Введение к работе
Актуальность проблемы
Мобильные генетические элементы широко представлены в геномах эукариотических организмов. Среди них особое место занимают ретротранспозоны с длинными концевыми повторами, которые в значительной степени сходны с ретровирусами позвоночных: имеют сходную структуру и жизненный цикл. К таким ретротранспозонам относятся ретротранспозоны группы gypsy дрозофилы (Bowen, McDonald, 2001). Они могут содержать все три открытые рамки считывания — gag, рої, env, характерные для ретровирусов, однако рамка env может и отсутствовать. Известно, что gypsy является инфекционным ретровирусом у дрозофилы, первым ретровирусом, обнаруженным у беспозвоночных (Kim et al, 1994). Показано, что у ретротранспозонов gypsy и ZAM рамка считывания env функциональна, и они образуют вирусные частицы, подобные вирионам ретровирусов, что позволяет считать gypsy и ТАМ настоящими ретровирусами (Song et al., 1994; Teysset et al., 1998; Leblanc et al., 2000). С другой стороны, ретровирус может стать мобильным генетическим элементом при интеграции в геном клеток зародышевой линии хозяина. Также существуют ретровирусы (SSV, Ha-MSV, Mo-MSV), которые потеряли часть генов и, подобно многим ретротранспозонам неспособны формировать вирусные частицы и даже самостоятельно реплицироваться. Такие вирусы распространяются при совместной инфекции с близкородственными ретровирусами (Coffin et al., 1997). Таким образом, между ДКП-ретротранспозонами и ретровирусами четкой границы не существует.
Копии ретроэлементов (ретротранспозонов и ретровирусов), интегрированные в геном, со временем деградируют, однако отдельные гены или их фрагменты могут быть адаптированы на пользу организма-хозяина, то есть могут подвергаться процессу молекулярной доместикации. Так, у млекопитающих в результате молекулярной доместикации гена env появился ген syncytin, участвующий в формировании плаценты, а в результате нескольких случаев доместикации гена gag появились гены, принадлежащие семействам Fv и Mart {Mar), участвующие в ограничении ретровирусной инфекции (Stoye, 1998; Brandt et al, 2005). У дрозофилы также обнаружены гены, гомологичные генам ретротранспозонов: Iris - гомолог гена
env (Malik, Henikoff, 2005) и Grp, идентифицированный в нашей лаборатории, -гомолог гена gag (Нефёдова, Ким, 2009).
Ген Grp присутствует во всех секвенированных геномах семейства Drosophilidae. Это означает, что его доместикация произошла до наступления видовой радиации в семействе, то есть 40-50 млн лет назад. Ранее в нашей лаборатории было показано, что Grp в значительной степени консервативен, это говорит о том, что он поддерживается стабилизирующим отбором и выполняет определенные функции в организме D. melanogaster (Нефёдова, Ким, 2009).
Доместицированные гены выполняют широкий спектр функций в организме хозяина, и их изучение представляет значительный интерес. Многие из них тесно связаны с процессами эмбрионального развития и выполняют разнообразные функции, начиная с участия в сигнальных путях и регуляции родительского геномного импритинга и заканчивая участием в формировании синцития в трофобласте (Volff 2006; Volff 2009).
Цели и задачи исследования
Цель: Изучить структуру и возможные функции гена Grp, исследовать структуру его белкового продукта и ткане специфичность экспрессии этого гена на уровне транскрипции и трансляции в онтогенезе у D.melanogaster.
В работе были поставлены следующие задачи:
Исследовать транскрипцию гена Grp на разных стадиях индивидуального развития D. melanogaster.
Исследовать экспрессию гена Grp на уровне транскрипции в разных органах и тканях!), melanogaster.
Клонировать ген Grp, экспрессировать его в условиях in vitro и выделить рекомбинантный белок.
Провести исследование структуры белка Grp физико-химическими и биоинформатическими методами.
Получить препараты антител (антисыворотки) к рекомбинантному белку Grp.
Изучить распределение белка Grp в разных органах и тканях D. melanogaster.
7. Исследовать экспрессию гена Grp на уровне трансляции на разных стадиях онтогенеза у D. melanogaster.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые осуществлено клонирование и исследование экспрессии гена Grp, гомолога гена gag ретротранспозонов. Показано, что ген Grp у D.melanogaster экспрессируется исключительно на стадии имаго, причем его экспрессия имеет ткане специфичный характер.
Впервые получен рекомбинантный белок, соответствующий белковому продукту гена Grp, получены данные о его вторичной структуре, совпавшие с предсказанием вторичной структуры, полученным с помощью биоинформатических методов.
Впервые белковый продукт гена Grp был обнаружен в условиях in vivo, исследована его экспрессия на разных стадиях развития и в разных тканях у D.melanogaster.
Полученные данные могут быть использованы в дальнейшем для исследования вопросов, связанных с молекулярной доместикацией и ролью ретроэлементов в эволюции, а также для изучения функций доместипированного гена Grp и связи их с онтогенезом D.melanogaster.
Личное участие автора. Работа выполнена непосредственно автором. Поставленные задачи решены с применением современных методов генетики, эмбриологии, иммунологии. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.
Апробация работы. Работа прошла апробацию на Всероссийской конференции посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М.Акмуллы (Уфа, 2009), Международной конференции «Спорт: медицина, генетика, физиология, биохимия, педагогика, психология» (Уфа, 2011), XVII и XVIII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010» и «Ломоносов-2011» (Москва), семинарах лаборатории генетики животных и заседаниях кафедры генетики
биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 2, тезисов докладов и материалов конференций - 4.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 101 странице, содержит 25 рисунков, 1 таблицу и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 83 цитируемых источника.
