Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 7
2. Обзор литературы 8
2.1. Пространственная организация ДНК в нуклеопротеидных комплексах 8
2.1.1. Пространственная организация ДНК в ядрах клеток 8
2.1.2. Пространственная структура ДНК и регуляция работы генома 8
2.1.3. Значение пространственной организации ДНК для функционирования регуляторных систем 10
2.1.4. Конформация ДНК и строение хроматина 11
2.2. Структура, динамика, молекулярные перестройки хроматина 13
2.2.1. Конформационная подвижность ДНК в хроматине 13
2.2.2. Молекулярные механизмы, повышенной конформационной подвижности ДНК в хроматине 16
2.2.3. Влияние ацетилирования гистонов на организацию и молекулярные перестройки хроматина 18
2.2.4. Перестройки структуры хроматина макромолекулярными белковыми комплексами 18
2.3. "Нестандартные" структуры ДНК и их роль в функционировании ДНК эукариот 20
2.4. Взаимосвязь структурных перестроек разных уровней упаковки ДНК, как основа функциональной организации хроматина 22
2.4.1. Иерархическая структура организации хроматина 22
2.4.2. Динамика ковалентно замкнутой молекулы ДНК 25
2.4.3. Молекулярный механизм взаимосвязанных структурных перестроек нуклеосомной фибриллы 27
2.4.4. Структурная иерархия хроматина и функционирование регуляторных систем 30
2.4.5. Перестройки структуры хроматина при изменении осевой закрутки межнуклеосомных линкеров 31
2.5. Контроль перестроек хроматина 'SET' белками гомеостатической регуляции активности генов 32
3. Материалы и методы 37
3.1. Анализ топологии минихромосомной ДІЖ 37
3.2. Неэнзиматическое ацетилирование гистонов; электро-форетический анализ уровня ацетилирования гистонов 37
3.3. Изолирование"транскрипционно-активных" нуклеосом, анализ спектров кругового дихроизма (КД) ДНК 38
3.4. Анализ конформации фибрилл хроматина с помощью электрофореза в гелях агарозы низкой плотности 39
3.5. Исследование молекулярных перестроек хроматина в бесклеточной системе эмбрионов дрозофилы 40
3.5.1. Приготовления цитоплазматического экстракта эмбрионов дрозофилы 40
3.5.2. Приготовление гистонов и реконструкция хроматина 40
3.5.3. Анализ реконструированного хроматина 41
3.5.4. Упрощенная методика получения нуклеосомных частиц. 41
3.5.5. Структурные перестройки реконструированного и изолированного хроматина 41
3.6. Исследование влияния структур ДНК на экспрессию модельного гена и локальные перестройки хроматина 42
3.6.1. Приготовление плазмидных ДНК, фрагментов ДНК 42
3.6.2. Трансфекция эукариотических клеток, анализ активности хлорамфеникол-ацетилтрансферазы 42
3.6.3. Приготовление экстрактов ядер и проб для белка-активатора 43
3.6.4. Реконструкция нуклеосом на промоторе модельного гена и in vitro транскрипция полученных матриц 43
3.6.5. Анализ структуры хроматина химерных промоторов 43
3.7. Выявление изогнутых и легкоплавких последовательностей ДНК 44
3.8. Исследование фибрилл хроматина с помощью интеркаляторов 44
3.8.1. Культуры клеток и индукция гиперацетилирования гистонов 44
3.8.2. Интеркаляции дифосфата хлороквина в клетках культуры 45
3.8.3. Трипсинолиз концевых доменов гистонов изолированных ядер 45
3.8.4. Интеркаляция бромистого этидия в изолированных ядрах 45
3.8.5. Анализ хроматина фиксированных ядер 46
3.9. Исследование ДНК-белковых взаимодействие области SET факторов гомеостатической регуляции генов 46
4. Результаты 47
4.1. Взаимосвязь ацетилирования гистонов, топологии и конформационной подвижности ДНК модельной минихромосомы 47
4.1.1. Координированное изменение ацетилирования гистонов и сверхспирализации минихромосомной ДНК in vivo 47
4.1.2. Неэнзиматическая модификация гистонов in vitro 54
4.1.3. Высокая конформационная подвижность ДНК транскрип ционно-активной минихромосомы высших эукариот 54
4.2. Конформационная подвижность ДНК в нуклеосомах транскрйпционно-активного хроматина 57
4.2.1. Изолирование "транскрипционно-активных нуклеосом 62
4.2.2. Спектры кругового дихроизма нуклеосом 64
4.3. Конформационная подвижность и перестройки фибрилл хроматина. Электрофорез в гелях агарозы низкой плотности 67
4.3.1. Электрофоретический анализ фибрилл хроматина 67
4.3.2. Конформационная подвижность нуклеосомных фибрилл 71
4.3.3. Реорганизация фибрилл при ацетилировании гистонов 71
4.4. Структура и молекулярные перестройки хроматина в бесклеточной системе эмбрионов дрозофилы 76
4.4.1. Структурные перестройки реконструированного хроматина 76
4.4.2. Топологические перестройки реконструирован, хроматина 82
4.4.3. Перестройки высокоацетилированного хроматина 82
4.4.4. Структурные перестройки изолированных мононуклеосом 96
4.4.5. Включение гистонов НІ в высокоацетилированый хроматин 100
4.5. Влияние последовательности ДНК на локальные перестройки и транскрипционную активность хроматина 106
4.5.1. Влияние последовательности ДНК,ацетилирования гистонов на перегруппировки нуклеосом в "динамичном" хроматине 106
4.5.2. Влияние неканонических структур ДНК на перестройки хроматина и экспрессию химерного гена in vivo 112
4.5.3. Влияние неканонических структур ДНК на конститутивную активность LTR вируса саркомы Рауса 118
4.5.4. Влияние олигомеров (CG) на эффективность промотора вируса саркомы Рауса в клетках различных типов 124
4.5.5. Краткое описание модели. Конститутивная активация промотора на основе LTR вируса саркомы Рауса мономерным фактором CREB 124
4.5.6. Распределение специфических последовательностей ДНК в участке начала репликации домена а-глобиновых генов кур 131
4.6. Исследование хроматина с помощью интеркаляторов 137
4.6.1. Интеркаляция дифосфата хлороквина в клетках in vivo 137
4.6.2. Интеркаляция бромистого этидия в ядрах клеток in vitro 139
4.6.3. Исследование хроматина с модификациями гистонов 141
4.6.4. Исследование фибрилл высокоацетилированного хроматина in vivo при интеркаляции дифосфата хлороквина 147
4.6.5. Исследование пространственной организации концевых доменов гистонов высокоацетилированного хроматина 151
4.7. Взаимодействие "SET" области факторов гомеостатической регуляции генов со структурами активного хроматина 153
4.7.1.Область SET прочно связывает однонитевые субстраты ДНК 153
4.7.2. Область SET поддерживает связывание с однонитевой ДНК
при высокой концентрации NaCl и хаотропных агентов 160
4.7.3. Область SET MLL поддерживает взаимодействие с однонитевой ДНК при сборке "динамического" хроматина 160
4.7.4. Мутация Z11 в области SET триторакса препятствует прочному связыванию с однонитевой ДНК 164
4.7.5. Определение участков связывания однонитевой ДНК в SET области ряда белков 'SET'-группы 168
4.7.6. Оценка пространственной структуры участков связывания однонитевой ДНК в 'SET' области 175
4.7.7. Область SET триторакса прочно связывается с свобод ными тетрамерами гистонов НЗ-Н4, но не нуклеосомами 176
5. Обсуждение результатов
5.1. Взаимосвязь ацетилирования гистонов, топологии и конфор-мационной подвижности ДНК эндогенной минихромосомы 180
5.2. Конформационная подвижности ДНК "транскрипционно-активных" нуклеосом и нуклеосомных фибрилл 181
5.3.Перестройки фибриллы хроматина при ацетилировании гистонов 181
5.4. Структура и молекулярные перестройки высокоацетилированного хроматина в бесклеточной системе эмбрионов дрозофилы 186
5.5. Влияние последовательности ДНК и ацетилирования гистонов на распределение нуклеосом в "динамическом" хроматине 188
5.6. Распределения специфических последовательностей ДНК в участке начала репликации домена а-глобиновых генов кур 190
5.7. Влияние неканонических структур ДНК на локальные перестройки и транскрипционную активность хроматина 191
5.8. Структура и перестройки хроматина при изменении конформации межнуклеосомной ДНК 192
5.9. Взаимодействие специфических структур активного хромати на с "SET" областью белков гомеостатической регуляции генов 196
5.10. Заключение 198
6. Выводы 200
- Структура, динамика, молекулярные перестройки хроматина
- Неэнзиматическое ацетилирование гистонов; электро-форетический анализ уровня ацетилирования гистонов
- Конформационная подвижность ДНК в нуклеосомах транскрйпционно-активного хроматина
- Конформационная подвижности ДНК "транскрипционно-активных" нуклеосом и нуклеосомных фибрилл
Введение к работе
Характер упаковки ДНК в ядрах эукариотических клеток является критическим и, зачастую, доминирующим фактором уровня активности генов. Структурной единицей хроматина является нуклеосомная частица, состоящая из фрагмента ДНК длиной 145 п. н. "навитого" на октамер гисто-новых белков. В ходе дальнейшей компактизации нить нуклеосом последовательно образует фибриллу диаметром 25-34 нм, филаменты 200-300 нм, петли хроматина и сверхспирали хроматид. Полностью упакованная ДНК имеет жесткую, статичную структуру несовместимую с ее функциональной активностью. Если структура хроматина как таковая, изучена достаточно подробно, то механизмы перестроек хроматина при активации генов остаются неясными. Практически неизвестны молекулярные основы возникновения, поддержания и наследуемости стабильного профиля экспрессии генов в ходе развития, что является центральной проблемой биологии развития, молекулярной биологии и молекулярной генетики. Изучение молекулярных механизмов упаковки хроматина необходимо и для направленного манипулирования дифференциальной экспрессией эукариотического генома. В целом, предполагается, что в ходе активации генов структура хроматина, сохраняясь как таковая, претерпевает существенные изменения. Однако природа этих структурных перестроек, их молекулярный механизм и непосредственная роль в регуляции генома, остаются неясными. Предлагаемая работа проводилось в попытке прояснить некоторые структурно-функциональные аспекты перестроек хроматина и их роли в регуляции дифференциальной экспрессии генома эукариотических клеток в ходе развития.
Работа была поддержана грантами РФФИ #98-04-48138, 01-04-48469. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения и списка литературы. Работа изложена на 245 страницах и содержит 106 рисунков и 1 таблицу. Список литературы включает 518 источников.
Структура, динамика, молекулярные перестройки хроматина
Принято считать, что организованная в нуклеосомы ДНК имеет жестко фиксированную, статичную структуру, а нуклеосомная организация конденсированного - «статического» - и активного - «динамического» хроматина принципиально отличается [56,57]. Появились, однако, данные, свидетельствующие, что ДНК обладает значительной конформационной подвижностью и в составе "классической" нуклеосомы. На изменение внешних условий молекулы ДНК реагируют изменением конформации [351]. Так, при изменении температуры меняется шаг двойной спирали ДНК. ДНК бактерий ведет себя схожим образом [21,58-61, 351]. Другая картина наблюдается для эукариотической ДНК, жестко фиксированной структурами хроматина. В минихромосомах, реконструированных из гистонов высших эукариот [62-64], и в минихромосомах SV40 [65-68], доля подвижной ДНК не превышала 20%, что соответствует доле межнук-леосомных участков [65-67]. Однако в минихромосомах дрожжей in vivo до 70% ДНК изменяли конформацию при изменении температуры [69-71]. Повышенную конформационную подвижность ДНК дрожжевых минихромосом пытались объяснить отсутствием у дрожжей гистонов HI. Однако минихромосомы, реконструированные из гистонов высших эукариот в отсутствии гистонов HI, повышенной конформационной подвижности не проявляли [62-64]. Если причина повышенной подвижности ДНК связана с гистонами, ее следует искать на уровне первичной структуры гистонов. Гистоны НЗ высших эукариот содержат в позиции 110 остаток цистеина [72-74], способный димеризоваться с остатком цистеина входящей в состав нуклеосомы второй молекулы гистона НЗ. Гистоны НЗ дрожжей содержат в позиции ПО остаток аланина, и подобная связь возникнуть не может. В принципе, это способно обусловить большую конформационную свободу ДНК нуклеосом дрожжей по сравнению с ДНК высших эукариот [34,74,75]. Вторым отличием гистонов дрожжей является повышенный уровень ацетилирования. Однако данные о влиянии ацетилирования гистонов на подвижность ДНК в хроматине значительно различаются. Ацетилирование затрагивает аминоконцевые фрагменты гистонов. Отщепление концевых фрагментов гистонов с помощью трипсина не влияло на подвижность ДНК реконструированных минихромосом [64].
С другой стороны, индуцированное in vivo гиперацетилирование гистонов, как и неэнзиматическое ацетили-рование гистонов в изолированных ядрах, существенно ограничивало конформационную свободу ДНК минихромосомы клеток мыши [76,77]. На подвижность ДНК могут влиять и другие белки ядер. Взаимодействие таких белков с хроматином должно быть достаточно прочным. Добавление экстракта ядер дрожжей при сборке минихромосом из гистонов позвоночных не влияло на подвижность реконструированного хроматина [69]. Существует и другие объяснения повышенной конформационной подвижности ДНК дрожжевых минихромосом. Минихромосомы дрожжей являлись транскрипционно активными в отличие от реконструированных минихромосом и минихромосом вируса SV40. Структура активного хроматина, обеспечивающая свободный доступ факторов транскрипции к ДНК, может обусловливать и большую конформационную подвижность ДНК. Например, при движении РНК-полимеразы происходит накопление положительных сверхвитков ДНК впереди, и отрицательных витков сзади транскрипционного комплекса [44,45,78-80]. В нективном же хроматине нуклеосомы упакованы в гораздо более компактные структуры, ограничивающие возможность каких-либо конформационных изменений ДНК. Подвижность ДНК транскрипционно-активной фракции минихромосом SV40 пытались оценить, изучая фракцию минихромосом, способную к элонгации транскриптов in vitro [67,68], Однако отличий от всей популяции минихромосом выявить не удалось. Возможно это объясняется некорректностью критерия активной фракции. Минихромосомы, способные к элонгации транскриптов in vitro, т.е. содержащие активную РНК-полимеразу, принято считать транскрипционно-активными in vivo [81,82]. Однако, было показано [83,84], что такие минихромосомы in vivo не транскрибируются. Интересно сообщение о минихромосоме клеток мыши, ДНК которой обладала той же степенью свободы, что и ДНК дрожжевых плазмид. Индуцированное гиперацетилирование гистонов in vivo, как и неэнзиматическое ацетилирование в изолированных ядрах, вызывало существенное ограничениє конформационной подвижности ДНК минихромосомы. При этом уровень транскрипции минихромосомы снижался в несколько раз [76,77]. 2.2.2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПОВЫШЕННОЙ КОНФОРМАЦИОННОЙ ПОДВИЖНОСТИ ДНК В ХРОМАТИНЕ. В ряде работ показана необычная «развернутая» структура "транс-крипционно активных" нуклеосом клеток HeLa [85,86], в которых SH- группы гистонов НЗ экспонированы вовне нуклеосомы [87]. Это позволило изолировать "развернутые" нуклеосомы аффинной хроматографией на Hg-ara-розе. Нуклеосомы содержали полный комплект гистонов, причем гистоны НЗ и Н4 имели высокий уровень ацетилирования, а гистоны Н2А - низкий уровень фосфорилирования [88,89]. Полагают, что "развернутые" нуклеосомы образуются при взаимодействии с транскрипционным комплексом [86, 90]. Ингибирование РНК-полимеразы II d-аманитином приводила к необратимой утере "развернутой" структуры нуклеосом (интересно, что обработка актиномицином D к утере "развернутой" структуры не приводила [90]). Домены активного хроматина отличаются повышенной чувствительностью к гидролизу дезоксирибонуклеазой I и менее выраженным "нуклео-сомным повтором" при гидролизе микрококковой нуклеазой [168]. Данные ДНК-белковых сшивок свидетельствуют [91-102], что гистоны активного хроматина взаимодействуют с ДНК за счет своих N-концевых фрагментов, в неактивном же хроматине - также и за счет глобулярных областей [95]. Электронная микроскопии показывает, что при активации генов нуклеосомы разворачиваются с образованием протяженных U-образных частиц [87]. Транскрибируемый хроматин отличается повышенным ацетилированием гистонов ([89,103-109], обзоры [50,110-112]; см. п. 2.2.3).
При химическом аце-тилировании in vitro получали хроматин, обладающий рядом свойств активного хроматина [113-115]. Высокоацетилированные нуклеосомы теряют компактность [87,107,108, 116] и накладывают меньшие ограничения на конфор-мацию ДНК [117,118], так что структура ДНК более сходна со структурой в растворе [120]. Удаление N-концевых фрагментов гистонов (по которым протекает ацетилирование) [117-120] и другие их модификации могут приводить к уменьшению стабильности и декомпактизации нуклеосом [121,122]. Эти данные предполагают, что нуклеосомы активного хроматина имеют декомпактизированную структуру с ослабленными ДНК-белковыми взаимодействиями, что может обусловливать повышенную подвижность ДНК. Неизвестно, за счет каких именно факторов обеспечивается декомпактиза-ция нуклеосом. Определенную роль, вероятно, играет ацетилирование гистонов (см. п.2.2.3), причем, возможно, его специфичный тип [112,128,129]. Альтернативно, гиперацетилирование гистонов "развернутых" нуклеосом может обусловливается их большей доступностью для ацетилаз. Так, гиперацетилирование нуклеосом, вызываемое масляной кислотой, не всегда имеет позитивный эффект на транскрипцию [50,110-112,123-127]. Следует предположить необходимость дополнительных воздействий для образования раскрытой структуры нуклеосом. Конформационные изменения нуклеосом могут быть обеспечены за счет взаимодействия с HMG или другими белками [110-112], а также под действием комплексов перестроек хроматина (п.2.2.4). Вышесказанное справедливо и для дрожжевых плазмид. Но не следует упускать упоминавшиеся различия гистонов дрожжей и высших эукари-от. Вполне вероятно, что невозможность межмолекулярной связи между гистонами НЗ с сопутствующим ацетилированием гистонов определяет образование "развернутых" нуклеосом. Тогда следует ожидать, что вся ДНК хроматина дрожжей обладает повышенной конформационной подвижностью. Такая особенность дрожжевого хроматина может быть связана с относительной простотой дрожжевой клетки и отсутствием избытка наследственного материала для реализации программ дифференцировки. Существует гипотеза, отводящая упругим напряжениям ДНК ключевую роль в формировании структуры активного хроматина [56-58,100,130]. Однако, не обнаружено влияния напряжений ДНК в хроматине на транскрипцию [135]. Представляется маловероятным исходное существование упругих напряжений в хроматине, как причины его активации [130-133].
Неэнзиматическое ацетилирование гистонов; электро-форетический анализ уровня ацетилирования гистонов
Ацетиладенилат приготовляли по модифицированному протоколу [318,319]: 0,5 мМ 5 -монофосфата аденозина растворяли в 2 мл 50% пиридина, на льду смешивали с 0,5 мл 1М LiOH. Добавляли 0,5 мл уксусного ангидрида; 1 мин перемешивали на льду и экстрагировали 3 раза диэтило-вым эфиром. Водную фазу осаждали 50 мл ацетона; осадок растворяли в 1 мл воды, переосаждали ацетоном и высушивали под вакуумом. Ацетили-рование гистонов в изолированных ядрах (1-10 мМ ацетиладенилата) проводили по протоколу [43,77] в течение 40-60 мин в буфере ([25 мМ трис-НС1 или 50 мМ MOPS-трис; рН 8,0], 2 мМ ЭДТА, 0,34 М сахарозы). Гистоны изолировали по процедуре [313,314] с лизисом клеток на чашке Петри раствором 1% тритона Х-100, 1,5 М сахарозы, 10 мМ MgCl2,10MM трис-НСІ, рН 8,0, 5 мМ масляной кислоты, 1 мМ PMSF. Гистоны анализировали в 12% полиакриламидных гелях, содержащих 0,5М уксусной кислоты, 0,65% Тритона Х-100, 3-6 М мочевины [315], с концентрирующей приставкой [316,317]. Ядра печени крыс изолировали по методике [320,321]. Масляную кислоту (рН 8,0) добавляли до концентрации 5 мМ во все буферные растворы. Фракционирование нуклеосом на Hg-агарозе проводили по методике [322]: осадок ядер суспендировали (1-2х106/мл) в буфере А (10 мМ трис-НС1 (рН 7,4), 25 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 0,5 мМ СаС12, 0,35 М сахароза, 5 мМ масляная кислота (рН 8,0), 0,1 мМ PMSF) и обрабатывали микрококковой нуклеазой (Worthington) при 10-20 ед/мл (10-20 мин, 37С). Реакцию останавливали 3 мМ ЭГТА (рН 7,0). Ядра осаждали центрифугированием (10000g, 20 мин), надосадочный слой (10-15% ДНК от исходного количества), обрабатывали РНКазой А при 200 мкг/мл (1 ч, 25С) и фракционировали на колонке с Hg-агарозой [322]. Фракции нуклеосом диализо-вали в течение ночи против буфера В (10 мМ трис-НСІ (рН 7,4), 10 мМ NaCI, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ масляной кислоты (рН 8,0), 0,1 мМ PMSF), концентрировали на роторном испарителе при 0С и дополнительно очищали в 5-20% градиенте сахарозы, содержащем 0,55 М NaCI, для удаления гистона HI и HMG-белков. В зависимости от степени гидролиза ядер нуклеазой, размер нуклеосомной ДНК составлял от 145 до 180 п.н. Во втором варианте изолирование транскрипционно-активной фракции нуклеосом проводили по модифицированной [323,324] процедуре [320,321]: ядра обрабатывали микрококковой нуклеазой при 0,5-2 ед/мл (5 мин, 37С) и осаждали центрифугированием. Надосадочный слой (0,5-1 % ДНК от исходного количества), обрабатывали РНКазой А при 200 мкг/мл (1 ч, 25С), диализовали против буфера В, концентрировали и очищали в градиенте сахарозы, содержащем 10 MMNaCl. Ядра дрожжей изолировали и обрабатывали микрококковой нуклеа-зой как описано [325].
Для измерении КД использовали фракцию нуклеосом непосредственно после обработки ядер нуклеазой. Гистоны анализировали как описано в п.3.2. Нуклеосомы и нуклео-сомную ДНК анализировали в 4% полиакриламидном геле [326]. Спектры и амплитуды КД (270 нм, 0-25С) измеряли на приборе «Mark III dichrograph» (Jobin-Ivon) как описано в [327,328]. Хроматин из печени крыс изолировали по методу [329,330] при 0С. Ткань (1-2 г) гомогенизировали в 25 мл буфера А (50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,25 М сахароза, 5 мМ MgCl2, 5 мМ масляная кислота, 5 мМ 2-меркап-тоэтанол, 0,1 мМ PMSF) и добавляли равный объем того же буфера, содержащего 2 М сахарозу и 1% NP40. После 10 мин инкубации ядра осаждали 20 мин центрифугированием при 5000 g. Осадок ядер суспендировали (1-2х106/мл) в буфере А, содержащем 1 М сахарозы, 0,25% NP40, и осаждали 10 мин центрифугированием при 5000g; процедуру повторяли два раза. Далее ядра промывали буфером А, содержащим 50 мМ КС1, после чего осадок ядер суспендировали (2,5 х108/мл) в буфере А, содержащем 100 мМ КС1 и 1 мМ СаС12. Ядра обрабатывали микрококковой нуклеазой при 2 ед. фермента на 106 ядер (5 мин, 0С). Реакцию останавливали 10 мМ EDTA, диализовали 12 ч против 1 мМ EDTA и осветляли центрифугированием (20 мин, 5000g). Надосадочный слой содержал 50-80% ДНК ядер в форме олигонуклеосомных фрагментов. Полученный хроматин использовали как непосредственно или после фракционирования гель-фильтрацией на колонке TOYOPEARL HW75F в буфере А, содержащим 25 мМ NaCl и 2 мМ EDTA. В экспериментах использовали 12-15 олигонуклеосомные фрагменты. Для удаления гистона HI, хроматин диализовали в (50 мМ фосфата натрия (рН 7,0), 0,2 мМ EDTA, 100 мМ NaCl), добавляли 1/4 объема смолы AG50W-X2 в том же буфере; суспензию перемешивали 2 ч на льду. Смолу осаждали центрифугированием 10 мин при 3000g. Надосадочный слой содержал хроматин, лишенный гистона HI [276]. Хроматин на разных стадиях конденсации получали диализом 20 ч в растворе 5 мМ триэтаноламина, рН 8,0, 0,25 мМ EDTA и 0-120 мМ NaCl. Раствор хроматина прогревали 10 мин при нужной температуре и добавляли 0,1% глютарового альдегида [276]; фиксацию проводили 12ч при 4С. Фиксированный хроматин диализовали 12 ч в 1 мМ EDTA и анализировали в 0,25 - 0,4 % геле агарозы при 0,5 В/см. Денситометрию пленок проводили на приборе 300A Computing Densitometer. Гистоны экстрагировали 0,2 М H2SO4, переосаждали 4 объемами этанола и анализировали в 16% денатурирующем полиакриламидном геле. Дехоринизированные эмбрионы гомогенизировали в буфере ЕХ (10 мМ Hepes-KOH, рН 7.6, 10 мМ КС1, 1.5 мМ MgCl2, 0.5 мМ EGTA, 10% глицерин, 1 мМ ДТТ, 0.2 мМ PMSF), осветляли центрифугированием (2ч, 100000g) и инкубировали 2 ч при 5С.
Осадок удаляли центрифугированием 10 мин при 100000g. Экстракт делили на порции и хранили при -70С. Гистоны экстрагировали из ядер клеток CV1 0,2 М H2S04, переосаждали 1 объемом 10% перхлорной кислоты (30 мин на льду) и собирали центрифугированием 20 мин при 10000g. Осадок растворяли в 0.5 М НС1 (1 мг/мл) и диализовали 12 ч против раствора 10 мМ Р-меркаптоэтанола, 0.1 мМ PMSF. К диализату добавляли 50 % глицерина и хранили при -20С. Гистоны анализировали в 13% геле как описано выше. Экстракт освобождали от гистонов иммобилизованной ДНК [332,333] (50 мкг ДНК на 0,5 мл экстракта). Реконструкцию хроматина проводили в буфере ЕХ содержащем 50 мМ КС1, как описано в [333,334], используя 0,65 мкг ДНК плазмиды ХХ3.2 (6,2 т.п.н) [335] на 130 мкл смеси. Соотношение гистонов "кора" к ДНК составляло 1,2:1 в присутствии гистона HI и 1,75:1 в отсутствие НІ; гистонов HI к ДНК составляло 0,25:1. Анализ микрококковой нуклеазой и ДНКзой I проводили как описано в [333,334], пропорционально изменяя объем реакции. ДНК изолировали [333] и анализировали в 0,8% агарозном геле. Для определения доступности хроматина для нуклеаз рестрикции, 20 мкл хроматина расщепляли (10 мин, 26С) 50 ед. Яше II в присутствии или отсутствие 1 мМ АТР. Для анализа конформационной подвижности ДНК, образец хроматина разделяли на 2 части, которые инкубировали соответственно 40-60 мин при 35С или 2-4 ч при 5С в присутствии 0,5 ед. топоизомеразы I дрозофилы. Реакции останавливали 10 мкл раствора 2,5% саркозила, 100 мМ ЭДТА. ДНК изолировали и анализировали в 1,2% геле агарозы, содержащем 3-5 мкг/мл хлороквина. Ядра печени крыс (эритроцитов кур) получали гомогенизацией ткани в растворе содержащем тритон Х-100. Моно- и олигонуклеосомные фрагменты хроматина получали гидролизом ядер микрококковой нуклеазой с последующим гипотоническим лизисом. Гидролиз нуклеазой контролировали электрофоретическим анализом ДНК, до получения фрагментов хроматина желаемой длины (моно- или олигонуклеосомы). Негистоновые белки и гистон HI удаляли динамической сорбцией на карбоксиметилированном сефадексе. Раствор моно- и олигонуклеосомных фрагментов хроматина непосредственно обрабатывали порошком сефадекса СМ-50 (50-100 мг/мл), к которому предварительно добавляли раствор NaCl из расчета 50-100 мМ конечной концентрации.
Конформационная подвижность ДНК в нуклеосомах транскрйпционно-активного хроматина
Высокая конформационная свобода ДНК дрожжевого хроматина была приписана отличиям гистонов НЗ, содержащих, в отличие от высших эука-риот, в позиции ПО остаток аланина вместо цистеина [34,72-74], вследствие чего нуклеосомы дрожжей, по-видимому, не способны стабилизироваться за счет дисульфидной связи между гистонами НЗ, подобно нуклеосомам высших эукариот [34,74]. Однако была показана высокая конформационная свобода ДНК транскрипционно-активных минихромосом высших эукариот (п.4.1.3). Описана "развернутая" структура транскрибируемых нуклеосом высших эукариот, в которых SH-группы гистонов НЗ свободны и экспонированы во-вне нуклеосомы [85,86,88,90,169]. Это дает основания поставить вопрос, способна ли "развернутая" структура нуклеосом обеспечить повышенную конформационную подвижность нуклеосомной ДНК, как это, возможно, происходит в нуклеосомах дрожжей. "Развернутая" нуклеосома может представлять структуру, имеющую черты нуклеосомной организации, ДНК которой сохраняет свойства свободной ДНК. Вопрос весьма существен для понимания, как процессивные факторы преодолевают нуклеосомную структуру без разрушения оной. Здесь изучили конформационную подвижность ДНК в ряде фракций транскрибируемых нуклеосом высших эукариот и в нуклеосомах дрожжей. Изменения конформации спирали ДНК нуклеосом регистрировали методом кругового дихроизма. Нуклеосомы с экспонированными SH-группами гистонов НЗ изолировали сорбцией на Hg-агарозе с элюцией 10 мМ меркаптоэтанола [85,86,88,90,169]. С Hg- агарозой также связывалась популяция нуклеосом, ассоциированная с тиольными белками, элюируемая 0,5 MNaCl [322,325]. Существуют и другие подходы изолирования транскрибируемых нуклеосом. При "мягком" гидролизе ядер микрококковой нуклеазой получают фракцию нуклеосом, обогащенных HMG-белками и РНК-полимеразными комплексами, с высоким уровнем ацетилирования гистонов при быстром обмене ацетата [320,323]. В работе использовали оба способа изолирования активных нуклеосом. Обе фракции нуклеосом содержали высокоацетилиро-ванные гистоны (рис. 19) и обогащены транскрибируемыми последовательностями. Нуклеосомы с экспонированными SH-группами и имели пониженную подвижность в нативном полиакриламидном геле [326], (рис. 20А), при этом размер ДНК "развернутых" нуклеосом не превышал размера ДНК нуклеосом других фракций (рис. 20Б). Повышенный размер ДНК нуклеосом, элюируемых с Hg-агарозы 0,5 М NaCl, объясняют ассоциацией с HMG-бел-ками [322].
В зависимости от степени нуклеазного гидролиза, размер ДНК составлял от 145 (кор-частица) до 180 п.н. (нуклеосома). Конформационную свободу ДНК нуклеосом оценивали по способности ДНК изменять конформацию при изменении температуры, учитывая: 1) изменение температуры на 1К раскручивает спираль ДНК на 0,012 на 1 п.н. [64,65,327,352,353], 2) нуклеосома защищает от конформационных изменений 175-180 п.н. ДНК [64,65,327,352], 3) шаг спирали ДНК кор-частицы (145 п.н.) - 10.0 п.н.; остальной ДНК - 10,4 п.н. [354,355]. 4) молярный дихроизм при 275 нм: для ДНК с шагом спирали 10 п.н. - 0,1 IVT CM"1, ДЛЯ ДНК с шагом спирали 10,4 п.н. (свободная ДНК) - 2,5 М см"1; суммарный молярный дихроизм ДНК нуклеосомы - 0,5 М см"1 [327,352] и 5) изменение температуры на 1 К сопровождается изменением амплитуды КД275 на 0,012 и 0,12 М см"1 для ДНК с шагом спирали 10,4 и 10 п.н., соответственно [327,352]. Повышенную свободу ДНК нуклеосом можно объяснить моделями: 1. Часть ДНК (65%) утрачивает связь с гистонами. Молярный КД275 ДНК кор-частицы - 0,1 М см"1, высвободившейся ДНК - М см"1. Следует ожидать увеличения КД275 ДНК нуклеосомы (рис. 21, кривые 4,4 ). 2. Часть ДНК (65%) приобретает способность изменять шаг спирали при изменении температуры. Изменение амплитуды КД275 для ДНК кора - 0,12 М см К"1, для остальной ДНК - 0,012 NfW K"1 (рис. 21, кривые 2, 2% 3. С ростом температуры ДНК-гистоновые взаимодействия дестабилизируются, у части ДНК кора шаг спирали меняется с 10 до 10,4 п.н., сопровождаясь 25х ростом КД 275- В этом случае, при росте температуры на 10К, 8 п.н. ДНК кора должны приобретать шаг спирали 10,4 п.н. (рис. 21, 3 и З ). Иными словами, нуклеосома с высокой конформационной подвижностью ДНК должна отличаться повышенным значением КД при 275 нм. Однако, оценка КД нуклеосом и кор-частиц (рис. 21) свидетельствуют, что конформационный потенциал всех структур примерно одинаков. ДНК эукариот организована в 25-30 нм фибриллы хроматина, декон-денсирующиеся при низкой ионной силе среды (п. 2.4.1 [50,122,168,252,276]). Динамику фибрилл хроматина изучают с помощью электронной микроскопии [276,329,330,356], центрифугирования в градиентах сахарозы [329,356,357], метризамида [358-362], CsCl [361-365], электрического дихроизма [278,366-368] рассеяния нейтронов [369-375] и др. Недостатки этих методов - сложность и громоздкость оборудования, длительность и сложность анализа и т.д. Описанный здесь несложный метод анализа фибрилл хроматина, в отличии от схожих [376-378], включает предварительную фиксацию хроматина, что позволяет сравнивать образцы, полученные при разных условиях. Фрагменты хроматина (12-15 нуклеосом) получали гидролизом ядер печени крыс микрококковой нуклеазой, доводили до требуемой степени конденсации диализом при разных концентрациях NaCl, фиксировали глю-таровым альдегидом и анализировали в 0,3% гелях агарозы (рис. 22-24).
Повышенная электрофоретическая подвижность хроматина, фиксированного при более высоких концентрациях NaCl, свидетельствует о компактизации фибрилл хроматина за счет упаковки в более конденсированные структуры. Гистоны HI удаляли смолой AG50W-X2 [276] в растворе с невысокой ионной силой (100 мМ NaCl, 50 мМ NaHP04), что позволяет количественно удалять гистоны HI, избежав диссоциации нуклеосом (рис. 22Б). После удаления гистона HI, нуклеосомная фибрилла теряет структуру упорядоченной сверхспирали и приобретает вид хаотического клубка, параметры которого лишь незначительно зависят от ионной силы [276,389-391]. Действительно, электрофоретическая подвижность хроматина после удаления гистонов HI не зависела от ионной силы среды (рис. 22-24), подтверждая, что изменения подвижности хроматина отражают его конденсацию. Следует отметить, модификация глютаральдегидом остатков лизина гистонов может приводить к артефактам структуры хроматина, фиксация удаленных частей фибриллы может завышает степень компактизации. Хорошее соответствие результатов подхода с данными других методов [50,168,252, 276,329,356,357,361-365], дает основание предложить этот подход как альтернативу другим методам исследования хроматина. Схожее ограничения свободы ДНК активных и неактивных нуклео-сом (п. 4.2.2) предполагает, что "температурное" изменение числа витков ДНК транскрипционно-активной минихромосомы (п. 4.1.3) может отражать повышенную конформационную подвижность "активной" нуклеосомной фибриллы, изменение параметров которой, в случае кольцевой ДНК, может фиксироваться тороизомеразами как изменение числа витков ДНК (п. 2.4, рис. 2,3). Здесь попробовали оценить, способны ли параметры нуклеосомного соленоида меняться при изменении температуры среды. Динамику нуклеосомной фибриллы на разных стадиях конденсации изучали с помощью подхода п.4.3.1, с фиксацией при 4 или 24 С (рис. 25, 26). Хроматин, фиксированный при 24С имел существенно большую электрофоретическую подвижность, чем фиксированный при 4С. Различие было более выражено для хроматина с низкой степенью конденсации (рис.26). При удалении гистона HI (п.4.3.1), подвижность хроматина не зависела от температуры (рис. 27,28). Таким образом, изменение электро-форетической подвижности при изменении температуры свидетельствует о флуктуациях степени конденсации нуклеосомной фибриллы (рис. 28).
Конформационная подвижности ДНК "транскрипционно-активных" нуклеосом и нуклеосомных фибрилл
Компактная структура нуклеосом и нуклеосомных фибрилл ограничивают активность ДНК. Данные указывают на реорганизацию этих структур в активном хроматине. Привлекает модель "транскрибируемой" нуклеосомы как структуры, сохранившей нуклеосомную организацию, ДНК которой обладает подвижностью свободной ДНК (п. 2.2.1-2,4.2, 5.1). Оценка конформационной подвижности ДНК хроматина (п.4.2.-3), однако, свидетельствует, что структура активных и неактивных нуклеосом накладывает схожие ограничения на свободу ДНК; в то же время декон-денсированный нуклеосомный соленоид является гибкой, достаточно подвижной структурой. Повышенную конформационную подвижность ДНК транскрипционно-активных минихромосом (пп. 2.2.1 и 4.1.2) следует, очевидно, искать не только на уровне нуклеосомной структуры как таковой -причем скорее как результат ее перестроек белковыми факторами (пп. 2.2.4 и 5.4), но также на уровне наднуклеосомной структуры - как результат повышенной конформационной подвижности "развернутой" нуклеосомной фибриллы, по сравнению с компактной (рис. 22, 103). Здесь впервые прямо показано, что увеличение доли высших ацети-лированных форм гистонов вызывает декомпактизацию наднуклеосомной структуры хроматина (п. 4.3.3). Это согласуется с данными ряда работ где, с одной стороны, показан высокий уровень ацетилирования гистонов активного хроматина, с другой же стороны, отмечается несовместимость генетических процессов со структурой компактной фибриллы хроматина. Нить нуклеосом компактизуется за счет свивания в упорядоченную спиральную структуру диаметром 30 нм, стабилизированную гистонами HI. При понижении ионной силы среды, 30 нм фибрилла "разворачивается" до филамента диаметром 10 нм (п. 2.4.1). При удалении гистонов HI нить нуклеосом образует неупорядоченный клубок, принципиально отличный от развернутой 10 нм фибриллы. Электрофоретическая подвижность полинуклеосомного "клубка" была существенно выше подвижности "развернутой" 10 нм фибриллы (рис. 29Б,В), в то время как ацетилирование гистонов, наоборот, вызывало значительное уменьшение электрофоре-тической подвижности фрагментов хроматина (рис. 29Б), как и при декон-денсации хроматина при низкой ионной силе. Это предполагает, что де-компактизация 30 нм фибриллы, вызываемая ацетилированием гистонов, протекает по механизму, схожему с механизмом "разворачивания" нук-леосомного соленоида в растворах с низкой ионной силой, а не по пути образования структуры типа "хаотического клубка" (рис. 104 и рис. 5).
При деконденсации нуклеосомного соленоида число его витков значительно возрастает (п. 2.4. рис. 3,4,104), что должно сопровождаться возрастанием энергии сверхспирализации домена хроматина (п. 2.4, [489-494]). Энергия может быть скомпенсирована за счет частичного высвобождения сверхвитков нуклеосом. Согласно оценкам (соотн. 1а, п.2.4.2; методика [135,260]), избыточная энергия сверхспирализации может становиться сравнимой с энергией образования нуклеосом (рис. 105). Напряжения в домене могут быть скомпенсированы топоизомеразами, но даже при кратковременном воздействии, увеличение энергии сверхспирализации может привести к дестабилизации нуклеосомной структуры [58,241,281,282,285,495]. Безусловно, было бы весьма привлекательно рассматривать данный механизм как лежащий в основе функциональных перестроек хроматина. В соответствии с данной моделью, ацетилирование гистонов, вызывая реорганизацию упаковки нуклеосомной фибриллы, тем самым обусловливает дестабилизацию и нуклеосомных структур. В отличие от известных ранее модуляторов структуры хроматина [50,174,496], обнаруженная активность не требовала АТР как источник энергии, но скорее основывалась на разнице энтропии начального и конечного состояния нуклеосомнои частицы. Для протекания молекулярной перестройки не требовалось дополнительного взаимодействия нуклеосом с факторами транскрипции. Перестройка не ограничивалась локальными участками, но затрагивала протяженные массивы нуклеосом. Включение гистона НІ не оказывало заметного влияния на перестройку хроматина. Перестройка хроматина приводила к увеличению чувствительности к ДНКазе I, диффузному профилю гидролиза микрококковой нуклеазой и повышенному транскрипционому потенциалу хроматина. Примечательно, что в то время как чувствительность хроматина к ДНКазе I возрастала, чувствительность к гидролизу микрококковой нуклеазой уменьшалась. Увеличение чувствительности хроматина к ДНКазе I, наиболее вероятно, свидетельствует о частичной дестабилизации ДНК-гистоновых взаимодействий. Более объемная, "диффузная" структура нуклеосомнои частицы может обусловливать пониженную доступность хроматина для микрококковой нуклеазы и эндонуклеаз рестрикции, расщепляющих преимущественно межнуклеосомную ДНК. Диффузная структура нуклеосомного кора должна защищать линкерную ДНК от расщепления. В случае, если массивы нуклеосом реконструированы достаточно тесно, перестройка нуклеосомных частиц может быть лимитирована пространственными ограничениями со стороны соседних нуклеосом, что объясняет зависимость структурной перестройки от количества реконструированных нуклеосом. Нельзя, однако, исключить и пониженную доступность плотно упакованных нуклеосомных массивов для факторов перестройки хроматина. Перестройка хроматина также приводила к высвобождению части сверхвитков ДНК нуклеосом и повышению конформационной подвижности нуклеосомной ДНК до 90% от подвижности свободной ДНК. ДНК совершает 1,7 отрицательных сверхвитка вокруг нуклеосомного кора, при этом нуклеосома вносит только 1 отрицательный виток в кольцевую ДНК, что объясняют компенсацией за счет "перекручивания" двойной спирали при взаимодействии с гистоновой глобулой [66,168,241]. Увеличение уровня сверхспирализации ДНК при перестройке хроматина может свидетельствовать об уменьшении такой компенсации, а следовательно, о дестабилизации ДНК-гистоновых взаимодействии. Это подтверждается и значительным увеличением конформационной подвижности ДНК. Изолированные нативные мононуклеосомы также подвергались структурной перестройке компонентами экстракта эмбрионов дрозофилы, приводящей к гиперчувствительности нуклеосом к ДНКазе І. В этом случае структурная перестройка инициировалась при дефосфорилировании белковых компонент экстракта. Таким образом, регуляция перестроек хроматина может осуществляться участием белкового фосфорилирования. Гиперацетилированные гистоны поддерживали сборку хроматина с той же эффективностью, что и немодифицированные гистоны.
Высокоаце-тилированный хроматин не отличался ни кинетикой гидролиза микрококковой нуклеазой и степенью упорядоченности массивов нуклеосом, ни эффективностью включения гистона HI, подтверждая, что ацетилирование гистонов как таковое, незначительно влияет на структуру нуклеосом. Однако, молекулярные перестройки высокоацетилированного хроматина протекали более эффективно и при значительно более плотно упакованных массивах нуклеосом. Предполагается, что одна "немодифици-рованная" нуклеосома вносит один сверхвиток в ДНК. Высокоацетилиро-ванная нуклеосома вносит такое же [138,497] или даже меньшее [51,287] количество сверхвитков, т.е. при равной степени сверхспирализации ДНК, гиперацетилированный хроматин содержит равное или большее количество нуклеосом, по сравнению с "немодифицированным". Это означает, что эффекты ацетилирования гистонов скорее уменьшены, чем преувеличены. Высокоацетилированный хроматин отличался повышенным сродством к факторам перестройки хроматина. Можно предположить, что гипер-ацетилирование гистонов вызывает некую исходную реорганизацию ДНК-белковых взаимодействий, формируя лабильную структуру нуклеосом с ослабленными ДНК-гистоновыми взаимодействиями, что способствует их перестройке белковыми факторами. Но нельзя исключить, что эффективность перестроек гиперацетилированного хроматина объясняется высоким сродством факторов перестройки к гиперацетилированным гистонам. Представляется вероятным, что описываемая перестройка хроматина является одним из этапов активации хроматина. Прямая связь ацетилирования гистонов и перестроек хроматина может лежать в основе детерминации молекулярной гетерогенности доменов хроматина in vivo. Последовательности ДНК с различной геометрией обладают различной способностью к организации в нуклеосомные структуры [232,233]. Крестообразные структуры и Z-ДНК практически не способны образовывать нуклеосомные частицы, вызывая перераспределение нуклеосом по нити ДНК ([498] и ссылки там же).
