Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Развитие пыльника и мужского гаметофита высших растений (обзор литературы) 6
1.1. Стенка пыльника 8
1.1.1. Этапы развития тапетума 9
1.1.2. Роль и функции тапетума 11
1.1.3. Межтканевые взаимодействия в пыльнике 15
1.2. Микроспорогенез 18
1.3. Развитие мужского гаметофита 21
1.3.1. Формирование вторичной оболочки мужского гаметофита..21
1.3.2. Вакуолизация микроспор 22
1.3.3. Митоз микроспор 24
1.4. Созревание мужского гаметофита 25
1.4.1. Вегетативная и генеративная клетки 25
1.4.2. Накопление резервных веществ 28
1.4.3. Завершение формирования оболочки 29
1.4.4. Синтез белков 29
1.4.5. Дегидратация 31
1.5. Экспрессия генов в системе пыльник - мужской гаметофит 32
1.5.1. Экспрессия генов в развивающемся пыльнике 33
1.5.2. Экспрессия генов в процессе микроспорогенеза и развития мужского гаметофита 38
1.6. Генетически детеминированные барьеры самооплодотворения..42
1.6.1. Самонесовместимость 42
1.6.2. Мужская стерильность 43
1.6.1.1. Проявление генетических факторов ЦМС 44
1.6.1.2. Нарушения митохондриальных функций 46
1.6.1.3. Гены-восстановители фертильности 49
1.7. Регуляторные механизмы в системе пыльник - мужской гаметофит (гипотезы) 50
Цель и задачи исследования 55
ГЛАВА 2. Объект и методы исследования 57
2.1. Объект исследования .57
2.2. Вегетативное размножение клонов петунии 57
2.3. Идентификация стадий развития микроспоры и пыльцевого зерна 57
2.4. Цитологический анализ 58
2.5. Цитоэмбриологические исследования 58
2.6. Гистохимическое определение активности инвертазы 59
2.7. Определение глюкозы, фруктозы и сахарозы 59
2.8. Культивирование пыльцевых трубок петунии in vitro 61
2.9. Определение выделения этилена 61
2.10. Определение содержания АЦК 62
2.11. Обработка этиленом побегов петунии 63
ГЛАВА 3. Сравнительное цитоэмбрио логическое исследование развивающихся пыльников и мужского гаметофита трех клонов петунии {petunia hybrida) 64
3.1. Характеристика стадий развития мужского гаметофита 64
3.2. Морфогенез пыльника и развитие мужского гаметофита у трех клонов петунии 68
3.2.1. Фертильные (самосовместимый и самонесовместимый) клоны 68
3.2.2. Стерильный клон 75
ГЛАВА 4. Физиолого-биохимические аспекты спорофитнои регуляции развития мужского гаметофита петунии трех клонов 79
4.1. Изменение массы пыльника в процессе развития мужского гаметофита 79
4.2. Выделение углекислого газа развивающимися пыльниками 79
4.3. Углеводный метаболизм пыльников в процессе формирования фертильного и стерильного мужского гаметофита 85
4.3.1. Динамика сахарозы, фруктозы и глюкозы 86
4.3.2. Локализация активности инвертазы 94
4.4. Участие этилена в спорофитной регуляции развития и прорастания мужского гаметофита 104
4.4.1. Динамика содержания АЦК и выделения этилена в развивающихся пыльниках при формировании фертильного мужского гаметофита и мужской стерильности 105
4.4.2. Влияние экзогенного этилена на жизнеспособность мужского гаметофита 111
4.4.3. Роль АЦК и этилена в процессах созревания и прорастания пыльцевых зерен 115
4.4.3.1. Динамика содержания АЦК и выделения этилена в пыльниках при созревании и высвобождении пыльцевых зерен : 115
4.4.3.2. Выделение этилена и дыхание прорастающей in vitro пыльцы петунии 117
4.4.3.3. Влияние экзогенного этилена на прорастание и рост пыльцевых трубок в культуре in vitro 118
ГЛАВА 5. Обсуждение результатов 122
Выводы 129
Список литературы.. 1131
- Экспрессия генов в процессе микроспорогенеза и развития мужского гаметофита
- Регуляторные механизмы в системе пыльник - мужской гаметофит (гипотезы)
- Фертильные (самосовместимый и самонесовместимый) клоны
- Динамика содержания АЦК и выделения этилена в развивающихся пыльниках при формировании фертильного мужского гаметофита и мужской стерильности
Введение к работе
Изучение регуляторных механизмов формирования мужского гаметофита, одного из ключевых этапов репродуктивного процесса высших растений, весьма существенно для разработки фундаментальных проблем роста и развития растений, включая дифференциацию и деление клеток, а также для решения ряда практических задач растениеводства, в том числе генетико-селекционных работ. К настоящему времени получено большое количество данных как о морфологии и биохимии пыльника (Поддубная-Арнольди, 1987; Goldberg et al., 1993; Камелина, 1994; DeGusman, Riggs, 2000; Scott et al., 2004), так и мужского гаметофита (Heslop-Harrison, 1987; Mascarenhas, 1989, 1990, 1993; Bedinger, 1992; Clement et al., 1994; Twell, 1994; Heberle-Bors et al., 1996; Tanaka et al., 1998; Матвеева, Ермаков, 1999; McCormick, 2004 и др.), однако остается неисследованным вопрос о спорофитной детерминации развития мужского гаметофита.
Успешный ход развития спорогенных клеток пыльника по гаметофитной программе зависит от нормального функционирования спорофитных тканей стенки микроспорангия (экзотеция, эндотеция, средних слоев и тапетума), в котором все физиологические и биохимические процессы протекают строго согласованно (Резникова, 1984; Поддубная-Арнольди, 1987; Бхандари, 1990; Батыгина, 1994, 2002; Камелина, 1994). Скоординированные по времени изменения в стенке пыльника в процессе его созревания регулируются последовательными каскадами экспрессии генов (Schreiber et al., 2004). Были найдены несколько генов факторов транскрипции, экспрессирующихся в пыльниках, такие, как DEFH125, AGL15, AGL18, Zm MADS2 (Heuer et al., 2001; Robson et al., 2001; Yang et al., 2001). Между тем изучение
5 механизмов спорофитной регуляции развития мужского гаметофита до сих
пор находится на уровне гипотез о контроле микроспорогенеза путем
установления и разрыва клеточных контактов между микроспороцитами и
тапетумом в период мейоза (Heslop-Harrison, 1964). На современном этапе
исследования микроспорогенеза необходимо проводить в области
выяснения конкретных механизмов межтканевых и межклеточных
взаимодействий. Учитывая существенный пробел в области исследований
взаимосвязи развивающегося гаметофита со спорофитом, представляются
весьма актуальными исследования, направленные на комплексное
цитоэмбриологическое и биохимическое изучение, системы пыльник -
мужской гаметофит.
Экспрессия генов в процессе микроспорогенеза и развития мужского гаметофита
Микроспорогенез - процесс формирования микроспор путем меиотического деления материнских клеток микроспор, развивающихся внутри гнезд пыльника. Материнские клетки микроспор (микроспороциты) возникают из клеток спорогенной ткани. Они характеризуются плотной цитоплазмой и крупными ядрами (Rodkiewicz, Bednara,1994). У многих растений мейотические деления являются синхронными в пыльнике, возможно, благодаря цитоплазматическим связям между материнскими клетками пыльцы (Бхандари, 1990). Микроспороциты связаны между собой плазмодесмами и содержат пластиды, митохондрии, диктиосомы, вакуоли, осмиефильные глобулы, ЭР и рибосомы.
В начале профазы мейоза вокруг микроспороцитов начинает откладываться каллоза, что приводит к потере плазмодесменных связей с тапетумом (Батыгина, 2002). Она откладывается между плазмалеммой и первичной целлюлозной стенкой, распространяясь в латеральном направлении. В это время в каллозных оболочках формируются каналы, через которые осуществляется межклеточный транспорт. В поздней профазе каналы исчезают, что превращает каждый микроспороцит в изолированную систему (Резникова, 1984). Вероятнее всего, каллозная оболочка препятствует слипанию клеток микроспороцитов и тем самым механически изолирует их друг от друга. Кроме того, каллозная оболочка создает условия, необходимые для формирования оболочки молодой микроспоры (Heslop-Harrison, 1964, 1966). Описан белок лилии, LP28, участвующий в формировании клеточной стенки на протяжении мейоза и развития пыльцы и связывающийся с каллозой (Mogami et al., 2002). LP28 появляется в профазе мейоза в клеточных стенках микроспороцитов, на стадии тетрад обнаруживается также в стенке пыльника и в связнике, но отсутствует после высвобождения микроспор из тетрад, а после митоза микроспор накапливается в стенке генеративной клетки.
Природа индуктора мейоза неизвестна, однако выявлены факторы, участвующие в регуляции мейоза и синтезируемые вне спорогенных клеток (Walters, 1985). Полагают, что для запуска мейотического процесса необходимо, чтобы в пыльник был транспортирован из другой ткани индуктор мейоза, продуцируемый в вегетативных побегах растений, который характеризуется высокой специфичностью и действует только на материнские клетки микроспоры, не оказывая никакого влияния даже на клетки тапетума (Бхандари, 1990).
Характерной особенностью микроспорогенеза является синхронность прохождения мейоза спорогенными клетками в пыльниках одного бутона (Heslop-Harrison, 1966). Существует, по-видимому, механизм задержки микроспороцитов в G1 фазе мейоза, вероятно, тот же фактор также действует в клетках тапетума (Bennet et al., 1973) . Оба типа клеток одновременно выходят из G1 и синхронно синтезируют ДНК.
В микроспороцитах и клетках тапетума на ранних стадиях развития пыльника отмечали увеличение числа митохондрий в 20-40 раз, а контроль биогенеза митохондрий может частично осуществляться на уровне экспрессии митохондриальных генов (Lee, Warmke, 1994). У различных видов растений экспрессия митохондриальных генов в пыльниках может менять респираторный статус митохондрий в процессе развития мужского гаметофита (Kalantidis et al., 2002). Об этом свидетельствует, например, ткане-специфичная и дифференцированно-регулируемая экспрессия таких генов, как Atp 1, продукт которого активен в материнских клетках пыльцы и в тапетуме на протяжении мейоза, но отсутствует в пыльниках после мейоза, или сохЗ, транскрипты которого появлялись в конце мейоза и присутствовали вплоть до дегенерации тапетума. Для идентификации специфических для мейоза транскриптов Hotta et al. (1985) использовали мейоциты лилии. Установлено сходство белка из материнских клеток пыльцы с гистоном HI млекопитающих (Sasaki et al.,1990). Гистоноподобные белки, как считается, играют роль в упаковке хроматина. Riggs and Hasenkampf (1991) описали специфичный для мейоза белок лилии, meiotin-1, который также проявлял сродство с гистоном. Bouchard (1990) охарактеризовал специфичные для мейоза кДНК, которые имеют сходные последовательности с белками теплового шока. Материнские клетки пыльцы и микроспоры, в отличие от вегетативных клеток, делятся без образования препрофазных колец микротрубочек, намечающих положение будущей клеточной стенки (Staehelin, Hepler, 1996). Браун и Леммон (Brown, Lemmon, 1996) обнаружили особую систему радиальных, исходящих из ядра микротрубочек, которые организуют цитоплазматический домен. В мейозе у Cypripedium californicum организующая функция этой системы проявлялась как после первого, так и после второго деления мейоза. Первое мейотическое деление приводит к формированию диады. Затем образуется тетрада микроспор - первых клеток гаметофитной генерации. На примере Nicotiana показано, что пропорциональное распределение цитоплазмы между четырьмя микроспорами достигается с помощью радиальных микротрубочек, расположенных вокруг ядер, а формирование апертур, возможно, зависит от числа клеточных перегородок, разделяющих элементы тетрад (Ressayre et al., 2002; 2003). Для Solanaceae, как и для большинства двудольных, характерен симультанный цитокинез, когда после мейоза I клеточная пластинка не образуется, и два ядра диады располагаются в общей цитоплазме. Мейоз II сопровождается одновременным цитокинезом между четырьмя пост-мейотическими ядрами и образованием внутренней каллозной оболочки тетрады (Алимова, 1994; Rodkiewicz, Bednara, 1994). В конце мейоза каллозная оболочка тетрад разрывается, и микроспоры высвобождаются в полость гнезда пыльника. Растворение каллозы связано с изменениями величины рН в локуле и активацией каллазы. Высказано предположение, что этот фермент выделяется клетками тапетума (Carafa, Pizzolongo, 1990). Микроспора является первой клеткой гаметофитной генерации, образующейся в микроспорангии в результате мейоза (Алимова, 1994).
Регуляторные механизмы в системе пыльник - мужской гаметофит (гипотезы)
ЦМС часто ассоциируют с нарушением митохондриальных функций. Несколько мутантов с измененным развитием тычинки было получено у табака (Rosenberg and Bonnet, 1983; Kofer et al., 1990, 1991, 1992). Эти мутанты имели ЦМС, связанную со специфическими фрагментами митохондриальной ДНК, что указывает на роль митохондриальных генов в дифференциации тычинки. Мужская стерильность у табака регулируется ядерными генами путем контроля синтеза in organello ряда митохондриальных белков (Раере et al., 1990). Авторы полагают, что гены могут действовать на уровне и транскрипции, и трансляции белков. Растения табака, трансформированные по митохондриальному гену atp9, имели нарушения в пыльниках, приводящие к абортированию пыльцы (Hernould et al., 1998). Развитие тапетума приостанавливалось, и митохондрии в клетках тапетума демонстрировали характерные признаки дегенерации. ЦМС у сахарной свеклы также связывают с дисфункциями митохондрий (Yui et al., 2003).
Наиболее хорошо охарактеризованы системы ЦМС, связанные с рекомбинантными абберациями в митохондриальном геноме, приводящими к образованию новых рамок считывания, которые экспрессируются как различные полипептиды (Schnable, Wise, 1998). В гене MS2 стерильного мутанта арабидопсиса обнаружен короткий фрагмент, гомологичный рамке считывания митохондриального генома пшеницы, при этом ms2 является ядерной мутацией (Aarts, et al., 1993). Ген арабидопсиса MALE STERILUTY 2 (MS 2) экспрессируется в тапетуме на стадии высвобождения микроспор из тетрад и на стадии молодой микроспоры (Aarts et al., 1997). Охарактеризован ген арабидопсиса MALE STERILITY1 (MSI), гомологичный PHD-finger семейству транскрипционных факторов и играющий, вероятно, ключевую роль в регуляции транскрипции на определенных стадиях микроспорогенеза и развития пыльника (Wilson et al., 2001). У гомозиготного стерильного msl мутанта гаметофитные клетки дегенерировали после высвобождения микроспор из тетрад и в этот период наблюдали также нарушения в тапетуме. Белок MS1 является ядерной сигнальной молекулой, необходимой для развития мужского гаметофита (Ito, Shinozaki, 2002). Из петунии была выделена специфичная для пыльника кДНК TAZ1(TAPETUM DEVELOPMENT ZINC FINGER PROTEIN1) (Kapoor et al., 2002). TAZ1 обнаруживает сходство с MSI, т. к. оба они являются факторами транскрипции, имеют сходные паттерны экспрессии и обуславливают похожие фенотипические проявления в случае супрессии этих генов. В премейотической фазе развития пыльника транскрипты TAZ1 аккумулируются во всех тканях пыльника, за исключением тапетума и тканей гаметофита, а в постмейотической фазе развития пыльника -исключительно в тапетуме. «Молчание» TAZ1 приводит к аберрациям развития тапетума с последующим абортированием микроспор вскоре после их высвобождения из тетрад, но было также получено несколько пыльцевых зерен, характеризующихся пониженным содержанием флавонолов и низкой способностью к прорастанию. Вероятно, TAZ1 и MS1 служат компонентами регуляторного механизма, контролирующего постмейотическую фазу развития тапетума. Выдвинута гипотеза, что TAZ1 может контролировать наступление программируемой клеточной смерти в тапетуме и его «молчание» обуславливает преждевременную дегенерацию тапетума. Фертильные линии петунии отличаются от линий с мужской стерильностью по гистологии и ультраструктуре пыльников (Bino, 1985), по активности цитохромоксидазы в пыльниках (Bino et al., 1985), по содержанию аденилата (Bino et al., 1986) и полиаминов (Gerats et al, 1988), причем выявленные различия возрастают после начала нарушений в пыльниках, что указывает на то, что они могут быть связаны с причиной, вызывающей ЦМС. Известно, что митохондрии содержат цитоплазматический фактор, связанный с ЦМС, кроме того, у линий с ЦМС выявлены специфические изменения как в ДНК, так и в белках (Hanson, Conde, 1986; Kaul, 1988; Bhadula, Sawhney, 1991; Levings, 1993). У петунии ЦМС-связанная область митохондриальной ДНК идентифицирована как S-pcf локус. Ген pcf содержит часть кодирующей области atp9 и рамку считывания urf-S (Young, Hanson, 1987). Выдвинута гипотеза относительно молекулярного механизма ЦМС у петунии, допускающая присутствие pcf полипептидов, которые могут быть интегрированы в мембрану митохондрий путем включения в электронный транспорт или могут участвовать в других митохондриальных функциях(СоппеИ, Hanson, 1990). ЦМС у петунии и кукурузы имеет множество сходных особенностей (Hanson, 1991), в частности, оба гена hcf и T-urfl3 содержат рамки считывания, кодирующие полипептиды митохондриальной мембраны. По всей вероятности, гены pcf и T-urfl3 продуцируют токсичный белковый продукт, а ядерные гены - восстановители фертильности функционируют, влияя на накопление этих токсичных продуктов (Levings, 1993). Для кукурузы предложена модель ЦМС-Т-типа, в которой дегенерация тапетума обусловлена токсическими эффектами ацетальдегида на митохондрии в присутствии URF13 белка (Tadege, Kuhlemeier, 1997). У петунии ген pcf кодирует белок 25 кДа, который связывают с ЦМС (Wintz et al., 1995). Для изучения роли PCF были получены трансгенные растения петунии и табака с химерным геном, содержащим последовательность, кодирующую белок 25 кДа, дополненный двумя различными митохондриальными последовательностями, под управлением промотора CaMV S5S или тапетум-специфичного промотора. Фертильными оказались те трансгенные растения, у которых белок 25 кДа синтезируется в клетках тапетума в пост-мейотический период развития пыльников, в то время как в ЦМС-растениях эндогенный белок 25 кДа экспрессируется как в тапетуме, так и в спорогенной ткани в пре мейотичёский период. Как показано, митохондриальная экспрессия генов у подсолнечника регулируется в процессе развития пыльников (Smart et al., 1994). На ранних стадиях мейоза транскрипты митохондриальных генов и белки накапливаются в относительно высоких концентрациях в микроспороцитах. На протяжении последующих стадий мейоза митохондриальные транскрипты и белки накапливаются в клетках тапетума. Накопление транскриптов митохондриальных генов и белков в мейоцитах и клетках тапетума подтверждает, что клеточно-специфичная экспрессия митохондриальных генов регулируется как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Тканеспецифичность ЦМС фенотипа может быть обусловлена необходимостью высокого уровня экспрессии митохондриальных генов и биогенеза митохондрий в микроспороцитах, чтобы обеспечить в достаточной мере митохондриями каждую из четырех новообразованных клеток микроспор, а в линиях с ЦМС нарушается биогенез митохондрий в мейоцитах.
Фертильные (самосовместимый и самонесовместимый) клоны
Поступление питательных веществ в пыльник определяется суммарным результатом активности его тканей, и линии с мужской стерильностью часто характеризуются нарушениями углеводного метаболизма. Так, например, полученные линии Brassica napus с измененной митохондриальной ДНК характеризовались мужской стерильностью и сниженным вегетативным ростом, а также сниженными уровнями сахарозы и крахмала в листьях и АТФ в цветочных меристемах, бутонах и листьях (Teixeira et al., 2005). Снижение содержания сахарозы в пыльниках МС растений описано у Triticum (Fucasawa et al., 1954). Пыльники стерильных линий Raphanus, по сравнению с фертильными, на ранних стадиях развития содержали меньше фруктозы, а на более поздних стадиях они отличались большим содержанием сахарозы (Ogura, 1968). Banga et al., (1984) отмечали значительно более низкое содержание Сахаров в пыльниках стерильных линий горчицы по сравнению с пыльниками фертильных линий. Водный дефицит на стадии мейоза материнских клеток пыльцы у пшеницы индуцировал мужскую стерильность и ингибировал накопление крахмальных зерен, что было связано со снижением активности растворимой кислой инвертазы в пыльниках (Dorion et al., 1996). В качестве одной из возможных причин неспособности стерильных линий Zea mays накапливать продукты фотосинтеза было высказано предположение о нарушении гормонзависимого транспорта питательных веществ (Cheng et al., 1979). Развитие фертильного МГ неизбежно должно вовлекать участие растительных гормонов (Chaudhury, 1993). Отсутствие регуляторов роста в индукционной среде с изолированными микроспорами пшеницы создает наиболее эффективные условия для переключения микроспор на спорофитный путь развития (Oleszczuk et al., 2004). Тем не менее, непосредственное участие фитогормонов в развитии пыльника и мужского гаметофита требует дальнейшего изучения. В настоящее время большая часть накопленных данных о влиянии фитогормонов на развитие репродуктивных органов цветка приходится на гибберегіиньї. У мутантов с дефицитом гибберегіина наблюдали недоразвитие органов цветка, в особенности тычинок, что приводило к мужской стерильности (Yu et al., 2004). У арабидопсиса гибберелин запускает экспрессию флоральных генов, таких, как АРЗ, PI и AG, по действию являющихся антагонистами белкам DELLA, регулирует рост клеток в процессе роста филаментов тычинок и дальнейшее развитие пыльника вплоть до зрелого пыльцевого зерна (Cheng et al., 2004). Пыльники риса характеризуются высоким уровнем гибберелинов, которые начинают аккумулироваться в пыльниках за 1-2 дня до раскрытия цветка и накапливаются в пыльце по мере ее созревания (Fukuda et al., 2004). Исследования на трансгенных растениях кукурузы позволили выдвинуть гипотезу о совместном участии гормонов, в частности гиббереЖнов и цитокининов в развитии мужского гаметофита (Huang et al., 2003). Наличие гибберелинов в пыльце арабидопсиса необходимо . для нормального роста пыльцевых трубок (Singh et al., 2002). Фенотипический анализ мутантов кукурузы с дефицитом гиб реЛинов подтверждает их необходимость для развития пыльников (Kaul 1988). Обработка гибберелинами стерильного мутанта томата, stamenless-2, восстанавливала его мужскую фертильность (Sawhney, Bhandula, 1988). Дефицит гибберелина у мутантов томата с мужской стерильностью вызывал снижение активности амилаз, что, в свою очередь, приводило к снижению содержания Сахаров, в то время как обработки гибберелтшом восстанавливали как мужскую фертильность, так и нормальный уровень Сахаров (Bhadula and Sawhey, 1989). У других мутантов томата с дефицитом гибберелинов, gib-І и gib-2, развитие гаметофита прекращалось на ранних стадиях: у gib-І развитие пыльцы останавливалось в G1 премейотической интерфазы (Jacobsen and Olszewski, 1991), а у gib-2 спорогенные клетки дегенерировали, не вступая в мейоз (Nester and Zeevaart, 1988). Гибберелины синтезируются в пыльниках петунии и регулируют пост-мейотическОе развитие пыльников и транспортируются в венчик, индуцируя его рост и пигментацию (Izhaki et al., 2002). «Молчание» GAMYB, позитивного регулятора транскрипции гиббереллин-зависимой экспрессии ос-амилазы приводило к нарушениям в развитии пыльников и к мужской стерильности у риса. Абортация происходила во время мейоза, по-видимому, из-за нарушений в тапетуме, вызванных потерей функции OsGAMIB (Kaneko et al., 2004). Приведенные примеры подтверждают, что нарушения биосинтеза гибберелтіна блокируют развитие пыльцы до или после мейоза материнских клеток пыльцы. Роль остальных гормонов в развитии мужского гаметофита остается практически неисследованной. Основные свидетельства, косвенно подтверждающие участие того или иного фитогормона, были получены на стерильных мутантах. Например, изменение цитокининового метаболизма предполагают у стерильного мутанта арабидопсиса АРТ1 с дефицитом аденин фосфорибозилтрансферазы, у которого наблюдали изменения как в тапетуме, так и в материнских клетках микроспор перед мейозом (Zhang et al., 2002). На мутантах арабидопсиса показано, что нарушение транспорта ауксинов приводило к стерильности цветков (Holweg, Nick, 2004), а снижение уровней содержания стеролов сопровождается мужской стерильностью (Susuki et al., 2004). Для растений АБК-нечувствительного мутанта арабидопсиса (аЫ8) характерны замедленный рост, задержка цветения и мужская стерильность (Brocard-Gifford et al., 2004). В этом случае добавление глюкозы в среду культивирования положительно влияло на рост и жизнеспособность мутантов.
Динамика содержания АЦК и выделения этилена в развивающихся пыльниках при формировании фертильного мужского гаметофита и мужской стерильности
В процессе морфогенеза пыльник петунии проходит несколько этапов. В течение первого периода наряду с развитием микроспороцитов формируются все ткани пыльника. Затем происходит дифференциация слоев стенки микроспорангия, и материнские клетки микроспор вступают в мейоз, который заканчивается образованием тетрад микроспор. На фоне соответствующих изменений в стенке пыльника происходит распад тетрад, дифференциация микроспор, образование и созревание пыльцевых зерен (Батыгина с соавт., 1963; Vasil, 1973; Батыгина 1994, 2002, Heslop-Harrison, 1980; Резникова, 1984).
Сравнительное цитоэмбриологическое исследование двух фертильных (самосовместимого и самонесовместимого) клонов петунии выявило как общие черты, так и определенные различия в развитии их пыльников. У обоих фертильных клонов петунии пыльники, как и у других Solanaceae, состоят из четырех микроспорангиев. В каждом из четырех гнезд, в связнике образуются многоклеточные выросты - плацентоиды, которые врастают в полость микроспорангия и обусловливают его подковообразную форму. У самонесовместимого клона плацентоиды выражены более значительно и нередко практически полностью перегораживали локулы пыльников. В клетках связника у обоих клонов отмечено наличие кристаллов оксалата кальция. Подобные кристаллы впоследствии формируются на поверхности созревающих пыльцевых зерен петунии и, после опыления, попадают вместе с пыльцой на рыльца, где служат источником кальция для прорастающей пыльцы (Iwano et al., 2004). .
Развитие стенки микроспорангия у петунии, как и у всех Solanaceae, происходит по двудольному (центробежному) типу, т.е. первичный париев тал ьный слой делится периклинально, образуются вторичный париетальный слой и тапетум (Поддубная-Арнольди, 1982). Периклинальное деление вторичного парие тального слоя приводит к образованию средних слоев и эндотеция. Полностью сформированная стенка пыльников самосовместимого и самонесовместимого клонов петунии состоит из эпидермиса, фиброзного эндотеция, двух-трех средних слоев и секреторного тапетума. Тапетум - многослойный со стороны связника и одно-двух слойный - со стороны внешней стенки. У фертильного клона тапетум клеточно-секреторный, тогда как у самонесовместимого - . клеточно-секреторный с реорганизацией в амебоидный (фото 2А). В процессе микроспорогенеза клетки внутреннего из трех средних слоев сильно удлиняются и уплощаются и к моменту образования тетрад микроспор этот слой стенки пыльника уже значительно деформирован (фото 1А). Клетки тапетума становятся двуядерными к завершению мейоза, а затем многоядерными на стадии тетрад у обоих клонов. Число ядер в клетках тапетума на стадии тетрад может достигать 4-6 . Цитоплазма клеток тапетума к концу стадии тетрад становится менее окрашивающейся. У самонесовместимого клона на стадии тетрад микроспор наблюдались впячивания и выросты тапетальных клеток в полость пыльника (фото 2Б). У представителей обоих клонов микроспорогенез симультанного типа. Тетрады микроспор тетраэдральные, изолатеральные, реже крестообразные, в оболочках микроспороцитов отмечена каллоза, которая сохранялась вплоть до распада тетрад микроспор. На стадии микроспор, вышедших из тетрад, тапетум в значительной степени дезорганизуется и два средних слоя стенки пыльника разрушаются (фото 1Б). Примыкающие к тапетуму слои разрушаются раньше, а примыкающий к эндотецию средний слой сохраняется вплоть до стадии линзовиднои генеративной клетки. Ядра невакуолизированных микроспор лежат в центре клеток. Микроспоры активно растут, у них постепенно формируется экзина. По мере роста и развития микроспор вакуоли сливаются в одну крупную центральную вакуоль, что определяет полярность клетки. Ядро сильновакуолизированной микроспоры постепенно отодвигается крупной вакуолью и располагается в пристенном слое цитоплазмы напротив поры. В этот период заканчивается развитие оболочки микроспор. На стадии вакуолизированных микроспор тапетум уже частично деструктурирован (фото 1В). Клетки эндотеция увеличиваются в размерах, в отдельных клетках начинают формироваться фиброзные утолщения. Окончательное разрушение тапетума и средних слоев стенки пыльника происходило ко времени образования двуядерной пыльцы (фото 1Г). Со стороны связника исчезновение тапетума, как слоя, происходило в более ранние сроки; чем со стороны стенки пыльника (фото ЗА, ЗБ). Дальнейшее развитие сильновакуолизированной микроспоры связано с ее митотическим делением по обычной схеме. Зрелая пыльца двуклеточная. Развитие мужского гаметофита в основном происходило нормально, но у самонесовместимого клона формировалось большее количество недоразвитых пыльцевых зерен, что обуславливает менее высокую продуктивность этого клона. Кроме того, у самосовместимого клона наблюдали образование псевдомикроспор меньшего размера, как описано у Nicotiana tabacum (Ressayre et al., 2003), у 2 % тетрад, а у самонесовместимого клона - у 7 % тетрад от общего числа исследованных пыльников.
