Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Свободнорадикальные процессы в нормальном развитии амфибий 48
1.1 Топография свободнорадикальных реакций в нормально развивающемся зародыше 48
Материал и методы 48
Региопалыюсть свободнорадикальных реакций в зародышах амфибий (результаты и обсуждение) 55
Биохимическая гетерогенность цитоплазмы зиготы и пространственная организация раннего развития 58
Изменение скорости пролиферации - первое приложение «паттерна» ооплазматической сегрегации 59
«Метаболическая разметка» яйца и процессы детерминации 60
Распределения митотической активности и концентраций ядер в развивающемся зародыше 63
1.2. Изменения общего уровня свободнорадикальных реакций во время зародышевого и личиночного развития травяной лягушки 65
1.3. Субклеточная локализация свободиорадикальных реакций в эмбриогенезе бесхвостых амфибий 66
Материал и методы 66
Результаты и обсуждение 68
1.4. Биохимические субстраты свободнорадикальных реакций 70
1.5. О возможных механизмах участия СР-процессов в регуляции эмбриогенеза 77
1.6. Временная организация свободнорадикальных процессов в развитии амфибий 83
Становление суточного ритма СР-процессов в эмбриогенезе 83
Время как фактор развития 84
Заключение, Параметры порядка в эмбриогенезе. Роль СР-реакций в процессе самоорганизации 87
Глава 2. Механизмы чувствительности эмбриональных клеток к повреждающим факторам 91
Введение 91
2.1. Радиочувствительность зародышей и личинок травяной лягушки 92
2.2. Чувствительность эмбриональных зачатков к локальному лазерному облучению 97
2.3. Чувствительность зародышей к химическим воздействиям 107
2.4. Гравитационная чувствительность зародышей амфибий 112
Клиностатирование зародышей амфибий различного возраста 112
Возможные причины аномалий развития 116
2.5. Чувствительность зародышей амфибий к сверхмалым дозам биологически активных веществ 123
2.6. Модификации морфогенеза как средство изучения механизмов развития 125
2.7. Развитие стрессовой реакции во времени 126
Заключение 130
Глава 3. Способы биотестирования загрязнений водной среды на основе метаболического критерия и принципы эмбриомониторинга 131
Введение 131
3.1. Методологический подход: биоиндикация загрязнения водной среды по метаболическому критерию 132
3.2. Регламент биотестирования 141
3.3. Проведение токсикологических исследований на дафниях 143
3.4. Определение концентрационных зависимостей эффекта метилурацила фармакопейного на показатели физиологического состояния дафний: уровень свободнорадикальных реакций, скорость роста и плодовитость 145
Заключение 149
3.5. Применение метода привитой сополимеризации для оценки загрязнения водной среды на примере легочных моллюсков 150
3.6. Морские и пресноводные биотесты 155
3.7. Метаболический критерий для оценки жизнеспособности репродуктивного материала ценных видов рыб после криоконсервации 160
3.8. Принципы эмбриомониторинга водной среды 163
Глава 4. Биотестирование природных водоисточников на основе метаболического критерия 165
4.1. Биотестирование сточных вод производства целлюлозы методом радикальной сополимеризации 165
4.2, Биотестирование природных вод Восточного Казахстана 171
Обсуждение результатов. «Экологический диагноз» г. Зыряновска 195
4.3. Биотестироваиие природных вод в респ. Мордовия,в районах, подвергшихся воздействию радиоактивных выпадений после аварии Чернобыльской АЭС 198
Результаты биотестирования интегральной токсичности воды по метаболическому критерию 198
Выводы 204
4.4. Биологический контроль экологического состояния природных вод в районе расположения предприятия атомной промышленности 209
Результаты исследования и их обсуждение 212
Заключение 213
Глава 5. Явления самоорганизации в эмбриогенезе. Роль динамического хаоса в развивающихся системах 214
5.1. Явления самоорганизации в эмбриогенезе 214
5.2. Роль динамического хаоса в развитии 216
Выводы 218
Библиографический список 221
Публикации О.П.Мелеховой по теме диссертации 245
- Региопалыюсть свободнорадикальных реакций в зародышах амфибий (результаты и обсуждение)
- О возможных механизмах участия СР-процессов в регуляции эмбриогенеза
- Чувствительность зародышей амфибий к сверхмалым дозам биологически активных веществ
- Применение метода привитой сополимеризации для оценки загрязнения водной среды на примере легочных моллюсков
Региопалыюсть свободнорадикальных реакций в зародышах амфибий (результаты и обсуждение)
Метаболические процессы в живых клетках упорядочены во времени и во внутриклеточном пространстве. Клетка является открытой неравновесной системой, постоянно создающей и поддерживающей характерные структуры, что необходимо для роста и выживания. С термодинамической точки зрения для этого необходим постоянный проток энергии через систему, В клетках животных энергия получается при окислении органических веществ в ряде ферментативных реакций, сопряженных с синтезом АТФ. Окисление - общий процесс удаления электронов. Перенос электронов от углерода и водорода к кислороду энергетически выгоден. Обычно такой перенос электронов происходит ферментативным путем, постепенно. Макромолекулы находятся в метастабильном состоянии и нуждаются в энергии активации для перехода в более стабильную форму. Это осуществляется ферментами. Для ферментативных процессов важным моментом является узнавание субстрата и образование фермент-субстратного комплекса, которое происходит благодаря конформационному взаимодействию. Это значительно увеличивает скорость реакции. Большая часть энергии, выделенной в реакциях окисления, расходуется на образование АТФ в процессе митохондриального окислительного фосфорилирования. Сопряжение эндергонических реакций синтеза с экзэргоническими реакциями окисления осуществляется через порционный гидролиз АТФ, что и обеспечивает упорядоченность реакций в клетке (поддержание специфического состава внутриклеточной среды, перенос информации и организацию структур, самоорганизация цитоплазмы, способность клетки к перемещениям). Однако существует и иной путь - неферментативного окисления (см. ниже).
Можно отметить две стороны регуляции клеточного метаболизма: специфическую (через конформационные взаимодействия и узнавание) и тоническую (через порционную подачу энергии).
По современным представлениям, в регуляции метаболизма в эукариотиче-ских клетках ключевое участие принимают мембраны. Мембраны ответственны за компартментализацию (направленность во времени и пространстве) метаболических реакций, их интеграцию, активный транспорт ионов и ряда веществ, а также за явления возбудимости и передачу информационных сигналов. Благодаря компонентам плазматических мембран осуществляется прием информации: внешний сигнальный фактор действует на рецепторы мембраны, активируя их, и начинается каскад передачи сигнала с участием фосфорилирования: от белков-преобразователей в мембране к ферментам-усилителям, активирующим вторичные внутриклеточные мессенджеры (малые молекулы и ионы: цАМФ, цГМФ, инозитол-1,4,5-трифосфат (1Рз), диацилглицерол, ионы Са +). В частности, контакт спермия с мембраной яйцеклетки вызывает триггерную реакцию с участием фосфоинозитидной системы и Са2+, которая приводит к быстрой физиологической перестройке (активации) яйцеклетки (Berrige, Irvine, 1984; Гилберт, 1993). Помимо роли белков-рецепторов, ионных каналов и насосов, важной частью регуляции метаболизма является состав и фазовое состояние фосфолипидов мембран (Бурлакова, Эммануэль, 1965; Козлов, 1973; Бурлакова и др., 2001). В биомембранах локализованы важнейшие ферментные системы клетки, и от состояния фосфолипидных мицелл зависит скорость многих ферментативных процессов. Содержание фосфолипидов в мембранах органелл и клеток разных тканей специфично. В мембранных структурах происходит превращение и аккумуляция энергии. Фосфолипиды мембран играют большую роль в процессах гидролиза АТФ и, возможно, синтеза АТФ (Козлов, 1975; Каюшин,1961, 1967; Кометиани, 1962, 1963; Бржевская и др., 1967, 1968; Дмитриев, 1997). Митохондриальные мембраны содержат большое количество ненасыщенных фосфолипидов, что делает их особенно чувствительными к прямому воздействию кислорода. Предполагается, что циклы свободнорадикалыюго перекисного окисления-восстановления липидов м ито хондри ал ьных мембран влияют на скорость процессов окислительного фосфорилирования (Дмитриев, 1986, 1997). В микросомах обнаружены ферментативная (НАДФ-Н-зависимая) и неферментативная (аскорбат-зависимая) системы ПОЛ, характеризующие состояние электрон-транспортной цепи этих органелл и их функциональное состояние (Рис. 2).
Система окислительно-восстановительных процессов составляет основу жизнедеятельности клетки и организма. Кислород играет ключевую роль в энергетике аэробных клеток. Основное количество кислорода расходуется в ферментативных реакциях окислительного фосфорилировання (клеточного дыхания) в митохондриях и в процессах микросомалыгого окисления.
Небольшая часть поглощаемого кислорода восстанавливается неферментативным путем, через образование активных форм кислорода (АФК), являющихся свободными радикалами (СР) или быстро порождающими СР. Молекула кислорода в исходном состоянии является триплетной, т.е. имеет на валентных орбита-лях два электрона с параллельными спинами. Прямая реакция такой молекулы с синглетной (какими являются основные доноры электронов в клетке) невозможна. Для активации кислорода необходим переход его в возбужденное сипглетное состояние.
Это происходит при участии металлов с переменной валентностью или при взаимодействии со свободными радикалами. При этом кислород превращается в свободный радикал. При возбуждении кислорода и его превращениях образуются активные формы кислорода (АФК). При взаимодействии органических молекул с АФК возникают органические свободные радикалы (СР) (Герасимов и др., 1998). СР характеризуются наличием неспаренного электрона на молекулярной или внешней атомной орбите, что придает им парамагнитные свойства и исключительно высокую реакционную способность. Рекомбинация СР энергетически выгодна, и участие СР в промежуточных этапах биохимических реакций снижает энергию активации (Козлов, 1973; Нонхибел, 1982). В нормальном метаболизме интактных клеток часть молекулярного кислорода генерирует эндогенные АФК. Важнейшими из них являются супероксидный анион-радикал (Ог-), синглетный кислород (021), пероксид водорода (Н2О2Х гидроксидный радикал (ОН ), а также оксид азота (N0) (рис.-ехсма). АФК закономерно возникают в процессах мито-хондриального (оксидазного) и микросомального (оксигеназного) окисления, при функционировании НАДФ Н-оксидаз. Основными местами их образования в клетке являются митохондрии, эндоплазматический ретикулюм и ядерная мембрана (обзор: Бурлакова и др., 2001). СР могут атаковать молекулу ДНК и вызывать в ней образование радикалов, что может приводить к информационным изменениям.
О возможных механизмах участия СР-процессов в регуляции эмбриогенеза
Ранняя нейрула (ст. 16 по таблицам Камбара и Марро, 1954, и ст.20 по Да-багян и Слепцовой, 1975). Срез у головного валика, на уровне презумптивного глазного зачатка и линзообразующей эктодермы (рис. 8). Содержание СР в клетках презумптивного глазного зачатка достоверно выше, чем в соседних участках нейробласта. По длине нервной пластинки зона с повышенным содержанием СР продолжается каудальнес. На автографе видно, что повышенным содержанием СР отличаются трапециевидные и треугольные клетки, изменяющие свою форму при поднятии нервных валиков.
В эктодерме зона более высокой концентрации СР локализована в головном отделе нейрулы (на схеме - квадрант 4). (ДС/Сср, обозначенные на схеме, взяты отдельно: ДС глазного зачатка/Сср нервной пластинки и ДС линзообразующей эктодермы/ССр покровной эктодермы). Н.А. Мануйлова с помощью витальных красителей проследила местоположение в эктодерме зародыша травяной лягушки клеточных групп, впоследствии входящих в состав линзовой плакоды. По ее данным, линзообразующая эктодерма у зародышей этого вида лягушек на стадии ранней нейрулы находится под передним краем головного валика, и лишь впоследствии эти группы клеток сдвигаются латерально в результате образования впереди присосок (Мануйлова, неопубл.). Таким образом, оказывается, что в эктодерме зона повышенного содержания СР совпадает по положению с линзообразующей эктодермой. Известно, что на этой стадии развития зародыша глазной зачаток лабильно детерминирован в переднем отделе нервной пластинки (Adelman, 1930).
Замкнувшаяся нервная трубка (ст. 19 по Камбару и Марро, ст. 22 по Даба-гян и Слепцовой), активное выпячивание глазных пузырей еще не началось (рис. 9). Значительно выделяются по относительной концентрации СР участки 3 и 4 в нервной трубке, где вскоре начнется образование глазных пузырей, и довольно широкая зона в эктодерме, лежащая напротив «заряженного» участка нервной трубки. Известно, что этот момент развития соответствует состоянию устойчивой детерминации глазного зачатка в целом в переднем мозгу зародыша (Драгоми-ров, 1935), Для линзообразующей эктодермы - это период лабильной детерминации (Liedke, 1942, Jacobson, 1966).
Представим полученные временные и пространственные изменения активности радикалообразования в развивающемся зародыше в системе понятий экспериментальной эмбриологии.
Во время дробления существенно различаются по уровню энергообмена области презумптивной энтодермы и дорсального кортекса, способные при пересадках направлять развитие других частей зародыша в различных направлениях (Curtis, 1962; Nieuwkoop, 1969). Эта региональное повторяет различия в скорости энергообмепа в соответствующих участках цитоплазмы начинающего дробиться яйца. Активация ядер начинается в области зародыша, характеризующейся наиболее высоким уровнем радикалообразования. Эти факты позволяют предполагать участи СР-процессов в становлении цитоплазматической локализации морфогепетических потенций, молекулярная сущность которого не ясна. Представление о «цитоплазматической локализации» позволяет рассматривать детерминацию зародышевых листков как функцию взаимодействия цитоплазмы их клеток, унаследованной от разных участков сегрегированной цитоплазмы яйцеклетки, с геномом (Дэвидсон, 1972).
Биохимическая гетерогенность цитоплазмы зиготы и пространственная организация раннего развития
У амфибий, как и у многих других животных, топография будущего взрослого организма определяется при оплодотворении: анималыго-вегетативная ось яйца (будущая цефалокаудальная ось зародыша) обозначена в зрелом яйце еще до его оплодотворения анимально-вегетативными градиентами гликогена, пигмента (меланосом), рибосом и противоположно направленным градиентом желточных гранул (т.е. упакованных в мембрану фосфолипопротеидных комплексов). Дорсовентральная ось зародыша определяется перетеканием субкортикальных желточных гранул при оплодотворении и только маркируется появлением на будущей спинной стороне «серого серпа» в результате перемещения пигментных гранул (Gerhart е.а., 1981) (рис.1).
Цитоплазма оплодотворенного яйца обладает значительно большей гетерогенностью, не описывающейся этими двумя градиентами. Она, в частности, определяется миграцией ДНК ядрышкового организатора к анимальному полюсу, скоплением в районе зародышевого пузырька рибосом, гликогена и митохондрий, а также наличием больших количеств активатора ДНК - полимеразы - в за-репрессированной (до оплодотворения) форме, присутствием в вегетативной части кортекса дисков-рецептоов липофосфопротеидов и др.
Гетерогенность цитоплазмы яйца может быть обусловлена специфическим распределением иРНК. Так, синтезированные в процессе созревания ооцита иРНК частично могут мигрировать к вегетативному полюсу и входить в полярную плазму (Brachet, Malpoix, 1971), где обнаруживаются затем так называемые плотные тела - скопления митохондрий, гликогена и гладкоконтурных пузырьков, характеризующие новую плазму (Айзенштадт, 1984; Delbos е.а., 1982).
В последнее время было показано, что уже во время созревания ооцита амфибий (при разрушении зародышевого пузырька) не все ядерные белки распределяются равномерно в ооплазме, что предположительно может иметь морфоге-петическое значение (Мапо, 1968).
После оплодотворения активируется миграция ДНК-полимеразы из цитоплазмы в пронуклеусы, начинается ускоренная репликация с множественностью сайтов и наступает период митотических делений дробления (первоначально синхронных во всем яйце), причем клеточные циклы в этот период развития имеют в своем составе только фазы S и М. Оплодотворением же активируется синтез белка, организованный в яйце гетерогенно благодаря градиенту материнских иРНК (информосом) и рибосом. Процесс трансляции цикличен и, как детально показано на примере морского ежа работами группы японских исследователей, возглавляемой Мано (Мапо, 1968, 1975; Shioda е.а.,1977; Syzuki е.а., 1977), именно циклический синтез белка, в котором ключевым моментом является синтез КСІ-растворимого белка, а таймером - тиоловый окислительно-восстановительный цикл, определяет ритмичность и темп делений дробления.
Важной частью организации цикличности обменных процессов в дробящемся яйце являются «волны сокращения поверхности» - осцилляции субкортикальных сократимых структур (Нага, 1971; Нага е.а., 1980), независимые от ядра, но связанные с ним в единый цикл, так как для сокращения кортекса необходима активация динеип-подобпой АТФазы тиолами, периодизм которой связан с общим окислительно-восстановительным белковым таймером (Mabuchi, 1973).
Изменение скорости пролиферации - первое приложение «паттерна» оопл аз мати ческой сегрегации.
Чувствительность зародышей амфибий к сверхмалым дозам биологически активных веществ
Картина распределения СР во время дробления приводит к предположению, что кортикальная реакция оплодотворенного яйца связана с синтезом или активацией аптиоксидантов в кортексе. Активация же энергообмена во внутренней части яйца, возможно, связана с освобождением факторов оболочки зародышевого пузырька и разрушением мембраны яйца в месте внедрения спермия, так как на автографах (стадия двух и четырех бластомеров) заметна высокая концентрация зерен серебра по следу спермия и в области слияния пронуклеусов. Эти первичные области репрессированного и активированного энергообмена могут обусловить заметные впоследствии различия активности радикалообразования в пре-зумптивных эктодерме и энтодерме.
Известно, что степень детерминированности (или, иначе, уровень латентной дифференцировки) в конце периода дробления наиболее высока в клетках пре-зумптивной энтодермы и наиболее низок в презумптивной эктодерме (Holtfreter, 1938), что связывают с неодновременным началом и различной скоростью синтеза РНК ядрами в этих зачатках (Bachvarova, Davidson, 1966; FHckinger, Daniel, 1972; Woodland, Gurdon, 1968) (Рис. 10, 11). Судя по нашим данным, суммарная относительная концентрация СР за время дробления и гаструляции в клетках презумптивных энтодермы, мезодермы и эктодермы пропорциональна уровню их латентной дифференцировки. Активность энергообмена и метаболическое состояние клетки, показателем которых является содержание СР, суть количественные неспецифические факторы по отношению к работе генома. Однако в начальной дивергентной детерминации зачатков, когда их клетки, вероятно, имеют очень узкие возможности выбора программ дальнейшего развития, уровень функциональной активности обязательного метаболизма клетки может играть существенную роль для начала транскрипционной функции ядра.
Степень детерминированности зачатков играет роль и в определении их участия в гетеротипических индукционных взаимодействиях, представляющих распространенный в эмбриогенезе тип регуляции процессов дифференцировки. Индуктором обычно служит зачаток с более высоким уровнем латентной дифференцировки, а в результате индукции в клетках реагирующей системы активируются процессы транскрипции и трансляции. По нашим данным, уровень радикалообразования в клетках индуктора до контакта всегда выше, во время контакта суммарное содержание СР в индуцирующем и реагирующем зачатках уравнивается, и после контакта возрастает в реагирующей системе. Так, в начале дробления наиболее высок уровень СР-процессов в районе расположения будущей энтодермы, затем, после индукционного воздействия энтодермы (Nieuwkoop, 1969), начинают выделяться по активности радикалообразования клетки презумптивной мезодермы, В презумптивной эктодерме уровень энергообмена остается низким до начала гаструляции. Дорсальная губа бластопора закладывается по границе сильномеченых и слабомеченых клеток. Наиболее активное ради кал ообразование во время гаструляции отмечено в области Шпеманновского организатора (дорсальной губы бластопора) и головного индуктора (прехордалыюй пластинки). Именно в этой области показана активная экспрессия более десяти генов и материнских белков, участвующих в организации осевого зачатка (Slack, 1994, Stennard е.а., 1997). После индукционного контакта с хордомезодермой начинается стойкая активация энергообмеиа в презумптивном нейробласте. Однако этот процесс отчасти начинается и спонтанно во время гаструляции, что заметно по некоторому приросту скорости радикал ообразования во всем эктобласте, а также и в презумптивном нейробласте еще до контакта с индуктором. Как было показано ранее, в развивающемся глазном зачатке уровень СР-процессов на стадиях 19 - 21 более высок в стенках глазного пузыря, уравнивается с уровнем СР-процессов в линзовой эктодерме на стадии 22, во время их индукционного контакта, а после этого средний уровень радикалообразования в будущей линзе становится выше, чем в сетчатке, однако в контактирующих частях линзовой эктодермы и глазного бокала, предположительно связанных индукционным взаимодействием он почти одинаков (Мелехова 19766). Все сказанное приводит к заключению, что для прохождения процессов индукции необходим определенный уровень энергетической готовности клеток. С другой стороны, поскольку уровень энергообмена в клетках реагирующей системы после контакта неизменно возрастает, можно предположить, что индукция связана не только с возможным переходом веществ, специфически воздействующих на геном, по и с действием неспецифических факторов, активирующих и стабилизирующих процессы обязательного метаболизма, которые идут в зародышевых клетках в большой степени за счет окисления желтка. Такое предположение согласуется с представлениями Тидемана (Tiedemann, 1967 - 1969) об индукции как дерепрессии и заключением Вурдемана о необходимости высокого уровня метаболизма (в частности, гликолиза) в клетках индуктора (Woerdemann, 1933). На дифференцированных клетках печени показано, что микросомальная фракция при совместной инкубации с мембранами других органелл способна индуцировать в них ферментативный процесс СР-окисления фосфолипидов, что может участвовать в регуляции развития мембранных систем клетки (Каган, Котелевцев и др., 1975). Представляется возможным сопоставить эти данные с локализацией белкового М-фактора в микросомах (Tiedemann, 1967). По-видимому, в случае перехода при эмбриональной индукции элементов мембран, способных к СР-окислению, можно ожидать активации тех же процессов в клетках реагирующей системы, и прежде всего в мембранах их желточных гранул. Возможность такого рода процессов косвенно подтверждают данные данные о связывании с желточными пластинками эктодер-мальных клеток некоторых низкомолекулярных веществ, перешедших в процессе нейральной индукции из клеток хордомезодермы (Vainio, Saxen, Toivonen, Rapola, 1962, Saxen, 1963), и разрушении желточных пластинок в эктодерме после воздействия индуктора (Yamada, 1967).
Степень детерминированности, т.е. биологический возраст клеток зачатков органов зародыша, по нашим данным, пропорциональна суммарной относительной интенсивности в них СР-процессов за время от начала развития до исследуемого момента. Это не противоречит принятому представлению об уровне латентной дифференцировки частей зародыша как функции суммарной продолжительности интеркинетических состояний их клеток (Детлаф, 1965), так как на протяжении клеточного цикла наибольшее количество СР генерируется, по-видимому, в течение периодов G[ и G2 (Ю.П. Козлов, личное сообщение).
Полученные нами данные являются описательными и не раскрывают причинно-следственных отношений между обсуждаемыми явлениями. Однако они дают возможность впоследствии применить ряд уточняющих физико-химических методов исследования СР параллельно с экспериментально-эмбриологическими методами. Это позволит точнее судить о содержании процессов, определяющих появление физиологической неоднородности в клеточном материале зародыша.
Распределения митотической активности и концентраций ядер в развивающемся зародыше
Применение метода привитой сополимеризации для оценки загрязнения водной среды на примере легочных моллюсков
Ранее были высказаны предположения о том, что включение энергетических депо в биохимические циклы играет роль замедляющей зубчатой передачи часов (Кондрашова, 1976, 1979; Сельков, 1979), тогда как экспериментальное введение в реакционную систему промоторов СР и расход антиоксидантов, по данным многочисленных работ лаборатории проф. Е.Б. Бурлаковой (Алесенко и др., 1975; Алесенко и др., 1984)), изменяет цикл делящихся клеток в культуре именно в сторону удлинения фазы Gi, что может быть и результатом работы мембранных ФИ, и следствием повышения внутриклеточного рН (Берридж, 1985; Berrige, Irvine, 1984). Начало включения метки 4С-акриламида в ядра может быть связано с актами фосфорилирования ядерных белков, цепь которых начинают ФИ.
В разделе 2.6. показано, что развитие СР-реакций в значительной мере связано с метаболизмом фосфоинозитидной системы внутриклеточных мессендже-ров.
Для понимания механизмов возможного участия рассматриваемой категории процессов в регуляции эмбриогенеза представляются важными следующие ее характеристики. СР - это короткоживущие, высокореакциошюспособиые метаболиты, для которых характерно наличие неспаренного электрона на внешней молекулярной орбите. Большая часть СР-состояний возникает в липидах клетки, и эти СР во многом определяют их фазовое состояние и тем самым «биохимию гидрофобных пространств» целостных мембранных систем, функция и структура которых описываются жидкостио-мозаичной моделью Сэнджера - Никольсона. Эта модель объясняет и зависимость активности мембранно-связанных ферментов, таких как ферменты электрон-транспортных цепей, АТФ-синтетазы и АТФа-зы, от скорости СР-окисления и текучести мембранных фосфолипидов. Хромато-графический анализ липидов, выделенных из животных клеток, в сочетании с методом электронно-парамагнитного резонанса показывает, что у позвоночных животных наибольший вклад в образование таких СР вносят семихиноны флавина и коэнзима Q (Калмаисон, 1976). Роль идентифицированных к настоящему времени СР в энергетике клеток сводится к осуществлению обратимых одноэлектронных окислительно-восстановительных превращений в реакциях двухэлектронного переноса, что снижает общую энергию активации и способствует направленному переносу электронов в ферментных ансамблях дыхательной цепи. Согласно представлениям некоторых ученых, СР-состояния принимают участие и в системе генерации АТФ (Козлов, 1973; Каюшин, 1961, 1967; Кометиани, 1962, 1963; Бржевская и др., 1967, 1968; Николе, 1985; Пюльман, Пюльман, 1965; Дмитриев, 1997).
Общий уровень радикалообразования в клетке регулируется системой биологических антноксидантов (аскорбат, токоферол, возможно, меланин), а также ферментными системами (супероксиддисмутазы, каталазы, глютатионредуктазы). Некоторые исследователи предполагают, что в отличие от ферментных окислительно-восстановительных систем, где энергия передается «порционно», в липи-дах мембран может осуществляться миграция энергии по гидрофобной фазе путем цепных реакций автоокислепия липидов (в СССР работы научных школ акад. Н.М. Эммануэля, проф. Б.Н. Тарусова). Наличие таких цепных автокаталитических СР-процессов в липидах показано при некоторых патологических состояниях, но неизвестно, насколько они распространены в системе нормального метаболизма. Сент-Дьерди предполагает важную роль понижения СР-состояний белковых молекул в возникновении электронных полос проводимости при осуществлении многих клеточных функций (Сент-Дьерди, 1971). Физико-химические теории старения (Кольтовер, 1983) предполагают, что с возрастом повышается возможность таких реакций на фоне понижения надежности работы окислительных ферментов, расхода антноксидантов (например, снижения концентрации витамина Е в клетках), а также снижения активности фермента супероксиддисмутазы и других антноксидантов - естественной защитной системы клетки от токсичных перекисных соединений.
Представления об окислительно-восстановительном комеостазе клетки связывают в единую регуляционную систему промоторы и ингибиторы СР-реакций и ответную реакцию на изменение их баланса - состояние биомембран (Бурлако-ва и др., 2001; Кудряшов, 2004). В наших опытах с химическим фракционированием и радиоиндикацией фракций меченных 14С-акриламидом зародышей обнаружено, что значительная часть СР связана с фракцией липидов, при этом очень небольшая (3 - 6%) по массе часть этой фракции - кислые липиды, основную массу которых составляют фосфоинозитиды (ФИ) - оказалась наиболее значимой по содержанию СР (до 50% общей радиоактивности образца выделенных липидов).
Структурные компоненты плазматических мембран - ФИ - выступают в роли вторичных мессенджеров, молекул-посредников. На молекулярном уровне процесс передачи информации извне в клетку начинается с информационных перестроек мембранных белков-рецепторов (рис, 16), а затем идет через малые цитоплазматичсские молекулы или даже ионы, диффузия которых обеспечивает быстрое распространение сигнала по всей клетке. Сейчас известны всего 2 системы вторичных мессенджеров (пути передачи сигналов универсальны во всех клетках); эти вторичные мессенджеры способны регулировать разнообразнейшие внутриклеточные процессы. Один (более известный) путь передачи сигналов идет через циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), другой, расшифрованный недавно (Берридж, 1985), - через мембранные липиды (инозитолтрифосфат и диацилглицерол). В обоих случаях мембранные бедки, принимающие сигнал, вы-сокофосфорилированы (с участием ГТФ); они активируют усилительный фермент, находящийся на внутренней стороне мембраны. Для фосфоинозитидного пути сигнала - это фосфолипаза С, которая расщепляет мембранный липид фосфатиди линозитод-4,5-фосфат на диацилглицерол и инозитолтрифосфат. Послед-ний вызывает мобилизацию (высвобождение из депо) ионов Са , которые активируют протеинкиназу, и этим актом начинается каскад фосфорилирования белков, ведущий к ответной реакции клетки.
