Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
Вирусный интерлейкин-6 и интерлейкин-6 человека в патогенезе неходжкинских лимфом и множественной миеломы 7
Глава 2. Материалы и методы исследования ..44
Глава 3. Разработка системы определения экспрессии мРНК генов hIL-6 и vIL-6 55
Глава 4. Последовательности генома HHV-8 и экспрессия мРНК vIL-6 и hIL-6 в клетках костного мозга больных множественной миеломой 58
Детальная характеристика костного мозга больных множественной миеломой 58
Последовательности генома HHV-8 в клетках костного мозга больных множественной миеломой 60
Экспрессия мРНК hIL-6 и vIL-6 в клетках костного мозга больных множественной миеломой 70
Взаимосвязь наличия последовательностей генома HHV-8 и экспрессии мРНК vIL-6 и hIL-6 в клетках костного мозга больных множественной миеломой с относительным содержанием различных клеточных типов в миелограмме 77
Секвенирование последовательностей кДНК \IL-6, обнаруженных в клетках костного мозга больных множественной миеломой 81
Резюме 86
Глава 5. Экспрессия мРНК hIL-6 и vIL-6 при неходжкинских лимфомах 87
Характеристика иммунофенотипа лимфом, включённых в исследование 87
Экспрессия вирусного интерлейкина-6 и интерлейкина-6 человека в клетках неходжкинских лимфом 96
Резюме 103
Глава 6. Первичная лимфома серозных полостей 104
Заключение 115
Выводы 121
- Вирусный интерлейкин-6 и интерлейкин-6 человека в патогенезе неходжкинских лимфом и множественной миеломы
- Последовательности генома HHV-8 в клетках костного мозга больных множественной миеломой
- Секвенирование последовательностей кДНК \IL-6, обнаруженных в клетках костного мозга больных множественной миеломой
- Экспрессия вирусного интерлейкина-6 и интерлейкина-6 человека в клетках неходжкинских лимфом
Введение к работе
Регуляторная роль интерлейкина-6 человека (hIL-б) в стимуляции роста опухолевых клеток и развитии их резистентности к химио- и гормонотерапии при множественной миеломе и неходжкинских лимфомах убедительно доказана. Установление этого факта послужило толчком к развитию нового направления фундаментальных научных исследований в области активации трансдуцерного рецептора gpl30 и опосредованной им передачи сигнала в нормальных и опухолевых клетках. Прикладным аспектом работы явилось обоснование возможности проведения антицитокиновой (анти-ЫЬ-б) терапии в лечении множественной миеломы с помощью моноклональных антител. В нашей стране такие исследования проведены в ГУ Российском онкологическом научном центре имени Н.Н.Блохина РАМН. Достигаемый положительный эффект был, как правило, транзиторным, что обусловлено сходством биологической активности шести цитокинов, передающих сигнал через молекулу gpl30. По этой причине в качестве перспективной мишени антицитокинотерапии рассматривается gpl30, проводится исследование активации рецептора при неходжкинских лимфомах.
Проблема осложняется тем, что открыт новый цитокин семейства интерлейкина-6, который способен воздействовать непосредственно на gpl30 и вызывать его гомодимеризацию на нормальных и опухолевых клетках. Это вирусный интерлейкин-6 - цитокин вирусного происхождения, закодированный в геноме герпесвируса человека 8 типа (HHV-8). Вирусный интерлейкин-6 имеет 24% гомологии по аминокислотному составу с интерлейкином-6 человека, способен действовать на клетки человека и воспроизводить практически те же самые эффекты, что и его гомолог человеческого происхождения.
HHV-8 является последним из открытых (1994 год) опухолеродных вирусов человека. Этиологическая роль этого вируса наиболее хорошо известна при саркоме Капоши и мультицентрической болезни Кастельмана.
Полную ассоциацию с данным вирусом имеет и крайне редкая нозологическая форма периферических крупноклеточных неходжкинских лимфом - первичная лимфома серозных полостей, описанная лишь в последние годы. Важную патогенетическую роль в стимуляции роста этих опухолей играет продуцируемый инфицированными клетками вирусный интерлейкин-6. Ассоциация с HHV-8 документирована не только для первичной лимфомы серозных полостей, но и для иных В-крупноклеточных лимфом, фолликулярных лимфом, мальтом, что не исключает патогенетической роли вирусного интерлейкина-6 в этих случаях.
Особую роль в установлении ассоциации HHV-8 с опухолями иммунной системы занимают исследования в области множественной миеломы. Несмотря на то, что первая работа, подтвердившая HHV-8-инфекцию клеток костного мозга у больных ММ, была опубликована 10 лет назад (Rettig et al, 1996) в журнале Science, полной ясности в данном вопросе нет до настоящего времени. Следовательно, остается неясной и роль вирусного интерлейкина-6 при множественной миеломе. А это очень важно как с точки зрения фундаментальных знаний, так и с точки зрения установления причин возможных неудач анти-ЫЬ-б терапии множественной миеломы.
С целью поиска ответов на эти вопросы нами в настоящей работе проведено исследование экспрессии интерлейкинов-6 человеческого и вирусного происхождения при различных вариантах периферических неходжкинских лимфом и лимфом из клеток-предшественников. Детальный молекулярный анализ опухолевых клеток в этих случаях проведен методами иммуногистохимии и проточной цитометрии. Экспрессия человеческого и вирусного интерлейкинов-6 при множественной миеломе и первичной лимфоме серозных полостей изучена с подтверждением наличия генов HHV-8 (К1, К2 и ORF26) в опухолевой ткани.
Целью настоящей работы явилось изучение экспрессии интерлейкина-6 человека (hIL-б) и его вирусного аналога (vIL-6) опухолевыми клетками при различных иммуноморфологических вариантах неходжкинских лимфом, а также при множественной миеломе.
Задачи исследования.
Изучить экспрессию мРНК интерлейкина-6 человека и вирусного интерлейкина-6 в клетках неходжкинских лимфом методом RT-PCR.
Изучить экспрессию мРНК интерлейкина-6 человека и вирусного интерлейкина-6 клетками костного мозга больных множественной миеломой.
Охарактеризовать иммунофенотип клеток неходжкинских лимфом, экспрессирующих интерлейкин-6 человека и вирусный интерлейкин-6.
Исследовать образцы костного мозга больных множественной миеломой на предмет наличия в них ДНК HHV-8 по 3 генам-мишеням: K1,K2hORF26.
Изучить нуклеотидные последовательности гена вирусного интерлейкина-6 в случаях его экспрессии при множественной миеломе.
Охарактеризовать цитологически клетки костного мозга больных множественной миеломой при экспрессии интерлейкина-6 человека и вирусного интерлейкина-6.
Научная новизна. В результате проведенных исследований установлен ряд новых научных фактов. Главным из них является установление экспрессии вирусного интерлейкина-6 клетками костного мозга больных множественной миеломой в 20% случаев. Впервые показано, что в части случаев экспрессии вирусного интерлейкина-6 при множественной миеломе структурные гены HHV-8 в клетках костного мозга отсутствуют. Выявлены случайная нуклеотидная замена и 2 типа повторяющихся нуклеотидных замен в последовательностях вирусного интерлейкина-6, выделенном из клеток
костного мозга больных множественной миеломой. Одна из этих замен приводит к изменению аминокислотного состава вирокина - замене аспарагиновои кислоты на аспарагин в положении 192, что потенциально может сказаться на особенностях третичной структуры и биологической активности вирусного интерлейкина-6 при множественной миеломе. Установлено, что вирусный интерлейкин-6 в 30% случаев его обнаружения экспрессируется опухолевой тканью НХЛ и ММ при отсутствии экспрессии человеческого гомолога. Впервые обнаружена экспрессия вирусного интерлейкина-6 при лимфомах из Т-клеток-предшественников. Напротив, патогенетическая роль вирусного интерлейкина-6 при периферических В-клеточных лимфомах, исходя из результатов наших исследований, представляется маловероятной, так как он обнаружен лишь в 3% случаев (1 из 33, фолликулярная лимфома). Подтверждены экспрессия вирусного интерлейкина-6 и наличие генома HHV-8 в клетках первичной лимфомы серозных полостей в первом описанном в России ВИЧ-негативном случае.
Практическая значимость. Практическая значимость работы складывается из 2 аспектов: диагностического и в перспективе иммунотерапевтического. Диагностический аспект заключается в разработке и внедрении в клиническую практику молекулярной диагностики периферичеких В-клеточных неходжкинских лимфом (в первую очередь, первичной лимфомы серозных полостей) и лимфом из Т-клеточных предшественников, основанной на установлении экспрессии опухолевой тканью вирусного интерлейкина 6. Вирусный интерлейкин-6 имеет уникальные антигенные детерминанты, что делает его потенциальной мишенью иммунотерапии в случаях экспрессии вирокина при множественной миеломе и неходжкинских лимфомах. При наличии генов HHV-8: К1 и ORF-26 в случаях множественной миеломы и первичной лимфомы серозных полостей, кодируемые ими белки также могут явиться потенциальной мишенью иммунотерапии.
Вирусный интерлейкин-6 и интерлейкин-6 человека в патогенезе неходжкинских лимфом и множественной миеломы
Интерлейкины воздействуют на клетки-мишени посредством специфических рецепторов, расположенных на мембране этих клеток. Рецептор интерлейкина-6 состоит из двух цепей: а-цепь - gp80 (IL-6R) и (3-цепь - gpl30. Рецептор gpl30 осуществляет трансдукцию сигнала еще 5 цитокинов, которые образуют вместе с hIL-б семейство gpl30. В него входят: hIL-6, IL-11, онкостатин М (ОМ), лейкоз-ингибирующий фактор (LIF), цилиарный нейротрофный фактор (CNTF) и кардиотрофин-1. IL-11 имеет очень схожий с hIL-6 спектр мишеней и действует на них похожим образом: запускает реакции острой фазы, индуцирует дифференцировку мегакариоцитов и поддерживает рост плазмоцитом. Цилиарный нейротрофный фактор поддерживает рост отростчатых и моторных нейронов, а также индуцирует дифференцировку олигодендроцитов в астроциты. Экспрессируется CNTF в основном в нервной ткани. Показано, что внеклеточная часть рецептора CNTF гомологична IL-6R. Кардиотрофин-1 способен индуцировать гипертрофию кардиомиоцитов [Kishimoto et al., 1995]. По аминокислотной последовательности цитокины семейства gpl30 имеют около 20% общей гомологии.
Строение gpl30 gpl30 принадлежит к семейству рецепторов цитокинов I типа -рецепторам гемопоэтинов. Он состоит из внутри- и внеклеточной частей. Внеклеточная часть молекулы состоит из 6 доменов. N-терминальный участок представлен иммуноглобулино-подобным доменом, за ним следуют 5 фибронектиновых доменов III типа. Два первых фибронектиновых домена (они несут обозначения D1 и D2) образуют типичный для цитокиновых рецепторов этого семейства цитокин-связывающий участок. Была проведена рентгенографическая кристаллография данного района с разрешением 2А. Она показала, что каждый домен состоит из бета-слоя, который сформирован из трех- (А, В, Е) и четырех-тяжевых (С, С, F, G) частей. Домены D1 и D2 связаны короткой 3 спиралью и ориентированы так, что вся молекула имеет форму латинской L, угол между ними составляет приблизительно 78.
При сравнении аминокислотных последовательностей gpl30 разных видов (а именно, мыши, крысы и шпорцевой лягушки) была обнаружена 36% гомология. При этом 64% гомологичных аминокислотных остатков расположены во внутренней области доменов, и, следовательно, именно они определяют общую форму и структуру молекулы. D1 содержит два дисульфидных мостика: между цепями А-В и С -Е, которые консервативны в структурах рецепторов цитокинов I типа. Особенностью домена D1 является низкая гомология в расположении атомов в сравнении с доменами того же семейства. Домен D2 более похож на другие фибронектиновые домены, так как он не содержит дисульфидных связей. Свободный цистеин упакован внутри объемной структуры. Имеется WSXWS-мотив в СООН-терминальной области. Исходя из структуры цитокин-связывающего участка и соединяющей домены спирали маловероятно, что при связывании лиганда происходит сильное изменение взаимной ориентации частей молекулы. Вероятно, аффинность взаимодействия gpl30 с различными цитокинами обеспечивается дополнительными рецепторными молекулами. Три оставшихся ближайших к мембране домена (D3, D4, D5) являются типичными фибронектиновыми доменами III типа [Bravo et al., 1998].
Экспрессируется в норме во всех органах, включая мозг, сердце, печень, плаценту, легкие, селезенку и почки, а также обнаружены достаточно высокие уровни экспрессии этой молекулы в тканях зародышей. Эмбрионы мышей, у которых ген gpl30 был нокаутирован в обеих аллелях, умирали на 12-18 дни после зачатия. Путем гистологических исследований было показано, что смерть наступает в результате недоразвития сердечной мышцы - стенки желудочков становятся очень тонкими, достигая минимальной толщины в один слой клеток. Кроме того, у зародышей резко нарушается гемопоэз - уменьшается количество мононуклеаров и колониеобразующих единиц. Также в угнетенном состоянии оказывается эритроидный и гранулоцитарно-макрофагальный ростки гемопоэза. Таким образом, gpl30 необходим для нормального созревания кардиомиоцитов и кроветворной системы в эмбриогенезе [Yoshida et al., 1996].
Строение gp80 IL-6R, как и gpl30, принадлежит к семейству цитокиновых рецепторов I типа. кДНК IL-6R кодирует 468 аминокислот, из которых 19 составляют сигнальный пептид, 339 - внеклеточную часть, 28 - трансмембранную и оставшиеся 82 - короткую цитоплазматическую часть. Зрелая форма с молекулярной массой 80 кДа образуется из предшественника массой 50 к Да путем N-гликозилирования по трем сайтам. Кроме того, в молекуле присутствуют 4 дисульфидных связи [Cole et al., 1999]. N-терминальный участок IL-6R представляет собой иммуноглобулин-подобный домен. Однако он не участвует в связывании hIL-б и gpl30, и его делеция не нарушает межмолекулярные взаимодействия. Оставшийся внеклеточный участок разделен на два фибронектиновых домена III типа, каждый из которых состоит из приблизительно 100 аминокислот, составляющих 7 0-тяжей, расположенных антипараллельно и формирующих бочкообразную структуру. В дистальном фибронектиновом домене расположены 4 консервативных цистеиновых остатка, а в ближнем к мембране - мотив триптофан-серин-Х-триптофан-серин (WSXWS). Таким образом, эти два домена формируют цитокин-связывающий модуль, который является характерной особенностью рецепторов этого семейства. IL-6R содержит также трансмембранный и цитоплазматический домены. Последний не способен передавать сигнал внутрь клетки и состоит всего из 82 остатков [Kishimoto et al., 1995]. Показано, что без цитоплазматического домена данный рецептор способен к нормальному взаимодействию с hIL-б и gpl30 [Tagaetal., 1989].
Последовательности генома HHV-8 в клетках костного мозга больных множественной миеломой
Тот факт, что hIL-6 принимает непосредственное участие в пролиферации опухолевых клеток был выяснен в серии опытов, поставленных Kawano [Kawano М. et al., 1988]. У пациентов, больных множественной миеломой были взяты клетки костного мозга, которые несколько дней культивировали in vitro. В культуре клеток наблюдалась спонтанная пролиферация миеломных клеток, которая практически полностью ингибировалась при добавлении anti-hIL-б моноклональных антител. Это явилось чётким подтверждением того, что hIL-6 является основным ростовым фактором клеток миеломы in vitro.
Klein В. описал результаты лечения с использованием высокоаффинных мышиных МКА к hIL-6 ВЕ8 10 больных с терминальной стадией ММ, не поддающейся лечению стандартными методами противоопухолевой терапии [Klein В., 1991]. Из 10 больных у 6 был плазмобластный лейкоз. МКА к hIL-6 вводили внутривенно 9 больным, и в одном случае больной с опухолевым плевритом получал лечение внутриплеврально. Результаты анти-ЫЬ-6 терапии оказались обнадеживающими. Было показано, что МКА способны блокировать активность hIL-6 и пролиферацию злокачественных клеток. В одном случае отмечена регрессия опухоли на 30%. Снижение продукции hIL-6 сопровождалось снижением уровня С-реактивного белка (CRP) в плазме крови. Клиническое состояние этих больных улучшилось, нормализовалась температура, прошла слабость. Основными осложнениями анти-ЫЬ-б терапии явились тромбоцитопения, которая не представляла угрозы для жизни и лейкопения [Klein В., 1991; Bataille R., 1995].
В настоящее время произошло существенное смещение акцентов в анти-ЫЬ-б терапии при ММ [Вотякова с соавт., 2001]. Данное лечение применяется в процессе аутологичной трансплантации стволовых клеток до и после высокодозной химиотерапии. Основанием к использованию МКА являются следующие факты. Во-первых, известно, что ЫЬ-6 ингибирует как спонтанный апоптоз миеломных клеток, так и апоптоз, индуцированный дексаметазоном и химиопрепаратами [Chauhan D., Kharbanda S., 1997; Chauhan D., Pandey P., 1997]. Гиперпродукция hIL-6, наблюдаемая in vivo у больных MM вероятно является одним из механизмов химиорезистентности этой опухоли к химиопрепаратам, включая алкилирующие агенты и дексаметазон. В этих условиях логично надеяться, что нейтрализация hIL-6, который вырабатывается в больших количествах костномозговым окружением, до начала химиотерапии восстановит способность миеломных клеток к апоптозу, индуцированному дексаметазоном и химиопрепаратами. Во-вторых, в период восстановления гемопоэза после высокодозной химиотерапии также происходит выраженная продукция hIL-б, о чем свидетельствует высокий уровень СРБ в этот период. Предполагают, что высокая продукция hIL-6 после высокодозной терапии стимулирует миеломные клетки к более быстрому формированию рецидива, а нейтрализация hIL-6 может препятствовать его развитию [Klein В., 1998].
Moreau Р. с соавт. применяли анти-ЫЬ-6 МКА у 15 больных ММ в сочетании с высокими дозами дексаметазона и высокодозной химиотерапией (мелфалан 220 мг/м) с последующей аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК). Введение анти-ЫЬ-б МКА не вызывало никаких побочных эффектов. Сочетание анти-ЫЬ-б МКА с дексаметазоном не ухудшало переносимости высокодозной химиотерапии. Ингибирование активности ЫЬ-6 отмечалось у всех больных, о чем свидетельствовало снижение уровня СРБ. Лечение оказалось эффективным у 12 из 15 больных, у 5 из которых получена полная ремиссия [Moreau Р., 1998].
Вопрос о том, является ЫЬ-6 аутокринным или паракринным ростовым фактором для клеток миеломы по-прежнему остаётся дискуссионным. Но всё же большая часть авторов склоняется к паракринной гипотезе [Klein В, 1995; Bisping G, 2003], в пользу которой говорят следующие факты. Во-первых, мРНК ЫЬ-6 экспрессируются в значительных количествах клетками костного мозга у большинства пациентов с миеломой, в частности моноцитами и миелоидными клетками, и не экспрессируются в очищенных клетках миеломы [Portier М, 1991]. Во-вторых, стромальные клетки костного мозга пациентов с множественной миеломой продуцируют большие количества hIL-б, чем стромальные клетки (после индукции клетками миеломы) здоровых индивидов [Uchiyama Н, 1993]. По аналогии с моделью мышиных плазмоцитом Uchiyama et al [Uchiyama H, 1993] предположили, что клетки миеломы человека продуцируют цитокины или экспрессируют молекулы клеточной адгезии, активируя таким образом клетки костного мозга на продукцию hIL-б. Одним из таких цитокинов является IL-ip. Было показано, что клеточные популяции, богатые миеломными клетками, продуцируют IL-ip, и антитела к IL-1 или IL-1R блокируют продукцию hIL-6 клетками костного мозга больных множественной миеломой [Klein, 1998]. Тем не менее есть данные и об аутокринной регуляции клеток миеломы интерлейкином-6 [Frassanito М.А, 2001]. Вполне возможно, что при миеломе имеет место как паракринная, так и аутокринная регуляция с использованием hIL-6.
Интересно, что IL-6R помимо мембранно-связанной синтезируется и в растворимой форме (sIL-6R). Причём комплекс SIL-6R/IL-6 тоже может активировать молекулу gpl30, вызывая его димеризацию на мембране и, следовательно, активируя каскады передачи сигнала. Вероятно, что sIL-6R играет определённую роль и в процессе опухолевого роста. Так, в крови больных множественной миеломой был обнаружен повышенный уровень sIL-6R по сравнению со здоровыми людьми того же возраста (200 и 80 нг/мл, соответственно) [Gaillard JP, 1993]. Также было определено, что уровень sIL-6R играет прогностическую роль, так как пациенты с высоким уровнем этого белка имели плохой прогноз на дальнейшее течение заболевания [Greipp PR, 1993]. Надо заметить, что роль gpl30 в развитии множественной миеломы не ограничивается связыванием hIL-6flL-6R комплекса. Было показано, что и другие цитокины IL-6-типа - CNTF, IL-11, LIF и OSM - оказывают влияние на рост клеток миеломы [Klein В, 1995]. В связывании этих факторов также принимает участие gpl30.
Подводя итог, можно сказать, что hIL-6, IL-6R и gpl30 являются ключевыми факторами в развитии множественной миеломы. Говоря о терапевтических средствах лечения множественной миеломы, надо заметить, что почти все они направлены на нейтрализацию либо самого hIL-б, либо его рецепторов [Тупицын Н. с соавт., 2002]. Так, определённое клиническое значение имело лечение больных с помощью моноклональных антител к hlL-6. Было также показано, что рекомбинантный gpl30 в растворимой форме (sgpl30) может связывать комплекс sIL-6R/IL-6, не давая ему активировать мембранно-связанный gpl30 [Klein В, 1995].
Секвенирование последовательностей кДНК \IL-6, обнаруженных в клетках костного мозга больных множественной миеломой
Были обнаружены следующие нуклеотидные замены в кодонах vIL-6: 1. Замена аденина на цитозин в положении 119 (40 аминокислота, 2 положение кодона) у больной З.И., приводящая к замене аспарагина на треонин. 2. Замена тимина на цитозин в положении 306 (102 аминокислота, 3 положение кодона) у больных Н.А.2, М.Е., З.И., В.П. и Г.А., не приводящая к замене фенилаланина. 3. Замена гуанина на аденин в положении 574 (192 аминокислота, 1 положение кодона) у больных Н.А.2, М.Е., З.И., В.П. и Г.А., приводящая к замене аспарагиновои кислоты на аспарагин. Данные свидетельствуют о том, что ряд замен, по-видимому, носит не случайный характер. В частности, в нуклеотидных последовательностях 5 пациентов найдены идентичные замены. При этом замещение тимина на цитозин в положении 306 не ведет к изменению аминокислотного состава белка, а замена гуанина на аденин в положении 574 приводит к замене аспарагиновои кислоты на аспарагин, что, в свою очередь, приводит к замещению отрицательно заряженной аминокислоты на незаряженную полярную группу в данном участке полипептида. При этом данный аминокислотный остаток находится довольно далеко от сайтов взаимодействия vIL-6 с gpl30 и IL6R, следовательно, скорее всего, не влияет на функциональную активность вирокина. Вполне возможно, что повторяемость этих аминокислотных замен у нескольких больных объясняется генетическими особенностями штаммов HHV-8, циркулирующих в России.
Нами также была обнаружена уникальная замена в положении 119 нуклеотидной последовательности вирусного интерлейкина-6 у больной З.И., приводящая к замене аспарагина на треонин в 40 положении белка. Интересно, что этот аминокислотный остаток, не участвующий непосредственно во взаимодействии с рецепторными белками, расположен в -спирали вирусного интерлейкина-6 между двумя аминокислотами, взаимодействующими с IL6R (сайт I vIL-б) и gpl30 (сайт II vIL-б). Это лейцин-39 (сайт I) и триптофан-41 (сайт II). Но, скорее всего, эта замена всё же не ведёт к какому-либо изменению функциональной активности вирусного интерлейкина-6, так как незаряженная неполярная аминокислота заменяется опять же на незаряженную полярную и, следовательно, это не должно сказываться на окружении данного аминокислотного остатка.
РЕЗЮМЕ Исследование генома HHV-8 и продукции интерлейкина 6 человеческого и вирусного происхождения клетками костного мозга проведено у 38 больных множественной миеломой. Костный мозг во всех случаях характеризовался как присутствием выраженного опухолевого субстрата, так и наличием (в редуцированном виде) всех остаточных ростков гемопоэза. Присутствие полноценного генома (насколько можно судить по наличию двух структурных генов и гена vIL-б) в клетках костного мозга является нечастым событием (примерно 10% случаев) и наблюдается лишь при отсутствии плазмобластов в костном мозге. Иная ситуация наблюдается в отношении гена vIL-б и продукции вирокина, что отмечено примерно в 20% случаев. Эти данные предполагают возможность присутствия лишь части генома HHV-8 в клетках костного мозга больных. Отмечена ассоциация отсутствия продукции hIL-б с относительной лимфопенией в костном мозге пациентов. Анализ нуклеотидных последовательностей гена вирусного интерлейкина-6 позволил установить ряд неслучайных замен, в основном, не связанных с функциональными сайтами цитокина. Являются ли эти замены специфичными для множественной миеломы или отражают особенности штаммов вируса в России предстоит оценить в дальнейшем.
Экспрессия мРНК hIL-б и vIL-б при неходжкинских лимфомах. Характеристика иммунофенотипа лимфом, включённых в исследование. В наше исследование в общей сложности было включено 35 образцов опухолевой ткани (в основном биопсийный материал) больных различными вариантами неходжкинских лимфом. Всего таких вариантов было диагносцировано 9, не считая первичной лимфомы серозных полостей, исследование по которой в силу уникальности данной нозологии было выделено в отдельную главу. Изучено было: 12 фолликулярных лимфом (см. табл. 5-1), 10 диффузных В-крупноклеточных лимфом (см. табл. 5-2), 4 Ki-1 крупноклеточных анапластических лимфомы (см. табл. 5-3), 3 лимфомы из Т-предшественников (см. табл. 5-4), 2 лимфомы Бёркитта (см. табл. 5-5), 1 первичная медиастинальная В-крупноклеточная лимфома, 1 лимфома из малых лимфоцитов (хронический лимфолейкоз), 1 периферическая Т-клеточная лимфома и 1 лимфома маргинальной зоны селезёнки (все - см. табл. 5-6). Клинический материал в большинстве случаев был представлен биопсией лимфоузла, за исключением больных: ИАК (клетки перикардиальной полости), ЮАВ (бласты крови) и ПНГ (биопсия средостения). Как видно из таблиц 5-1 - 5-6 использованные в иммуногистохимии панели антител несколько отличались друг от друга. Стандартно во всех случаях использовали антитела к маркёрам CD3, CD5, CD7 (Т-клеточные маркёры), CD 10 (С ALL А - общий антиген острого лимфобластного лейкоза), CD 19, CD20 (В-клеточные маркёры), CD38 (НАД-рибозил циклаза, активационный антиген), CD45 (общий лейкоцитарный антиген) и HLA-DR (часть HLA II комплекса). Для верификации диагноза использовали дополнительные маркёры, такие как: CDla, CD2, CD4, CD8, CD13, CD15, CD21, CD23, CD27, CD30, CD33, CD34, CD35, CD56, CD61, CD64, CD138, Ki-67, bcl2, PCNA, IgM, IgG, IgA, лёгкие цепи иммуноглобулинов к и X.
Экспрессия вирусного интерлейкина-6 и интерлейкина-6 человека в клетках неходжкинских лимфом
Целью данной диссертационной работы являлось исследование экспрессии двух белков - интерлейкина-6 человека и гомологичного ему вирусного интерлейкина-6 - при различных иммуноморфологических вариантах неходжкинских лимфом и множественной миеломе. С научной точки зрения, эти исследования в первую очередь были интересны потому, что в России подобных работ до сих пор не проводилось.
Множественная миелома представляет собой одно из самых распространённых онкогематологических заболеваний в мире. Ежегодно регистрируется 30 новых случаев на 1 миллион населения, а среди 80-летних заболеваемость составляет 37 человек на 100000 населения в год. Множественная миелома составляет 1% от всех онкологических заболеваний и немногим более 10% среди всех гемобластозов. При этом этиология данного заболевания до сих пор остаётся не ясной. Работа Rettig et al в журнале Science [Rettig, 1997] пробудила интерес к исследованиям возможного участия вируса герпеса человека 8 типа (HHV-8) в развитии этого заболевания. Не останавливаясь подробно на всех исследованиях, посвященных этому вопросу и детально описанных в литературном обзоре, необходимо заметить, что результаты этих работ были крайне противоречивы.
Нами была поставлена задача исследовать экспрессию вирусного интерлейкина-6 (vIL-б) на уровне мРНК в образцах костного мозга больных множественной миеломой. Этот вирусный белок представляется наиболее вероятным кандидатом на роль основного фактора прогрессии ММ в случае ассоциации заболевания с HHV-8. Это объясняется, в первую очередь, тем, что vIL-б является гомологом интерлейкина-6 человека и практически идентичен ему по проявляемым биологическим активностям. А интерлейкин-6 человека, в свою очередь, является главным ростовым фактором при ММ. Именно это предопределило выбор vIL-б, как гена-мишени при исследованиях роли HHV-8 в развитии ММ. Также в задачу нашего исследования входило сравнение экспрессии вирусного интерлейкина-6 с экспрессией интерлейкина-6 человека при множественной миеломе.
Всего было исследовано 38 образцов костного мозга больных множественной миеломой. Исследование проводилось методом ПНР с обратной транскрипцией. Для этой работы нами были подобраны пары праймеров к vIL-б и hIL-б, которые были протестированы на клеточных линиях ВС-3 и BCBL-1, несущих геном HHV-8, с целью исключить возможность ложноположительных результатов. Из 38 образцов костного мозга в 7 была обнаружена экспрессия мРНК vIL-б, что составило 18,4% от общего числа больных ММ. Экспрессия мРНК интерлейкина-6 человека была обнаружена в 32 из 38 случаев, что составило 84,2%. При сравнении результатов экспрессии мРНК этих двух белков выяснилось, что в большинстве случаев экспрессии мРНК vIL-б, в тех же образцах костного мозга наблюдается и экспрессия мРНК hIL-б. Единственным исключением стала больная З.И., у которой наблюдается экспрессия мРНК только вирусного интерлейкина-6. Это позволило предположить, что активность vIL-б скорее всего не является уникальной и жизненно необходимой для поддержания роста опухоли.
С целью подтвердить наличие геномов HHV-8 в костном мозге больных множественной миеломой мы также поставили ПЦР на выявление в клетках ДНК 3 генов-мишеней: К2 (ген, кодирующий vIL-6), ORF26 (ген большого капсидного белка вируса) и К1 (ген, кодирующий трансмембранный белок, предполагаемо участвующий в трансформации клеток). Гены-мишени были подобраны таким образом, чтобы расстояния между ними в вирусном геноме были достаточно большими и, следовательно, можно было с большей вероятностью оценить наличие в клетке полноценных геномов HHV-8. Также известно, что все 3 гена необходимы для продуктивной репликации вируса. Результаты наших исследований оказались довольно интересными. Из 7 образцов костного мозга больных ММ с экспрессией vIL-б наличие всех 3 генов-мишеней наблюдалось только в 2 случаях (больные В.А.2 и В.Б.). Ещё в одном случае (больная Н.В.) были обнаружены 2 гена - vIL-б и ORF26. Наконец, в остальных 4 случаях был найден только ген вирусного интерлейкина-6. Помимо этого, был обнаружен больной (Н.В.) с наличием всех 3 генов-мишеней, но без экспрессии мРНК vIL-6.
Данные этих исследований заставляют предположить, что полноценные геномы HHV-8 присутствуют в клетках 3 больных множественной миеломой. В случае остальных пяти больных можно говорить либо о встраивании части генома HHV-8 в геном клетки-хозяина, что до сих пор не было описано в литературе, либо о наличии в клетке дефектных эписом вируса, что более вероятно. При этом вопрос об участии HHV-8 в этиологии множественной миеломы остаётся открытым. Несомненно, что генетический материал этого вируса в клетках больных ММ встречается с большей частотой, чем в здоровой популяции или в других онкологических заболеваниях (за исключением, разумеется, трёх 100%-ассоциированных с HHV-8 патологий - саркомы Капоши, первичной лимфомы серозных полостей и мультицентрической болезни Кастельмана). Но является ли вирус пусковым механизмом трансформации клеток, участвует ли в поддержании трансформированного состояния клеток, либо является вирусом-сателлитом - это остаётся неясным. С другой стороны, наличие гена вирусного интерлейкина-6 и экспрессия мРНК vIL-6 в клетках определённой части больных множественной миеломой позволяет говорить о vIL-6, как о возможной мишени противоопухолевой терапии. С этой точки зрения vIL-б является отличным опухолеассоциированным антигеном, специфичным только для трансформированных клеток.
