Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Регенерация 10
1.2. Регенерация у иглокожих 11
1.3. Регенерация у eupentacta fraudatrix 16
1.4. Молекулярные механизмы регенерации 21
1.5. Гены семейства wnt 23
1.6. Структура белков wnt 25
1.7. Типы сигнального пути wnt 26
1.8. Функции wnt 31
1.9. Молекулярные механизмы регенерации у иглокожих 33
1.10. Роль WNT в регенерации у иглокожих 35
2. Материалы и методы 39
2.1. Сбор материала 39
2.2. Иммуноцитохимия 39
2.3. Анализ транскриптомов 40
2.4. Быстрая амплификация концов к ДНК 41
2.5. Электрофорез днк 43
2.6. Цитирование и трансформирование 43
2.7. Секвенальная реакция 44
2.8. Филогения 45
2.9. Локализация экспрессии 45
2.10. ПНР в реальном времени 46
3. Результаты 48
3.1. Распределение белка wnt5 в тканях е. fraudatrix в норме 48
3.2. Распределение белка wnt5 в тканях е. fraudatrixb процессе регенерации после эвисцерации 50
3.3. Биоинформационный анализ транскриптов генов сигнального пути wnt, имеющихся в транскриптомах регенерирующих органове. fraudatrix 57
3.4. Экспрессия гена wnta в норме регенерации е. fraudatrix 61
3.5. Экспрессия гена wnt4 в норме и регенерации е. fraudatrix 66
3.6. Экспрессия гена wnt6 в норме и регенерации е. fraudatrix 71
3.7. Экспрессия гена wnti 6 в норме и регенерации е. fra udatrix 76
4. Обсуждение
4.1. Гены семейства wnt 81
4.2. Роль гена wnt4 при регенерации е. fraudatrix 85
4.3. Роль гена wnt6при регенеращме. fraudatrix 87
4.4. Роль гена wnta при регенерации е. fraudatrix 88
4.5. Роль гена wntl 6 птрегенеращм е. fraudatrix 89
4.6. Роль wnt5 при регенерации у е. fraudatrix 90
4.7. Роль других генов сигнального пути wnt при регенерации у е. fraudatrix 91
Заключение 94
Выводы 99
Список литературы
- Регенерация у eupentacta fraudatrix
- Быстрая амплификация концов к ДНК
- Распределение белка wnt5 в тканях е. fraudatrixb процессе регенерации после эвисцерации
- Роль гена wnt6при регенеращме. fraudatrix
Регенерация у eupentacta fraudatrix
Тип Echinodermata включает в себя 5 классов: Crinoidea (морские лилии), Asteroidea (морские звезды), Ophiuroidea (офиуры), Echinoidea (морские ежи) и Holothuroidea (голотурии). В каждом классе способность к регенерации выражена в разной степени (Долматов, 1999).
Морские лилии - одна из немногих групп животных, у которой наличие регенерации установлено еще для палеозойских представителей. Палеонтологические данные свидетельствуют, что морские лилии уже в начале палеозоя обладали способностью к регенерации (Clark, Rowe, 1971). Современные виды также могут восстанавливать различные структуры. Стебельчатые морские лилии способны к аутотомии и регенерации всей чашечки (Amemiya, Oji, 1992). Бесстебельчатые морские лилии могут регенерировать цирри, пиннулы, руки, кишечник (Thorndyke et al., 2001; Candia Carnevali, 2005). Морские звезды способны восстанавливать утраченные лучи (Mladenov et al., 1989; Hernroth et al., 2010). У некоторых видов отдельный луч может дать начало всему организму (Dupont, Thorndyke, 2006). Офиуры способны к аутотомии лучей и диска и, соответственно, могут их восстанавливать (Wilkie, 2001; Charlina et al, 2009; Frolova, Dolmatov, 2010; Biressi et al., 2010). Морские ежи имеют наименьшие способности к регенерации среди иглокожих. Они могут репарировать только небольшие повреждения панциря, и отращивать обломанные иглы и педицеллярии (Долматов, 1999).
Представители класса Holothuroidea обладают наибольшим регенераторным потенциалом (Долматов, 1999). Они способны восстанавливать небольшие придатки, такие как щупальца и амбулакральные ножки, заживлять кожные раны. У голотурий имеются механизмы аутотомии. Например, многие виды отряда Apodida могут отбрасывать заднюю часть тела, а затем полностью ее восстанавливать (Emson, Wilkie, 1980; Gibson, Burke, 1983). Голотурии отрядов Aspidochirotida и Dendrochirotida обладают интересной разновидностью аутотомии - эвисцерацией (Hyman, 1955; Emson, Wilkie, 1980; Долматов, 1996). Эти животные в ответ на различные раздражители выбрасывают внутренние органы. Регенерация после эвисцерации может занимать около месяца (Долматов, 2009). Имеются виды голотурий, которые способны восстанавливать крупные отделы тела после поперечного разрезания (Torelle, 1910; Reichenbach, Holloway, 1995; Долматов и др., 2012; Каменев, 2013). Кроме того, ряду видов свойственно бесполое размножение путем поперечного деления на две части (Emson, Wilkie, 1980; Долматов и др., 2012; Каменев, 2013). Оба фрагмента восстанавливают утраченные органы.
Наибольшее число работ по регенерации у голотурий посвящено изучению восстановления пищеварительной системы после эвисцерации (см. обзоры: Долматов, 2009; Mashanov, Garcia-Arraras, 2011). Эвисцерация у разных отрядов происходит различными способами. Представители отряда Aspidochirotida выбрасывают внутренности через анальное отверстие или разрыв стенки тела (Emson, Wilkie, 1980). При этом удаляется средняя часть пищеварительной трубки (кишечник), органы дыхания (водные лёгкие) и часть гонадных трубочек. У животных сохраняются передние (рот, глотка, пищевод) и задние (клоака) отделы пищеварительной системы. При регенерации кишечник формируется по свободному краю кишечного мезентерия между пищеводом и клоакой. У большинства изученных голотурий он развивается из двух отдельных зачатков, один из которых отрастает от клоаки, а другой - от пищевода (Bertolini, 1932; Kille, 1936, 1937; Марушкина, Грачева, 1978; Garcia-Arraras, Greenberg, 2001; Долматов и др., 2012).
Наиболее хорошо изучен данный процесс у дальневосточного трепанга A. japonicus (Марушкина, Грачева, 1978; Leibson, 1992; Шукалюк, Долматов, 2001; Odintsova et al, 2005; Долматов, Машанов, 2007) и К glaberrima (Garcia-Arraras et al., 1998; Garcia-Arraras, Greenberg, 2001; Murray, Garcia-Arraras, 2004; Candelaria et al, 2006). У этих видов голотурий передний зачаток закладывается раньше заднего. На 7-е сут после эвисцерации у оборванного конца пищевода по свободному краю мезентерия развивается соединительнотканное утолщение, в которое врастает внутренний эпителий пищевода. В зачатке клетки сохранившегося кишечного эпителия постепенно дедифференцируются и начинают митотически делиться. При этом они теряют правильную форму, высота их уменьшается, исчезают полудесмосомы, но межклеточные контакты сохраняются. Энтероциты дедифференцируются лишь частично, даже в делящихся клетках сохраняются секреторные вакуоли (Шукалюк, Долматов, 2001; Odintsova et al., 2005; Долматов, Машанов, 2007). За счет пролиферации и миграции клеток зачаток постепенно растет назад по краю мезентерия.
Задний зачаток становится заметным на 10-14-е сут после эвисцерации. Он развивается как соединительнотканное утолщение по краю мезентерия, отходящее от клоаки. Кишечный эпителий клоаки врастает в него, формируя внутреннюю выстилку. Энтероциты частично дедифференцируются и митотически делятся. Тем не менее, они сохраняют межклеточные контакты и секреторные гранулы в цитоплазме. В дальнейшем оба зачатка удлиняются, постепенно распространяясь по краю мезентерия навстречу друг другу. На 20-25-е сут они сливаются, в результате чего целостность кишки восстанавливается.
У представителей отряда Dendrochirotida эвисцерация осуществляется через передний конец тела (Hyman, 1955; Emson, Wilkie, 1980). При этом выбрасывается аквафарингеальный комплекс (АК), весь пищеварительный тракт (кроме клоаки), часть половых трубочек и иногда левое водное лёгкое (рис. 1). АК является важной структурой голотурий (Hyman, 1955). В его состав входят такие интегрирующие органы, как нервное кольцо и кольцевой канал амбулакральной системы. Кроме того, АК содержит щупальца, ряд органов амбулакральной системы, мышцы, начальные отделы пищеварительной системы (Hyman, 1955; Долматов, 1986а, б).
Способность голотурий регенерировать АК была известна достаточно давно (Torelle, 1910; Bertolini, 1930, 1932; Kille, 1936; Hyman, 1955). Тем не менее, относительно подробно восстановление АК исследовано только у четырех видов - Thyone briareus, Т. okeni, Thyonella gemmata и Eupentacta fraudatrix (Kille, 1935; Tracey, 1972; Nace, 1972; Dolmatov, 1992). Судя no представленным данным, процесс регенерации протекает примерно одинаково у всех изученных видов.
Быстрая амплификация концов к днк
Горизонтальный электрофорез производился в 1,2% агарозном геле, при этом использовали трис-ацетатный буфер (ТАЕ) и следующие параметры: напряжение 4 В/см, время 30-40 минут. В качестве маркера длин использовали Gene Ruler DNA Ladder Mix (Thermo Scientific), лидирующего краситель - 6x DNA Loading Dye (Thermo Scientific). Гель окрашивали в растворе бромистого этидия (Biotium) (0,5 мкг/мл) в течение 15 минут. Затем производили анализ геля с помощью трансиллюминатора ChemiDoc XRS+ (BioRad) и пакета программ ImageLab.
Лигирование выделенных фрагментов в плазмидный вектор pTZS7R/T ThermoScientific) проводили в растворе, содержащем 1 мкл Т4 DNA Ligase (ThermoScientific), 1 мкл 10х Ligase Buffer (ThermoScientific), 0,5-1 мкл Vector, 4-6 мкл выделенного фрагмента. Общий объем смеси составлял 10 мкл. Данную смесь оставляли на ночь при +22С. Утром останавливали реакцию прогреванием при +70С в течение 5 мин.
Для приготовления компетентных клеток готовили среды SOC и LB, используя бактотриптон (Applichem), дрожевой экстракт (Applichem), агар (Helicon). После автоклавирования в среду LB добавляли ампициллин (ОАО Дальхимфарм), xGal (Thermo Scientific), IPTG dioxane free (Thermo Scientific). Готовую среду заливали в пластиковые чашки Петри и после застывания хранили при +4С. Для трансформирования вектора в компетентные клетки готовили электрокомпетентные клетки штамма Тор 10, после чего разливали аликвоты по 40 мкл.
Электропорацию компетентных клеток проводили на электропораторе (Eppendorf) при параметрах тока 1700 В/см 5 млс в 1 мм кюветах Electroporation cuvette 1mm gap 100 ці (Eppendorf). Посев клеток производился на чашки со средой LB, содержащей ампициллин, xGal и IPTG для селекции клеток, содержащих вставку.
Наличие вставки проверяли с помощью ПНР, проводимой в 10 мкл смеси с праймерами на вектор Р001 (3,2 мкМ) и Р007 (3,2 мкМ). Колонии со вставкой переносились на наращивание в новую чашку со средой. Использовали лизат клеток одного клона в качестве матрицы для ПЦР в 30 мкл смеси.
Детекцию продукта проводили с помощью горизонтального электрофореза (см. главу 2.5.). Далее проводили чистку из PCR смеси, аналогично выделению из геля (см. главу 2.4.). Измеряли концентрацию полученного фрагмента на Smart Spec Plus Spectrophotometer (BioRad).
Секвенальную реакцию проводили с использованием: 1,5 мкл Big Dye Terminator v 3.1 cycle Sequencing kit (Applied biosystems), 1,2 мкл Big Dye Terminator v 1.1 v 3.1 5x Sequencing buffer (Applied biosystems), 0,8 мкл праймера, 1-4 мкл полученного фрагмента, после чего доводили водой miliQ до 10 мкл. Использовали следующую программу амплификатора: этап 1-1 мин при 95С, этап 2-10 сек при 96С, этап 3-5 сек при 50С, этап 4-4 мин при 60С. Этапы 2-4 повторяли 35 циклов.
Чистку фрагментов ДНК после секвенальной реакции проводили 96% и 70% этанолом, используя в качестве соосадителя 50мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) (Thermo Scientific). Полученые сухие образцы растворяли в формамиде. Секвенирование проводилось на Genetic Analyser 3130(Applied biosystems).
Полученные полные последовательности генов анализировались с помощью программы Mega5.1. После выравнивания аминокислотных и нуклеотидных последовательностей найденных генов и их гомологов у других животных, производили построение филогенетических деревьев с помощью метода Neighbort-Joining tree. Расчет производился как по аминокислотной, так и по нуклеотидной последовательностям. Также просчитывалось количество аминокислотных замен между родственными животными.
2.9. Локализация экспрессии
Для анализа экспрессии генов у интактных животных использовали гонаду, водное легкое, кишку, продольные мышечные ленты, стенку тела, АК и клоаку. При регенерации исследовали органы передней части голотурии (зачаток АК и передний зачаток кишки), обозначаемые далее как передний зачаток (ПЗ), а также задний регенерат кишки (задний зачаток, 33). Синтез одноцепочечной кДНК проводили с помощью набора MMLV RT kit (Евроген). Для синтеза первой цепи брали 1 мкг РНК. Измеряли концентрацию полученной кДНК. ПЦР проводили с использованием прямых и обратных геноспецифичных праймеров (рис. 6) в 10 мкл смеси.
Полученный продукт анализировали с помощью электрофореза с параметрами, описанными ранее (см. главу 2.5.). 2.10. ПЦР в реальном времени
Для анализа динамики активности генов использовали неповрежденные АК и зачаток АК и кишки через 3, 5, 7, 10, 14 и 20 сут после эвисцерации. На каждую стадию регенерации и в норме брали по 3 особи. Материал хранили в RNAlater solution (Ambion) при -20С.
Далее проводили выделение РНК как описано выше (см. главу 2.4.). Обрабатывали ДНКазой (ThermoScientific) и ингибитором РНКаз RiboLock (ThermoScientific). Затем осуществляли синтез первой цепи кДНК идентично таковому для ПНР (см. главу 2.9.).
ПНР в реальном времени (qPCR) проводили в 20 мкл смеси, состоящей из 9,8 мкл miliQ, 2 мкл 10х PCR буфера Б (Синтол), 2 мкл 2,5 мМ дНТФ (Синтол), 1 мкл 25 тМ MgCb (Синтол), 0,2 мкл Syn Taq ДНК-полимеразы (Синтол) и 2 мкл 5 мкМ специфичного праймера. В работе использовался С1000 Thermal Cycler с CFX RT-System (Bio Rad). При этом использовали следующую программу амплификации - этап 1-1 мин при 95С, этап 2-10 сек при 96С, этап 3-30 сек при 63С, этап 4-10 сек при 72С. Этапы 2-4 повторяли 35 циклов, после чего строили кривую плавления продукта, увеличивая температуру денатурации с 60 С до 95С на 0,5С. Результаты обрабатывались с помощью программ Bio-Rad CFX Manager 2.1 и Microsoft Excel.
Для определения оптимальной температуры работы праймеров проводили градиентную ПНР с температурами отжига праймеров 60-65С. Также анализировали эффективность работы праймеров различных концентраций. Оптимум разведения кДНК определяли с помощью серий двукратных разведений. В работе использовали праймеры с эффективностью 95-105%, учитывая показатель эффективности при расчетах.
Для проверки загрязнения РНК при выделении проводили qPCR используя в качестве матрицы тотальную мРНК. Дополнительно проверяли наличие и качество продукта с помощью электрофореза.
Распределение белка wnt5 в тканях е. fraudatrixb процессе регенерации после эвисцерации
Фрагменты транскриптов гена wntA были найдены в транскриптоме зачатков АК и кишки только на 5 сут регенерации. С помощью ПЦР было показано, что в передней части голотурии данный ген экспрессируется на всех исследуемых сроках регенерации. В 33 активность wntA наблюдалась только на поздних сроках восстановления, начиная с 10 сут после эвисцерации (рис. 24). Также было показано, что в норме данный ген активен в водных легких, гонаде, кишке и стенке тела (рис. 25). Экспрессия не была обнаружена лишь в мышцах.
В результате последовательных этапов RACE были секвенированны концевые участки гена. Однако при этом вместо одного было получено 3 фрагмента разной длины, отличающихся приблизительно на 150 нуклеотидов (рис. 26). После секвенирования было установлено, что транскрипты отличаются длиной нуклеотидных последовательностей 3 - и 5 -концевых нетранслируемых областей. Таким образом, существует несколько вариантов транскриптов гена wntA с одинаковой кодирующей областью, но разными нетранслируемыми участками.
Кодирующая последовательность гена wntA имеет длину 1035 нуклеотидов. Она соответствует аминокислотной последовательности в 345 а.о. включающей начальный метионин и стоп-кодон (рис. 26, 27). Предполагаемая масса белка составляет 36 кДа, теоретическая изоэлектрическая точка 8,5. В составе молекулы имеются 24 остатка цистеина в высоко консервативных местах (рис. 26, 27). Консервативный участок аминокислотной последовательности, характерный для всех генов wnt имеет две аминокислотные замены CKCYGVSASC.
Филогенетический анализ данной последовательности показывает, что wntA Е. fraudatrix принадлежит к группе генов WntA, которая включает гомологичные гены многих многоклеточных животных, от гидроидных полипов до асцидий (рис. 28). Наибольшая гомология наблюдается с wnt4 S. purpuratus (ХР_797603.1) - 56%, wntA P. lividus (KJ000376.1) - 56% и wntA S. kowalevskii (NM001171247.1) - 47% (рис 27, 28). При этом наиболее сходными оказываются участки рядом с остатками цистеина (рис. 27).
Для анализа относительного уровня экспрессии гена wntA при регенерации внутренних органов Е. fraudatrix была проведена qPCR. РНК, выделяемая с помощью экстракции тризолом, не содержала примеси ДНК (рис. 29). При проведении опыта был получен один пик на кривой плавления - 86С, означающий специфичное накопление продукта. Кроме того, результат дополнительно проверялся с помощью электрофореза, где также был выявлен лишь специфичный продукт ожидаемой длины - 180 нуклеотидов (рис. 30).
Показано, что уже через 3 сут после эвисцерации уровень экспрессии увеличивается по сравнению с нормой более чем в 5 раз (рис. 31). Активность wntA достигает максимума на 7 сут регенерации, при этом относительный уровень экспрессии превышает норму более чем в 10 раз. В дальнейшем, на 10-20 сут активность гена снижается, но остается достоверно выше уровня нормы.
Фрагменты транскриптов гена wnt4 обнаружены в транскриптоме зачатков на 7 сут регенерации. Длина суммарного полученного фрагмента составила 325 нуклеотидов. С помощью аналитической ПЦР было показано, что данный ген экспрессируется в норме и на всех изученных сроках регенерации, как в передней, так и задней частях голотурии (рис. 24). У неповрежденных животных активность wnt4 обнаружена в мышцах, стенке тела, гонадах, АК, водных легких и кишке (рис. 25). После проведения RACE была определена полная кодирующая последовательность гена. Как и в случае с геном wntA, у wnt4 имеются варианты транскриптов разной длины, отличающиеся некодируемой областью.
Кодирующая последовательность гена wnt4 имеет длину 1077 нуклеотидов, ей соответствует аминокислотная последовательность в 359 а.о., включающая начальный метионин и стоп-кодон (рис. 32, 33) Предполагаемая масса белка составляет 35 кДа, теоретическая изоэлектрическая точка - 8,3. Имеются 24 остатка цистеина в высоко консервативных местах (рис. 32, 33). Консервативный участок аминокислотной последовательности, CKCHGVSGSC, характерный для всех генов семейства Wnt, не имеет аминокислотных замен. Филогенетический анализ wnt4 голотурии Е. fraudatrix показал, что данный ген имеет большую гомологию с wnt4 P. lividus (AHY22359.1) - 69%, с wnt4 S. kowalevskii (ХР002737259.1) - 63% и 63-65% сходства с wnt4 млекопитающих (рис. 33, 34).
С помощью метода qPCR было показано, что уровень экспрессии wnt4 в органах неповрежденных животных относительно невысок (рис. 35). Повреждающее воздействие вызывает, видимо, быструю активацию wnt4, поскольку уже через 3 сут после эвисцерации уровень экспрессии достигает своих максимальных значений за весь период регенерации (рис. 35). Далее на 5 сут активность гена уменьшается и вновь достоверно увеличивается на 7 сут. С 10 по 20 сут уровень экспрессии снижается, но остается достоверно выше нормы.
Роль гена wnt6при регенеращме. fraudatrix
Следующим важным этапом восстановления передних структур Е. fraudatrix является стадия 4 (6-7 сут после эвисцерации). В этот период происходит активный морфогенез и закладываются все основные структуры АК: формируется амбулакральный кольцевой сосуд, нервное кольцо, начинают развиваться щупальца и другие органы амбулакральной системы, кроме того идет развитие переднего зачатка кишки (Dolmatov, 1992; Долматов, Машанов, 2007). На данной стадии экспрессия wntA, wnt6 nfrizzledl/2/7 достигает своих максимальных значений за весь период восстановления (рис. 44). При активном формировании органов особо необходим контроль над расположением клеток, которым, вероятно, управляет wntA (Guder et al, 2006). Число Wnt5 положительных клеток у Е. fraudatrix еще более увеличивается. Поскольку у иглокожих большую роль в регенерации играет клеточная миграция (Долматов, 1999, 2009), возможно сигнальный путь Wnt5 также активирует миграцию клеток. На это может указывать локализация Wnt5 при регенерации в тех тканях, в которых происходит наиболее интенсивное перемещение клеток -мезентерий и гиподерма стенки тела. Экспрессия гена wnt6 на этой стадии регенерации увеличивается более чем в 10 раз, по относительному уровню превышая другие исследуемые гены (рис. 44). У позвоночных Wnt6 участвует в регуляции развития мускулатуры и ряда эпителиальных тканей (Lavery et al., 2008а, b). По всей видимости, у Е. fraudatrix wnt6 выполняет сходную функцию, являясь частью механизмов дифференцировки клеток при формировании мышц и целомического эпителия.
На стадиях 5 и 6 (8-14 сут после эвисцерации) основные структуры АК и переднего отдела кишки уже сформированы и происходит дифференцировка и специализация входящих в них клеток. Этот период характеризуется максимальным содержанием Wnt5-положительных клеток в нервной системе и соединительной ткани. Очевидно, что Wnt5 задействован в регуляции восстановления нервной системы и синтеза внеклеточного матрикса. Экспрессия wnt6 падает до уровня нормы и в дальнейшем более не увеличивается. Также количество транскриптов wntA на 10 сут уменьшается до нормы с незначительными колебаниями на 14 и 20 сут. Экспрессия wnt 4 постепенно уменьшается к 14 сут, однако уровень экспрессии даже на 20 сут сохраняется достоверно выше нормы.
В механизмах регенерации заднего зачатка кишки также задействован Wnt сигналинг. Ранние этапы формирования (стадии 1-4) характеризуются активностью wnt4 и wnt 16. Таким образом, данные гены могут участвовать в регуляции процессов дедифференцировки и миграции клеток кишечной выстилки клоаки. В дальнейшем активизируются wntA и wnt6, которые вместе с wnt4, возможно, контролируют пролиферацию и дифференцировку энтероцитов.
Таким образом, сложная динамика изменения активности генов сигнального пути Wnt при регенерации внутренних органов у Е. fraudatrix указывает на участие данного сигналинга в регуляции восстановительного процесса. Этот вид голотурий является хорошим модельным объектом, и полученные нами результаты создают базис для более детального изучения молекулярных механизмов регенерации у иглокожих, в частности выяснения роли конкретных генов в регуляции тех или иных процессов. ВЫВОДЫ
1) У голотурии Е. fraudatrix в тканях как в норме, так и при регенерации после эвисцерации присутствуют клетки, содержащие белок Wnt5. У неповрежденных животных число WntS-положительных клеток невелико. Они имеются в амбулакральной системе, радиальных нервных тяжах и гиподерме. При регенерации распределение клеток, содержащих Wnt5, сходно, однако число клеток увеличивается, достигая максимума в период активного морфогенеза (стадии 4 и 5), а затем снижается. Наиболее выраженная динамика изменения числа WntS-положительных клеток отмечена для гиподермы и нервной системы.
2) При регенерации аквафарингеального комплекса и кишки у Е. fraudatrix отмечается активность генов frizzled4, frizzled5/8, dishevelled и fi-catenin. Экспрессия гена dishevelled происходит на всех исследованных стадиях восстановления, a fi-catenin, frizzled4 и frizzled5/8 - только на ранних этапах регенерации.
3) Длина кодирующей последовательности гена wntA Е. fraudatrix составляет 1035 нуклеотидов. У неповрежденных животных wntA экспрессируется в водных легких, стенке тела, гонадах, аквафарингеальном комплексе и кишке. При регенерации задней части кишки экспрессия wntA происходит лишь на поздних сроках восстановления. При регенерации передней части кишки и аквафарингеального комплекса высокий уровень экспрессии wntA отмечается в течение всего восстановительного процесса, с максимальными значениями в периоды закладки органов (стадия 2) и активного морфогенеза (стадия 4).
4) Длина кодирующей последовательности гена wnt4 Е. fraudatrix составляет 1077 нуклеотидов. У неповрежденных животных wnt4 экспрессируется в мышцах, водных легких, стенке тела, гонадах, аквафарингеальном комплексе и кишке. При регенерации задней части кишки экспрессия wnt4 наблюдается на всех стадиях восстановительного процесса. При регенерации передней части кишки и аквафарингеального комплекса максимальная экспрессия wnt4 отмечается на ранних этапах восстановления (стадия 2) и в период активного морфогенеза (стадия 4). Далее происходит спад активности wnt4, однако даже в конце регенерации (стадия 8) уровень его экспрессии остается выше нормы.
5) Длина кодирующей последовательности гена wnt6 Е. fraudatrix составляет 1077 нуклеотидов. У неповрежденных животных wnt6 экспрессируется в водных легких, мышцах, гонадах, аквафарингеальном комплексе и кишке. При регенерации задней части кишки экспрессия wnt6 выявляется лишь в период закладки органа. При регенерации передней части кишки и аквафарингеального комплекса высокий уровень экспрессии наблюдается только в период активного морфогенеза (стадия 4). На остальных стадиях восстановления его активность достоверно не отличается от нормы.
6) Длина кодирующей последовательности гена wntl6 Е. fraudatrix составляет 1056 нуклеотидов. У неповрежденных животных wntl6 экспрессируется в водных легких, гонадах и кишке. Его продукты обнаружены на ранних этапах формирования кишки и в конце периода активного морфогенеза (стадия 5).
7) У неповрежденных особей Е. fraudatrix ген frizzledl/2/7 экспрессируется в мышцах, водных легких, стенке тела, гонадах и кишке. При регенерации задней части кишки экспрессия frizzledl/2/7 наблюдается в течение всего восстановительного процесса. При регенерации передней части кишки и аквафарингеального комплекса его активность сначала снижается по сравнению с нормой, затем увеличивается, достигая максимума в период активного морфогенеза (стадия 4), после чего снова снижается до уровня нормы.
