Содержание к диссертации
Введение
2. Материал и методика
2.1. Объекты исследования 13
2.2. Иммунохимическое маркирование 15
2.3. Глиоксилатная гистохимическая реакция 20
2.4. Формальдегид-глутаральдегидная реакция 20
2.5. Внутриклеточное окрашивание.. 21
2.6. Объемная реконструкция серийных срезов 21
2.7. Электрофизиологические эксперименты, 21
2.8. Хроматография под высоким давлением (HPLC), 22
2.9. Радиоферментный анализ 22
2.10. Фармакологическая модуляция пищевого поведения 23
2.11. Фармакологическая модуляция развития 23
2.12. Регистрация поведения 24
2.13. Приготовление кондиционированной воды. 24
2.14. Измерение размеров и статистическая обработка. 25
3. Результаты исследования и обсуждение
3.1. Нейрогенез пресноводных легочных MonnwcKOB(Gastropoda, Pulmonata)..,26
3.1.1. Нормальное развитие .26
3.1.2. РМРчРамид-иммунореактивные элементы у Ьутпаеа stagnalis, Biomphalaria glabrata и Helisoma trivolvis .27
3.1.3. Экспрессия пептидов семейства FMRFамида в развитии Ьутпаеа stagnalis 33
3.1.4. Обсуждение .44
3.1.5. Серотонин-содержащи? нейроны у улиток семейств Lymnaeida и Planorbidae.,.50
3.1.6. Обсуждение 53
3.1.7. Катехоламин-содержащие нейроны и катехоламин-зависимое поведение в развитии/,, stagnalis, 55
3.1.7.1. Эмбриональное развитие 55
3.1.7.2. Постэмбриональное развитие 62
3.1.8. Обсуждение 73
3.1.9. Октопамин в эмбриональном и постэмбриональном развитии L. stagnalis, 82
3.1.10. Октопамин как регулятор пищевого поведения у L. stagnalis, 89
3.2. FMRFaMHfl-, серотонин- и катехоламин-содержащие нейроны в развитии Aplysia californica (Gastropoda, Opisthobranchea) .97
3.2.1. Обсуждение 102
3.3. Локализация серотонина и его роль у ранних зародышей Т. diomedea 105
3.4. Нейрогенез хитона Ischnochiton hakodadensis (Polyplacophora) 113
3.4.1. Нормальное личиночное развитие 113
3.4.2. РМИРамид-содержащие нейроны 114
3.4.3. Серотонин-содержащие нейроны 117
3.4.4. Колокализация иммунореактивности к FMRFa и серотонину. 121
3.4.5. Колокализация иммунореактивности к FMRFa и тубулину, 121
3.4.6. Обсуждение 123
3.5. Нейрогенез полихеты Phyllodoce maculata (Phyllodocidae) 127
3.5.1. Нормальное развитие 127
3.5.2. Серотонин-содержащие нейроны, 128
3.5.3. РМЯРамид-содержащие нейроны 131
3.5.4. Каудальный сенсорный орган 134
3.5.4. Обсуждение 137
3.6. Сенсорная природа ранних нейронов 145
3.7. Роль нейронов задней полусферы в развитии 149
3.8. Роль нейронов апикального органа в развитии 152
3.8.1. Внутривидовая химическая сигнализация в эмбриональном развитии пресноводных пульмонат: роль ранних апикальных сенсорных нейронов. 153
3.8.2. Обсуждение 161
Заключение 167
Выводы. 176
Список литературы 178
- Глиоксилатная гистохимическая реакция
- FMRFaMHfl-, серотонин- и катехоламин-содержащие нейроны в развитии Aplysia californica (Gastropoda, Opisthobranchea)
- Нейрогенез полихеты Phyllodoce maculata (Phyllodocidae)
- Сенсорная природа ранних нейронов
Введение к работе
При решении фундаментальных задач нейробиологии развития исследователи традиционно обращались к относительно просто устроенным модельным беспозвоночным. Данные последних лет, полученные нейробиологами развития с применением современных генетических и молекулярно-биологических методов при изучении эмбрионов модельных позвоночных и беспозвоночных, таких как мыши (Mus musculis), рыбы (Danio rerio), насекомые (Drosophila melanogaster) и нематоды (Caenorgabditis elegans) показали, что гены, регулирующие развитие, чаще всего являются консервативными у представителей даже далеко отстоящих таксономических групп (обзор Moody, 1999; Arendt et al., 2001, 2004). Эти открытия еще раз показали важность сравнительных исследований и подтвердили существовавшее и раньше представление о том, что фундаментальные механизмы развития едины во всем животном царстве.
Группа трохофорных животных, выделяемая по присутствию в их жизненном цикле трохофоры или трохофороподобной личинки, является одной из самых многочисленных среди Spiralia. Ее представители использовались в качестве экспериментальных моделей в различных областях биологии, и, в частности, нейробиологии. Так, доказательство роли серотонина (5НТ) как передатчика нервных импульсов было получено на садовой улитке Helix (Gershenfeld and Steni, 1965), а интегративная функция этого медиатора в поведении была продемонстрирована на медицинской пиявке Herudo (Lent, 1986) и морском моллюске Clione limacina (Сахаров, Каботянский, 1986). Пептид Phe-Met-Arg-Phe-NH2 (FMRFamide) был изначально идентифицирован как возбуждающий сердечные сокращения у моллюсков (Price and Greenberg, 1977). На морских слизнях Tritonia и Aplysia была установлена и плодотворно изучается нейрональная основа поведения, памяти и обучения (Willows, 1967; Kandel, 1979, 2001). Множество работ посвящено изучению различных аспектов функционирования дефинитивной нервной системы моллюсков и аннелид. С другой стороны, их развитие давно и успешно изучается классическими эмбриологическими методами (напр., Raven, 1966; Cumin, 1972; Anderson, 1966; Мещеряков, 1975), которые затрагивают в числе прочих и развитие нервной системы. Тем не менее данные о нейрогенезе, и особенно о самых ранних его этапах, немногочисленны и порой противоречивы, а функции ларвальных нейронов все еще остаются на уровне предположений, и в большинстве случаев не имеют экспериментального подтверждения.
В последнее время все большее признание получает концептуальная модель функциональной значимости множественности нейротрансмиттеров (Сахаров, 1990).
Накапливаются факты, доказывающие, что поведение является трансмиттер-зависимым, то есть определенный трансмиттер может индуцировать комплексную интегрированную программу поведения целого организма (Livingstone et al., 1980; Rravitz, 1983; Sakharov, 1990). Однако вопрос о том, являются ли морфогенетические программы также трансмиттер-зависимыми, остается открытым. Было показано, что трансмиттеры присутствуют и являются функционально значимыми на ранних «донервных» стадиях развития (Бузников, 1987; Buznikov et al., 2001). Для более поздних стадий развития известно участие серотонина в метаморфозе и регуляции биения ресничек личинок (см. ссылки в главах 1.3 и 1.4). Период начальных этапов формирования нервной системы никогда не изучался с точки зрения участия нервных передатчиков в нейро- и онтогенезе.
Личинки трохофорных животных представляют удобную модель для решения подобных задач, так как обладают нервной системой, в которой представлено большинство медиаторов, характерных для дефинитивной ЦНС, и котороя, в то же время, состоит из небольшого числа нейронов (десятки), каждый из которых может быть идентифицирован.
Глиоксилатная гистохимическая реакция
Представленные в литературе данные о раннем нейрогенезе этой группы хотя и имеют более длительную историю, тем не менее малочисленны и во многом противоречивы. Клайненберг впервые описал нервную систему поздней трохофоры аннелиды Lopadorhynchus как состоящую из протрохального нерва, четырех больших мультиполярных нервных клеток и зачатка взрослого мозга в эписфере, и дорзо-медиального нерва в гипосфере (Kleinenberg, 1886). Однако впоследствии Майер (Meyer, 1901) и Бючли (Butschli, 1912) описали сложный ортогон, состоящий из протрохального кольца, трех кольцевых нервов в эписфере, одного кольцевого нерва в гипосфере, и, как минимум, семи продольных нервов. Именно это описание ранней нервной системы аннелид вошло впоследствии во многие основные труды по сравнительной эмбриологии нервной системы (Беклемишев, 1964; Bullock and Horridge, 1965). Однако довольно быстро представление об ортогоне было опровергнуто. Все последующие исследователи описывают высокоцентрализованную нервную систему, состоящую из апикального органа, зачатков дефинитивного мозга в эписфере, выходящих из него в ростро-каудальном направлении продольных нервов, протрохального и окологлоточного колец (Akesson, 1967; Lacalli, 1984; Zavarzina and Tzetlin, 1991; Hay-Schmidt, 1995). He существует также единого мнения по вопросу о взаимоотношении ранней (личиночной) и дефинитивной (взрослой) нервной системы. В литературе представлены две, диаметрально противоположных точки зрения.
Так, согласно одной, дифинитивная нервная система развивается совершенно независимо от личиночной, возникает из других источников, и ее нервы следуют по собственным, отличным от личиночных нервов, путям (Lacalli, 1984). В соответствии с другой точкой зрения большая часть личиночной нервной системы переходит во взрослую (Marois and Carew, 1990; Barlow and Truman, 1992; Zavarzina and Tzetlin, 1991; Hay-Schmidt, 1995; Сотников и др., 1994). Для решения этих вопросов выявление самых ранних нервных элементов и выяснение их судьбы в развитии является принципиально важным. Первые попытки изучения зародышей беспозвоночных относятся к концу XVII века и начинаются с описания явлений, доступных простому наблюдению, а именно, с описания двигательных реакций. Еще Сваммердам (Swammerdam, ум. 1685) в своей книге «Библия природы» приводит данные о многочисленных наблюдениях, произведенных им над эмбрионами различных улиток. Автор указывает, что еле заметные на глаз зародыши улиток производят внутри яйца быстрые вращательные движения. Несколько позже и независимо от него аналогичное открытие обнародовал Левенгук (Lewenhock, 1722). В письме от 1 октября 1695 г., озаглавленном «О разоблачении тайн природы», Левенгук сообщает, что он с большим удивлением наблюдал, как непоявившиеся на свет зародыши моллюсков (Mollusquas acephales) с регулярностью совершают в яйце вращательные движения. «На каждом нерожденном моллюске, которого мы видели, - пишет Левенгук, - мы наблюдали эти феномены, которые были недоступны нашему разуму.» Эти наблюдения голландских исследователей в течение многих десятилетий оставались неизвестными, и подобные сообщения в более позднее время все еще принимались за новые открытия.
Так, Штибель (Stiebel, 1815) описал у зародышей прудовой улитки (Lymnaea stagnalis) две формы ритмических движений: 1) вращение зародыша вокруг собственной оси, без изменения положения в яйце, и 2) круговые движения зародыша с изменением положения в яйце. Первый тип движения возникает на 4-5-й день, а второй на 6-7-й день эмбриональной жизни; позже оба типа движений длительное время сосуществуют. В том же направлении Карус (Cams, 1828) произвел многочисленные исследования на эмбрионах различных видов моллюсков (Unio, Anodonta, Lymnaea, Paludina и др.). Автор заметил, что ротаторные движения наблюдаются у эмбрионов на очень ранней стадии развития. Такие движения, когда эмбрион движется in toto без изменения своей формы, в дальнейшем были предметом специального изучения многих авторов, они были описаны не только у многочисленных видов моллюсков, но и у других представителей мягкотелых (см. обзор Волохов, 1951). О причине этих движений в первое время ничего не было известно. Для объяснения их выдвигались самые невероятные предположения, порой даже мистического порядка. Правильное объяснение этим явлениям дал Грант (Grant, 1827), установив при изучении эмбрионов гастропод, что причиной вращения эмбриона является мерцание ресничек, расположенных на поверхности тела зародыша. Такое мерцательное движение считали первым признаком жизни эмбриона, так как оно появлялось значительно раньше, чем биения сердца.
В дальнейшем было показано, что у зародышей Lymnaea stagnalis на определенной стадии развития, на фоне пассивных вращательных движений, формируются активные вытягивания головы и ноги, которые усиливаются по мере развития и приводят к разрыву окружающих оболочек и выходу из яйца. Прейер (Ргеуег, 1885) в своей монографии «Specielle Physiologie des Embryo» подробно излагает данные различных авторов о развитии подвижности у зародышей различных беспозвоночных. В то время вопрос о зависимости активных движений от развития нервной системы был не выяснен. Считалось, что активные сократительные движения появляются за счет автоматической деятельности эмбриональной мускулатуры, и лишь в дальнейшем появляются самостоятельные реакции, осуществляемые при участии ганглиев нервной системы (см. обзор Волохов, 1951). В настоящее время общепринято, что именно личиночная нервная система осуществляет регуляцию и координацию двигательной активности личинок. Поведенческий репертуар личинок небогат и включает в себя, в основном, два типа ответов на внешние раздражители: 1) изменение частоты биения ресничек прототроха и\или ресничных шнуров, 2) мышечные сокращения тела и глотки. Давно известно, что паузы в биении ресничек появляются тогда, когда к ресничным клеткам подрастают нервные окончания. Последующие исследования установили, что реснички велюма у личинок некоторых моллюсков и аннелид иннервируются нейронами личиночного апикального органа (см., напр., Lacalli, 1984; Marois and Croll, 1992; Kempf at al., 1992, 1997). Экспериментально было показано, что экзогенный серотонин активируют локомоторные реснички личинок морских моллюсков (Koshtoyants et al., 1961; Diefenbach et al., 1991; Berias and Widdows, 1995). На зародыше пресноводной Helisoma установлено, что апикальные серотонинергические клетки усиливают выделение серотонина в ответ на гипоксию, вследствие чего ускоряется вращение зародыша внутри яйца (Goldberg and Kater, 1989; Diefenbach et al., 1991, 1995, 1998; Koss et al., 2003).
Автору не удалось найти в литературе данные об участии других нейронов развивающейся нервной системы в двигательных реакциях личинок. Апикальный орган (АО) - клеточное образование плавающих личинок многих беспозвоночных животных, которое формируется с началом плавания и редуцируется после метаморфоза. АО имеется у представителей даже таких таксонов, которые считаются неродственными. Личинки, развитие которых модифицировано тем, что они не плавают и проходят метаморфоз внутри яйцевых оболочек, сохраняют свой АО. При всем многообразии форм развития беспозвоночных, АО неизменно расположен на аборальном полюсе личинки и включает султанчик чувствительных ресничек и лежащий в его основании комплекс сенсорных нейронов (например, Conklin, 1897; Беклемишев, 1964; Иванова-Казас, 1977; Nielsen, 2001). Уникальная эволюционная законсервированность АО свидетельствует о том, что он выполняет какую-то консервативную функцию, общую для разных личинок. Десятилетия сравнительных и экспериментальных исследований не привели к формированию аргументированного взгляда на назначение АО. Про апикальный орган
FMRFaMHfl-, серотонин- и катехоламин-содержащие нейроны в развитии Aplysia californica (Gastropoda, Opisthobranchea)
На стадии трохофоры, в середине второго дня развития, появляются две биллатерально симметричных пары задних клеток с FMRFaMHfl иммунореактивностью (FMRFa-ИР, Рис. 51 А, 52А). Отростки отходят ипсилатерально и вперед от тел правых (F-rl и F-r2) и левых (F-U и F-12) клеток (Рис. 51 А). На третий день эти отростки образуют сеть в области непосредственно под апикальным султанчиком ресничек (см. день 4, Рис. 51В, 52В, D). Кроме того, на третий день один или два дополнительных FMRFa-ИР отростка пересекают среднюю линию тела непосредственно впереди тел задних FMRFa-ИР клеток (см. день 4, Рис. 51В, 52D). Первоначально пары FMRFa-ИР клеток расположены симметрично, но они постепенно смещаются и к концу четвертого дня все переходят на правую половину тела (Рис. 51С). FMRFa-ИР клетки и отросткитакже выявляются при помощи антител против ЕРЬРЛамида (Рис. 52С). Антитела против SEEPLY и АСР не выявляли никаких структур ни на этой, ни на более поздних стадиях развития. На стадии раннего велигера (пятый день развития) клетки с FMRFa-ИР смещаются в переднюю часть эмбриона. Клетки F-rl и F-r2 двигаются на дорзальную сторону и друг от друга, причем F-rl занимает более дорзальное положение. Клетки F-ll и F-12 остаются рядом друг с другом и занимают позицию в цент ре и вентрально (Рис. 51С, 53А). Их отростки, идущие вперед, пересекают среднюю линию и формируют комиссуру в передней части тела. Все эти клетки и отростки были также идентифицированы при использовании антител против ЕРЬШамида (Рис. 53В). Кроме того, на пятый день под апикальным султанчиком появляется непарная срединная серотонин-иммунореактивная клетка (SUM). Вскоре после этого, справа и слева от клетки SUM появляется пара булавовидных 5-НТ иммунореактивных клеток (S-rl и S-11).
Короткие отростки отходят вентрально от клеток SUM, S-rl и S-ll и образуют сеть в том же районе, где находится FMRFa-ИР комиссура (см. день 9, Рис. 54А, 55А, В) На седьмой день к трем имеющимся 5-НТ клеткам (SUM, S-rl и S-ll) присоединяется еще одна пара 5-НТ клеток (S-r2 и S-12), которые расположены по обеим сторонам сети слегка постериовентрально по отношению к клеткам S-rl и S-11 (см. день 9, Рис. 54А, 55А, В). У позднего велигера перед вылуплением (восьмой день) задние FMRFa-ИР клетки и отростки оказываются непосредственно впереди от середины тела вдоль передне-задней оси. Клетки F-11 и F-12 занимают положение вентрально и центрально, в то время как клетки F-rl и F-r2 занимают боле дорзальное положение, чем раньше (см. день 9, Рис. 5ID, 53С). FMRFa-ИР отростки отходят от апикальной комиссуры вентрально к ноге. Кроме того, на восьмой день в районе ноги наблюдалась реакция FaGlu, свидетельствующая о наличии катехоламин-содержащих клеток.
Эти клетки имеют булавовидную форму и располагаются двумя биллатерально симметричными группами по 2-3 клетки в каждой (см. день 9, Рис. 54В, 56А, В). На девятый день появляются дополнительные FMRFa-ИР клетки, которые расположены в областях, ранее идентифицированных как развивающиеся ганглии дефинитивной ЦНС - церебральные, педальные и плевральные - у аплизии (Kriegstein, 1977; Marois and Carew, 1990; 1997b) и других заднежаберных моллюсков (Kempf et al., 1997). Одна из этих FMRFa-ИР центральных клеток (FC-1) появляется около клетки F-rl, другая (FC-2) расположена около клетки F-r2, а третья (FC-3) появляется слева от апикальной комиссуры (Рис. 5 ID, 53С). Кроме этого, на девятый день число катехоламин-содержащих клеток на каждой стороне ноги увеличивается до 4-5 (Рис. 54В, 56А,В). Еще одна пара катехоламин-содержащих клеток расположена в районе рта. Отростки отходят от всех этих клеток в район под апикальным султанчиком ресничек, где расположены FMRFa-ИР комиссура и 5-НТ иммунореактивная сеть из отростков. Здесь выявляются три катехоламин содержащие клетки (Fig. 56В). Две из них (СС-1, СС-2) справа и одна (СС-3) слева. К сожалению, реакция FaGlu не позволила определить, локализованы эти клетки в апикальном органе или в развивающихся церебральных или педальных ганглиях взрослой ЦНС, в силу того, что наблюдалась сильная фоновая флуоресценция. Серотониновые отростки на этой стадии идут к велюму, в ногу и в заднюю часть тела (Рис. 54А, 55А). На стадии ранней трохофоры у A. californica в задней области появляются две пары FMRFa иммунореактивных клеток, которые посылают отростки вперед. FMRFa иммунореактивность была обнаружена в каудальной части ранних эмбрионов других гастропод, хотя число и расположение этих клеток различно. Lymnaea stagnalis (Croll and Voronezhskaya, 1995, 1996a,b) и Crepidula fornicata (Dickinson et al., 1999) имеют no одной медиальной FMRFa иммунореактивной клетке в задней части тела около раковинной железы. У эмбрионов аплизии подобная клетка не обнаружена. Тем не менее, мы не исключаем возможности того, что мы ее не заметили, если она существовала только в короткий период развития и/или не была реактивной к используемым нами антителам. У прудовика на стадии велигера появляются дополнительные FMRFa иммунореактивные задние клетки справа и слева по ходу отростков, отходящих от задней медиальной клетки (Croll and Voronezhskaya, 1995, 1996а). Эти левая и правая клетки у прудовика могут соответствовать левой и правой паре FMRFa иммунореактивных задних клеток у A. californica. У С. fornicata FMRFa иммунореактивные клетки с подобной латеральной локализацией обнаружены не были (Dickinson et al., 1999). Судьбу ранних каудальных клеток аплизии нам проследить не удалось.
С уверенностью можно сказать, что они не входят в состав формирующихся центральных ганглиев. Несмотря на различия в числе и расположении задних FMRFa иммунореактивных клеток у разных видов, они имеют общие черты. У всех видов эти клетки появляются раньше всех других нервных элементов. Кроме того, они всегда посылают вперед отростки, которые поворачивают, сливаются или ветвятся в местах формирования будущих ганглиев изаканчиваются в районе будущих педальных ганглиев. И у А. californica, и у С. fornicata FMRFa иммунореактивные отростки также обнаруживаются под основанием апикального султанчика ресничек на стадии трохофоры. В этой области позднее появляется апикальный сенсорный орган, подстилающая его церебральная комиссура, или обе эти структуры (Marois and Carew, 1997а,с).
Даже на ранних стадиях развития в этом районе обнаруживается развитая сеть из иммунореактивных отростков. Мы не обнаружили других иммунореактивных клеток на этих стадиях, однако не можем исключить возможность того, что часть отростков отходит от каких-то иных клеток. Действительно, на ранних эмбриональных стадиях L. stagnalis обнаружены FMRFa иммунореактивные отростки, многократно ветвящиеся под апикальной пластинкой, которые отходят от лежащих рядом клеток, появляющих очень слабую иммунореактивность или ее полное отсутствие (Croll and Voronezhskaya, 1996а). Паттерн экспрессии пептидов семейства FMRFamide также похож у вышеупомянутых моллюсков. И yL stagnalis, и у A. californica, клетки и отростки, экспрессирующие FMRFamide- и EFLRIamide подобную иммунореактивность расположены сходным образом (Voronezhskaya and Elekes, 1997). Антитела против пептидов SEEPLY и acidic peptide, которые оба образуются из одного предшественника семейства FMRFamide у L. stagnalis, не выявляют ничего у эмбрионов A. californica. Сиквенс пептида SEEPLY идентичен у L. stagnalis и A. californica (Greenberg and Price, 1992). Мы не обнаружили этого пептида у A. californica. Также мы не обнаружили этого пептида в FMRFamide иммунореактивных клетках у эмбрионов L. stagnalis. Напротив, acidic peptide не был выделен из A. californica. Поэтому, отсутствие позитивной иммунореакции против этого пептида может иметь причиной видоспецифичность аминокислотной последовательности. 5-НТ иммунореактивные клетки в апикальном органе A. californica были детально изучены ранее (Marois and Carew, 1997a,b,c; Kempf et al., 1997). И, хотя мы не обнаружили другие, не 5-НТ-ергические апикальные клетки, их присутствие в апикальном органе аплизии было показано при электронно-микроскопическом изучении этого органа (Marois and Carew, 1997b). Булавовидные клетки с FMRFaMHflHofi иммунореактивностью были идентифицированы в апикальной области легочной улитки L. stagnalis (Croll and Voronezhskaya, 1996a), переднежаберной улитки С. fornicata (Dickinson et al., 1999) и заднежаберной Phestilla sibogae (Kempf et al., 1992). Возможно апикальные нейроны продуцируют другие нейромедиаторы или пептиды на более поздних стадиях развития аплизии. Катехоламинсодержащие клетки обнаружены в ноге аплизии. Похожие клетки имеются в ноге гастропод L. stagnalis (Voronezhskaya et al., 1999) и С. fornicata (Dickinson et al., 1999), а также у двустворчатых моллюсков Mytilus edulis и Placopecten magellanicus (Croll et al., 1997).
Эти клетки возможно участвуют в метаморфозе, поскольку известно, что катехоламины модулируют или индуцируют метаморфоз у гастропод (Pires et al., 2000) и двустворок (Coon and Bonar, 1986). Клетки с похожей локализацией были обнаружены у заднежаберного моллюска Onchidoris bilamellata и было показано, что они реагируют на химические стимулы, индуцирующие метаморфоз (Arkett et al., 1989). У эмбрионов аплизии катехоламинергические клетки были также обнаружены около рта. Эти клетки схожи с таковыми, найденными у различных пульмонат, переднежаберных и двустворок (Croll et al., 1997; Dickinson et al., 1999; Voronezhskaya et al., 1999). Роль этих клеток в развитии также неизвестна, хотя заманчиво предположить, что они участвуют в регуляции пищевого поведения, которое на этих стадиях уже достигает достаточной степени сложности (Baldwin and Newell, 1995). Мы предполагаем, что часть из клеток, появляющихся на более поздних стадиях развития, принадлежит к развивающимся центральным ганглиям. Считалось, что в нервной системе Opisthobranchea торзион, то есть поворот ганглиев висцеральной дуги с образованием восьмеркообразной фигуры, отсутствует, так как нейрогенез начинается только после завершения торзиона, которому подвержены другие органы развивающейся личинки (Kandel et al., 1981). Действительно, возникающие у велигера зачатки ганглиев, и развившаяся впоследствии дефинитивная нервная система у этих моллюсков имеют выраженную билатеральную симметрию (Kriegstein, 1977; Schacher et al., 1979). В нашем исследовании обнаружены клетки и отростки, появляющиеся в развитии до начала торзионного процесса. Следует отметить, что первоначально расположенные симметрично, клетки постепенно сдвигаются на правую сторону, а их отростки, хотя и не перекрещиваются, но образуют перекрученную восьмеркообразную петлю. То есть, в развитии ранних нервных клеток присутствует, хотя и в нерезко выраженной форме, и торзион, и деторзион, ранее только предположенные для Opisthobranchea на основании филогенетических исследований. Таким образом, в процессе эмбрионального развития заднежаберного брюхоногого моллюска Aplysia californica формируется хорошо развитиая личиночная нервная система. Она включает задние БМКРамид иммунореактивные клетки, появляющиеся на стадии трохофоры. На стадии велигера появляются 5-НТ иммунореактивные клетки в апикальном огане, а незадолго до вылупления появляются катехоламинсодержащие клетки вокруг рта и в ноге. Первые нейроны в развивающихся ганглиях дефинитивной ЦНС появляются на более поздних стадиях. Такая организация нервных элементов схожа с тем, что было обнаружено нами у репрезентативных представителей легочных гастропод.
Нейрогенез полихеты Phyllodoce maculata (Phyllodocidae)
Первая клетка, иммунореактивная к серотонину (5-НТ-ир), появляется через 36 часов после начала развития задолго до вылупления. Это одиночный нейрон, расположенный на каудо-дорзальном конце тела зародыша (первый серотонинергичес-кий задний, first serotonergic posterior, spl на Рис. 69А). Клетка имеет овальную форму, размеры примерно 15x9 мкм и два тонких отростка, отходящих от базальной части сомы и идущих на вентральную сторону параллельно вдоль правой и левой стороны теда зародыша. На концах отростков ясно различимы конусы роста. Когда конусы роста достигают вентральной стороны трохофоры, они поворачивают и начинают рост в направлении переднего конца тела. Через 44 часа отростки достигают прототроха, каждый отросток раздваивается, одна из ветвей направляется дорзально, а другая вентрально под прототрохом (Рис. 69В).
Таким образом, соответствующие ветви каждого отростка растут навстречу друг другу. Антитела против ацетилированного тубулина также маркировали нейротрубочки в отростках этой клетки, но не выявляли на этой стадии развития никаких других клеточных отростков, поэтому мы вполне уверены, что эта клетка spl является самым первым нейроном, дифференцирующимся в процессе развития. серотонинергическая латеральная клетка; spl, sp2, первая и вторая серотонинергическая задняя клетка; рп, нерв прототроха; треугольники, первые претрохальные меридианальные нервы, соединяющие апикальный орган с нервом прототроха (41x1.25 мкм). F. 60 часов, вид с вентральной стороны; sll, первая серотонинергическая латеральная клетка; spl, sp2, первая и вторая серотонинергичес-кие задние клетки; spt, серотонинергическая претрохальная клетка, расположенная на меридианальном нерве (35x1.25 мкм). Линейки: 20 мкм. Через приблизительно 46-48 часов еще два нейрона появляются на дорзальной стороне тела эмбрионов. Их тела расположены под прототрохом - одна слегка впереди, а другая слегка позали него (серотонинергические дорзальные, serotonergic dorsal, sdl, sd2, Рис. 69C). Базальные отростки этих клеток идут вентрально направо и налево под прототрохом. Вместе с отростками нейрона spl они образуют кольцевой пучок нейритов, подстилающий прототрох (нерв прототроха, рп, Рис. 69D).
Через 48-50 часов первые серотонин иммунореактивные клетки появляются в апикальном органе (первые апикальные серотонинергические, first serotonergic apical, sal, Рис. 69D). Незадолго до вылупления (50-60 часов), количество серотонин иммунореактивных клеток начинает быстро увеличиваться. Четыре-шесть клеток обнаруживаются в апикальном органе, еще одна клетка появляется на заднем конце тела зародыша (серотонинергическая задняя, serotonergic posterior, sp2, Рис. 69Е), а также от двух до четырех клеток вокруг ротового отверстия (Рис. 69E,F). Одиночная сенсорная клетка, посылающая базальный отросток в апикальный орган всегда расположена на левом боковом меридианальном нерве (серотонинергическая претрохальная, serotonergic pretrochal, spt, Рис. 69F), а другая сенсорная клетка всегда обнаруживалась на правой стороне в гипосфере (серотонинергическая латеральная, serotonergic lateral, sll, Рис. 69E,F). Таким образом, эти нейроны делают нервную систему ассиметричной. Ко времени вылупления серотонин иммунореактивные волокна выявляляются в шести меридианальных претрохальных нервах, соединяющих апикальный орган с кольцевым нервом прототроха, окологлоточном нервном кольце и паре вентральных стволов.
У вылупившихся трохофор (60-70 часов от начала развития) практически не появляется новых серотонин иммунореактивных нейронов. В эписфере видны те же четыре нейрона апикального органа (Рис. 70А), хотя иногда тут выявляются еще два нейрона со слабой иммунореакцией. В гипосфере видны нейроны spl, sp2 и sll, а также три-четыре сенсорных нейрона впереди, позади и слева от ротового отверстия. Эти нейроны иннервируют область рта (Рис. 70В,С). На более поздних стадиях также не происходит больших изменений. Лишь появляется несколько дополнительных клеток между прототрохом и ртом, а также начинает увеличиваться количество иммунопозитивных волокон в формирующейся дефинитивной нервной системе (церебральном ганглии, нерве прототроха, вентральных стволах и окологлоточном кольце) (Рис. 70C,D). На стадии поздней трохофоры - ранней метатро-хофоры (5 дней после вылупления) количество иммунопозитивных отростков в дефинитивной нервной системе многократно увеличивается (Рис. 70E,F). Сохраняются только три претрохальных нерва — тонкий медианный нерв {тп, Рис. 70E,G) и два вентро-латеральных нерва, которые объединяются с претрохальной частью вентральных стволов. Вдоль вентральной области нерва прототроха перед ротовым отверстием (Рис. 70E,G), а также в задней части тела (Рис. 70Е,Н) появляются дополнительные нейроны. Иммунореакция в дорзальных клетках sdl и sd2 становится очень слабой, но все еще различимой (Рис. 701). Первая FMRFa иммунореактивная клетка появляется через примерно 48 часов после начала развития в апикальном органе (FMRFamidergic apical, fal, Рис. 71 А), а вскоре (52 часа) там же добавляются еще 3 клетки (fa 2-4, Рис. 71В). Базальные отростки этих клеток образуют компактный сферический нейропиль из варикозных отростков. В это же время крупная клетка с двумя апикальными сенсорными отростками появляется на вентральной стороне эписферы, слегка смещенно на левую сторону зародыша (FMRFamidergic ventral, Jvl, Рис. 71С). Отростки, отходящие от базальной части этой клетки идут направо и налево под прототрохом. Через 58 часов после начала развития две сенсорные клетки появляются на заднем конце тела эмбриона, одна правее, а другая девее средней линии.
Базальный отросток клетки, расположенной справа (FMRFamidergic posterior, fpl, Рис. 7ID) идет вперед вдоль вентральной части правой стороны тела в область апикального органа, поворачивает налево, пересекает продольную ось тела в основании апикального органа и идет обратно по левой стороне тела. Отростки левой клетки (fp2, Рис. 7IE) образуют кольцо вокруг ротового отверстия. У трохофор непосредственно перед вылуплением (60 часов) базальные отростки клеток fpl, fp2, и Jvl) очерчивают контур нерва прототроха, церебрального ганглия, вентральных стволов и окологлоточного нервного кольца, в то время как нейроны апикального органа посылают отростки только в пределах апикального нейропиля (Рис. 7IF). В течение первых десяти часов после вылупления количество FMRFa иммунореак-тивных нейронов не изменяется, хотя количество отростков в гипосфере постепенно увеличивается (Рис. 72АВ). Отростки нейронов апикального органа наконец прорастают за его пределы и образуют контакт с теми частями нервной системы, которые расположены позади апикального органаю Через 20 часов после вылупления появляется еще одна клетка связанная с апикальным органом. Она расположена на дорзальной стороне эписферы и слегка смещена на правую сторону (FMRFamidergic dorsal, fdl, Рис. 72С). Таким образом, число иммунореактивных к FMRFa нейронов в апикальном органе достигает семи (Рис. 72D). Нейропиль апикального органа выглядит как компактное скопление варикозных отростков, имеющее сферическую форму (Рис. 72Е). Еще одна клетка появляется на заднем конце тела. Она связана с окологлоточным нервным кольцом (FMRFamidergic posterior, .?, Рис. 72F). На более поздних стадиях развития происходит постепенное увеличение количества иммунореактивных волокон в развивающейся дефинитивной нервной системе — церебральном ганглии, вентральных стволах и окологлоточном кольце. В то же время вплоть до 5 дней после вылупления набор иммунопозитивных нейронов оставался неизменными - восемь клеток, связанных с апикальным органом, вентральная клетка jvl и три задние клетки fpl-Jp3 (Рис. 72G-I)
Сенсорная природа ранних нейронов
Подробно исследовалась морфология ранних нейронов у личинок хитона Ischnochiton, морской гастроподы Tritonia, пресноводных гастропод Lymnaea и Helisoma и морской полихеты Phyllodoce.
У хитона на ранних стадиях (24-30 часов после оплодотворения) все выявляемые нейроны расположены в эписфере. К ним относятся: 5-НТ-ИР (as 1-4) и FMRFa-ИР (as 7-14) клетки апикального органа; две пары латеральных клеток (г/7-2 и И 1-2), которые проявляют иммунореактивность и к 5-НТ, и к FMRFa; 5-НТ-ИР вентральные и дорзаль-ные клетки (vs 1-4, ds 1) (Рис. 76А, В). Многочисленные булавовидные апикальные клетки все имеют короткий дендрит, выходящий на поверхность и несущий пучок ресничек (Рис. 65 в главе 3.4.5). Латеральные клетки овальной формы и все имеют хорошо развитую ампулляторную полость, которая занимает дистальную половину клетки и соединяется с окружающей средой через пору. Ампула содержит множество ресничек, выходящих из внутренних стенок и расположенных перпендикулярно к поверхности эпителия (Рис. 76С). Вентральные и дорзальные клетки имеют короткий дендрит, выходящий на поверхность и несущий пучок ресничек (Рис. 76D).
У тритонии на стадии трохофоры - раннего велигера три 5-НТ-ИР клетки обнаруживаются в районе апикального органа и две пары FMRFa-ИР клеток в задней части зародыша вентрально, недалеко от зачатка раковины (Рис. 76Е). Из трех апикальных клеток две имеют булавовидную форму, короткий дендрит выходит на поверхность и заканчивается пучком ресничек. Каждая из задних FMRFa-ИР клеток биполярна, длинный отросток идет вперед в апикальную область, короткий отросток выходит на поверхность и несет пучок длинных ресничек (Рис. 76F, G). У эмбрионов прудовика на стадиях, соответствующих трохофоре и велигеру (стадии 19-24) выявляются: две клетки в апикальной области, проявляющие иммунореактивность к пептидам семейства FMRFa, ферменту синтеза катехоламинов — тирозин гидроксилазе и 5-НТ; а также 3-4 клетки в задней полусфере, иммунореактив-ные к FMRFa. Апикальные клетки булавовидной формы имеют короткий дендрит, выходящий на поверхность и несущий щеточку коротких ресничек (Рис. 85, 87 в главе 3.1.8). Из клеток задней полусферы две расположены латерально, справа и слева приблизительно в средней части тела эмбриона (г- и 1-EFAP). Они имеют характерную звездчатую форму. Ни один из их отростков не выходит на поверхность и не имеет ресничек. У 78% исследованных особей обнаруживается одна и у 22% две каудальные клетки (c-EFAP). В 31% случаев каудальные клетки расположены строго по центру формирующейся раковины, в 40% случаев смещены вправо и в 29% смещены влево. У эмбрионов катушки время появления и расположение ранних нейронов сходны с таковым у прудовиков, за исключением следующих небольших отличий. Так, сенсорные апикальные нейроны катушки экспрессируют исключительно 5-НТ-иммунореактивность, и их длинные отростки идут в ногу и обильно ветвятся под эпителием ресничных полей (Рис. 85 и 87 в главе 3.1.8). Латеральные звездчатые клетки имеют большее число филлоподий-подобных коротких отростков, которые не несут ресничек. Выявляется 3-5 каудальных клеток, при этом одна из них всегда больше по размеру, смещена влево относительно раковины, и только она одна имееткороткий дендрит, выходящий на поверхность и несущий щеточку коротких ресничек. У трохофоры филлодоце в задней полусфере расположены одна 5-НТ- и две FMRFa-ИР клетки (spl, fpl, fp2) , а по экватору две 5-НТ- и одна FMRFa-ИР клетки (sdl, sd2, jvl). У всех 5-НТ-ергических клеток короткий отросток несет одну-две длинные реснички, а у FMRFa-ергических — густые пучки из ресничек средней длины (Рис. 77). В апикальном органе выявляются 4-6 5-НТ-ИР и 4 FMRFa-ИР клетки. Как минимум, два из 5-НТ-ИР апикальных нейронов имеют характерную булавовидную форму и короткий дендрит, выходящий на поверхность (Рис. 68 и 69 в главе 3.5.2). Все FMRFa-ИР апикальные нейроны (fa 1-4) имеют характерную булавовидную форму и короткий дендрит, выходящий на поверхность и несущий реснички (Рис. 70 в главе 3.5.3, Рис. 77).
Апикальные нейроны у всех перечисленных видов расположены субэпителиально, большей частью имеют булавовидную форму и несут реснички, выходящие на поверхность, что позволяет считать их сенсорными. У всех изученных видов апикальные клетки экспрессируют серотонин. У прудовика эти клетки содержат также дофамин и пептид семейства FMRFa. У хитона и филлодоце 5НТ и FMRFa экспрессируются в разных апикальных клетках. Другие ранние нейроны большей частью расположены в задней полусфере. У морских трохофор все, а у пресноводных как минимум несколько клеток имеют дендрит с ресничками, выходящими на поверхность, то есть, являются сенсорными. У всех моллюсков каудальные (а в случае хитона латеральные) клетки содержат пептид семейства FMRFaMHfla. В ранних клетках полихеты филлодоце экспрессируется как FMRFa, так и серотонин, причем всегда в разных нейронах.
Таким образом, все ранние нейроны в развитии личинок изученных групп трохофорных животных являются сенсорными, о чем свидетельтствует наличие ресничек на апикальном конце дендрита или в ампульной полости (в случае латеральных клеток личинки хитона). Вероятнее всего, они являются хемосенсорными, так как не обладают признаками, характерными для сенсорных нейронов другой модальности (Шепперд, 1987), и несут черты, характерные для хемосенсорных нейронов (Croll, 1983). Место расположения, форма и медиаторное содержание ранних сенсорных клеток и ход их отростков различаются у трохофор разных видов. Таким образом, гомология ранних нейронов у трохофор полихет и моллюсков находится под вопросом. Вероятно, у различных трохофорных животных эти нейроны не гомологичны, но имеют сходные функции.
Среди всех изученных нами личинок только у трохофоры Phyllodoce самый первый нейрон (каудальный нейрон spl, см. главу 3.5) содержал 5-НТ. Это дало нам возможность фармакологически модулировать его активность и действие на мишени. Для этого личинок инкубировали в растворах: 5-НТ (50 и 100 мкМ), 5НТР (0,5 и 1 мМ), парахлорфенилаланина - блокатора синтеза серотонина (10 и 20 мкМ), миансерина -антагониста рецепторов серотонина широкого спектра действия (100 мкМ). Концентрации
