдается зависимость этого показателя от тяжести течения заболевания, например у больных хроническим гепатитом С и хронической гранулематозной болезнью [62,130]. В обследуемой нами группе больных ОВИН выявлено двое детей, у которых наряду с высокой спонтанной выработкой ФНОа полностью отсутствовала стимуляция выработки цитокина МНК периферической крови лигандами TLR и определялись низкие уровни экспрессии TLR2, TLR4 и CD 14 на поверхности моноцитов. Обнаруженные дефекты у этих больных ОВИН сочетались с тяжелым течением заболевания, развитием злокачественных новообразований и аутоиммунных осложнений. Полученные нами данные свидетельствуют о дефекте выработки ФНОа МНК периферической крови под влиянием лигандов TLR2 и TLR4 и сниженной плотности экспрессии этих рецепторов на моноцитах больных ОВИН и позволяют предположить, что выявляемые дефекты созревания и функционирования антигенпрезентирующих клеток у больных ОВИН, связаны с нарушениями различных компонентов системы TLR.
![Роль гистамина, рецепторов Н1, Н2, Н3/4-типа и оксида азота в регуляции синтеза IgE в норме и при поллинозе [Электронный ресурс]](/i/i/4282/212410.png "Роль гистамина, рецепторов Н1, Н2, Н3/4-типа и оксида азота в регуляции синтеза IgE в норме и при поллинозе [Электронный ресурс] Лесик Дина Владимировна")
