Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Молекулярно-генетические аспекты развития глаза позвоночных, в том числе человека 7
1.1. Транскрипционные факторы, принимающие участие в развитии глаза позвоночных 7
1.2. Роль сигнальных белков в морфогенезе глаза 16
1.3. Определяющая роль взаимодействий регуляторных факторов в развитии глаза 22
1.4. Медико-биологические аспекты развития глаза человека 30
Глава 2. Материалы и методы исследования 36
2.1. Объект исследования 36
2.2. Препарирование тканей 36
2.3. Выделение тотРНК 37
2.4. Выделение мРНК 37
2.5. Синтез кДНК 38
2.6. Контроль на загрязнение геномной ДНК 39
2.7. Нормировка кДНК библиотек 39
2.8. Конструирование праймеров 40
2.9. Полимеразная цепная реакция 40
2.10. Агарозный электрофорез 41
2.11. Выделение ДНК из агарозного геля 41
2.12. Клонирование в векторе pCR II-TOPO 42
2.13. Выделение плазмидной ДНК 42
2.14. Подготовка РНК зондов 43
2.15. In situ гибридизация 45
2.16. Иммуногистохимия 46
2.17. Интернет-ресурсы 48
Глава 3. Результаты исследования 49
3.1. Анализ уровня экспрессии генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в структурах глаза в ходе развития 49
3.2. Локализация мРНК PITX2 в тканях развивающегося глаза 59
3.3. Локализация белков TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в тканях глаза на различных стадиях развития 64
3.3.1. Локализация белка TGFbeta2 64
3.3.2. Локализация белка PITX2 73
3.3.3. Локализация белка FOXC1 81
Глава 4. Обсуждение 89
4.1. Экспрессия TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в роговице и иридо-корнеальном углу глаза человека в ходе пренатального развития 89
4.2. Экспрессия TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в хрусталике в ходе пренатального развития 95
4.3. Экспрессия TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в сетчатке в ходе пренатального развития 98
4.4. Экспрессия TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в цилиарном теле в ходе пренатального развития 100
4.5. Экспрессия TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в пигментном эпителии в ходе пренатального развития 105
4.6. Заключение 108
Выводы ПО
Список литературы 112
- Роль сигнальных белков в морфогенезе глаза
- Выделение тотРНК
- Локализация мРНК PITX2 в тканях развивающегося глаза
- Экспрессия TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в хрусталике в ходе пренатального развития
Введение к работе
Изучение экспрессии регуляторных генов, их дифференциальной активности в ходе развития организма, участие в дифференцировке клеток различного типа представляет собой одно из центральных направлений современной биологии, находящееся на стыке молекулярной генетики и биологии развития. Глаз является уникальной модельной системой для исследования молекулярно-генетических механизмов эмбриональной индукции, пролиферации, дифференцировки, миграции клеток, апоптоза и других процессов в ходе его развития в онтогенезе.
Глаз позвоночных, в том числе человека, состоит из морфологически и функционально различающихся тканей, в формировании которых принимают участие различные эмбриональные ткани: поверхностная эктодерма, нейроэктодерма и мезенхима — производная нервного гребня. В ходе эмбриогенеза, кроме экспрессии основного каскада регуляторных факторов, важную роль играют и межклеточные взаимодействия тканей.
Развитие глаза обеспечивается согласованной работой множества регуляторных факторов, к которым относятся транскрипционные и РНКсвязывающие факторы и сигнальные белки. Большинство этих факторов активирует или ингибирует транскрипцию генов-мишеней. В настоящее время в литературе существует много данных по молекулярно-генетическим исследованиям формирования и нормального функционирования отдельных тканей глаза позвоночных. Многие работы посвящены изучению паттерна экспрессии регуляторных генов в ходе развития хрусталика, дифференцировки клеток сетчатки, иридо-корнеального угла, трабекулярной сети и др. (Cvekl, Piatigorsky, 1996; Close et al., 2005; Hsieh et al., 2002; Zhao et al., 2002). Существенным достижением последних десятилетий в области исследования глаза было обнаружение высокой консервативности молекулярных механизмов, направляющих развитие глаза у представителей различных систематических групп. Большой прогресс в понимании молекулярно-генетических механизмов развития достигнут при изучении глаза дрозофилы (Pignoni et al., 1997; Chen et al., 1997; Haider et al., 1998).
Полученные данные послужили отправной точкой для дальнейших исследований представителей других систематических групп животных. В геноме позвоночных, в том числе и человека, идентифицирован ряд высоко консервативных регуляторных генов, направляющих развитие глаза (Heanue et al., 2002; Hsieh et al., 2002; Tyas et al., 2006). В настоящее время известно, что для правильного формирования глаза необходима согласованная работа основного каскада селективно экспрессирующихся транскрипционных факторов PAX6/EYA1/SIX3/DACH1/PROX1/PITX2. На вершине этой иерархии находится ген Рахб/РАХб, который играет определяющую роль в развитии глаза (Gehring, 1996). Изучение механизмов генетического контроля развития глаза имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение, так как нарушение экспрессии регуляторных генов глазного поля является причиной возникновения множества наследственных заболеваний глаз (Glaser et al., 1994; Graw, 2003). Однако данные, существующие в литературе, разрознены и в ОСРЮВНОМ касаются экспрессии генов, кодирующих регуляторные факторы, в отдельных структурах глаза. Кроме того, исследования генотип-фенотип корреляции при заболеваниях глаз не позволяют составить полное представление о событиях, происходящих в ходе нормального развития глаза.
Мы сосредоточили внимание на полифункциональных регуляторных факторах: сигнальном белке TGFbeta2 и транскрипционных факторах PITX2 и FOXC1, поскольку известно, что гены, кодирующие эти факторы, начинают экспрессироваться на самых ранних этапах развития глаза позвоночных.
Существуют данные о том, что TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 являются участниками одного сигнального каскада. Нарушение работы любого из этих регуляторных факторов приводит к серьезным, часто фенотипически сходным аномалиям развития глаза.
Целью настоящей диссертационной работы являлось изучение пространственных и временных характеристик экспрессии генов, кодирующих сигнальный белок TGFbeta2 и транскрипционные факторы PITX2, FOXC1, в различных структурах глаза человека на последовательных стадиях пренатального развития (8-22 недели беременности).
Основные задачи работы:
1. Сконструировать кДНК библиотеки, комплементарные мРНК из различных тканей глаза человека с 9.5 до 22 недели пренатального развития.
2. Идентифицировать и изучить уровень экспрессии генов TGFbeta.2, Р1ТХ2 и FOXC1 в тканях глаза на последовательных стадиях развития.
3. Исследовать локализацию белковых продуктов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в тканях глаза с 8 до 22 недели развития.
4. Выявить пространственные и временные особенности экспрессии анализируемых генов в различных структурах развивающегося глаза человека.
Детальный анализ полученных данных позволил сделать выводы об особенностях экспрессии генов, кодирующих регуляторные факторы, в ходе развития глаза человека, а также высказать предположения о роли этих факторов в гистогенезе тканей глаза.
Роль сигнальных белков в морфогенезе глаза
Большую группу регуляторных факторов образуют сигнальные белки. Известно, что некоторые из них принимают участие в морфогенезе глаза позвоночных. Сигнальные белки находятся в тесном взаимодействии с транскрипционными факторами и функционируют в составе многокомпонентных сигнальных путей.
Большинство сведений, существующих в настоящее время в литературе, о роли сигнальных белков и их возможных взаимодействиях с другими регуляторными факторами в ходе морфогенеза глаза получены в результате исследований хрусталика. Относительная изоляция этой структуры позволяет рассматривать его в качестве наиболее удобной модели для исследования сигнальных путей. Кроме того, возможность исследования отдельного слоя эпителиальных клеток хрусталика позволяет изучать участие сигнальных белков в регуляции пролиферации этих клеток и дифференцировке волокон хрусталика (Chamberlain, Mcavoy, 1989).
Установлено, что в развитии глаза позвоночных основную роль играют несколько суперсемейств сигнальных белков: FGF (fibroblast growth factor), TGFalpha (Transforming Growth Factor alpha), TGFbeta, Hedgehog, Wnt, Notch. Рассмотрим некоторые из многочисленных данных литературы, свидетельствующие о полифункциональности сигнальных белков суперсемейства TGFbeta, их роли в морфогенезе глаза позвоночных и механизмы функционирования сигнального пути TGFbeta.
Суперсемейство сигнальных белков TGFbeta участвует в различных биологических процессах позвоночных: пролиферации, дифференцировке, апоптозе, морфогенезе и др. (Close et al., 2005; Hogan, 1996; Graham et al., 1994). По одной из классификаций к этому большому суперсемейству сигнальных белков относят семейства BMP (ВМР4, ВМР7), TGFbeta (TGFbetal, TGFbeta2 и TGFbeta3), activin, nodal, noggin.
Существуют данные о том, что сигнальные белки ВМР4 и ВМР7 играют ключевую роль в индукции хрусталиковой плакоды. Делеция генов BMP4 или ВМР7 приводит к нарушению формирования хрусталиковой плакоды у мышей (Furuta, Hogan, 1998; Wawersik et al., 1999). Белки семейства BMP также принимают участие в формировании цилиарного тела у мышей (Zhao et al., 2002). Другой представитель TGFbeta суперсемейства -noggin - является ингибитором связывания белков BMP с соответствующим трансмембранным рецептором. Наличие такого механизма регуляции показано в клетках ЦТ у эмбрионов мышей (Zhao et al., 2002).
Семейство белков TGFbeta составляет группу полифункциональных ростовых факторов, важнейшая роль которых в формировании глаза, была доказана в исследованиях глаза мыши (Saika et al., 2001; Miyazono, 2002; Ittner et al., 2005). Известно, что в глазу млекопитающих экспрессируются все три белка - TGFbetal, TGFbeta2 и TGFbeta3 (Pelton et al., 1991; Pasquale et al., 1993; Gordonhomson et al., 1998). Наличие мРНК TGFbeta2 и наличие соответствующего белкового продукта выявлена в различных тканях глаза у крыс и мышей (Gordonhomson et al., 1998; Pelton et al., 1991). У человека мРНК TGFbetal выявлена в эпителии хрусталика и в краевой области сетчатки у 6-недельного эмбриона (Gatherer et al., 1990). В глазу взрослого человека мРНК TGFbetal и соответствующий белок обнаружены в различных структурах глаза: роговице, хрусталике, ЦТ, сетчатке, ПЭ (Yamagami et al., 2004; Strzalka et al., 2008; Perees et al., 1994; Lee, Joo, 1999; Bian et al., 2007).
TGFbeta2 принимает участие в формировании различных структур глаза позвоночных, в том числе человека. Перечислим некоторые функции TGFbeta2 в глазу позвоночных:
В сетчатке TGFbeta2 выступает в качестве ингибитора митотической активности. Показано, что у постнатальных крыс этот сигнальный белок, который экспрессируется в амакриновых и ганглиозных клетках, ингибирует пролиферацию клеток предшественников и Мюллеровской глии (Close et al., 2005);
TGFbeta2 принимает участие в нормальной физиологии и патофизиологии хрусталика. Известно, что он регулирует процесс трансдифференцировки клеток эпителия хрусталика в мезенхимные клетки во время развития субкапсулярной катаракты у человека (Lee, Joo, 1999);
Косвенным указанием на участие TGFbeta2 в регуляции функционирования клеток трабекулярной сети глаза взрослого человека являются результаты эксперимента по органному культивированию переднего сегмента глаза человека (Gottanka et al., 2004). Так, обработка переднего сегмента глаза белком TGFbeta2 при органном культивировании приводит к уменьшению длины Шлеммова канала на 27% по сравнению с контрольными глазами. Кроме того, на этой модели показано, что TGFbeta2 регулирует экспрессию генов, связанных с синтезом внеклеточного матрикса (фибронектин и PAI-1) (Fleenor et al., 2006).
TGFbeta2 принимает участие в определении судьбы клеток нейромезенхимы, формирующих структуры переднего сегмента глаза. Показано, что у мышей инактивация гена TGFbeta2 приводит к неправильному развитию роговицы, структур угла глаза и ЦТ (Ittner et al., 2005).
Выделение тотРНК
Тотальную РНК из различных тканей глаза, хранившихся при -70С, выделяли при помощи смеси TRI Reagent (Sigma, США) по методике, предоставленной производителем.
Гомогенизация ткани. Выделенную ткань помещали в TRI Reagent (Sigma, США) и растирали тефлоновым пестиком в пробирке.
Экстракция РНК. После добавления хлороформа (1/5 объема) пробирку слегка встряхивали и помещали в лед на 5 мин. Затем центрифугировали суспензию на максимальных оборотах, соответствующих 14,000 g при 4С в течение 15 мин на центрифуге типа EPPENDORF 5417R.
Осаждение РНК. После переноса водной фазы в чистую пробирку, добавляли изопропанол, перемешивали и оставляли на 15 мин при 4С. Затем образцы центрифугировали на максимальных оборотах при 4С в течение 15 мин.
Промывка осадка РНК. Удалив надосадочную жидкость, осадок РНК промывали 75% этанолом, центрифугируя при 4С в течение 8 мин при 12,000 g.
Выделение мРНК из тотРНК, полученной из различных тканей глаза, проводили с помощью набора фирмы Силекс М (Россия) по методике, предоставленной производителем.
Растворение тотальной РНК. После удаления этанола осадок подсушивали в течение нескольких минут при комнатной температуре. Затем вносили 500 мкл воды, свободной от РНаз. Полученный раствор тотРНК инкубировали в водяной бане при 70С в течении 10 мин.
Отжиг (гибридизация) РНК. После извлечения из водяной бани в раствор тотРНК вносили 3 мкл (136 пмолей) биотин-меченного праймера и мкл 10х промывочного буфера. Смесь тщательно перемешивали и оставляли стоять при комнатной температуре до полного охлаждения.
Подготовка магнитных частиц. 60 мкл магнитных частиц промывали три раза 200 мкл 0,5 х промывочного буфера. Суспендировали частицы, затем собирали их с помощью магнитного штатива и удаляли супернатант. После этого магнитные частицы суспендировали в 50 мкл 0,5х промывочного буфера. В пробирку с отмытыми магнитными частицами переносили смесь тотРНК, гибридизованной с биотин-меченным праймером, тщательно перемешивали и оставляли на 10 мин при комнатной температуре. Собирали магнитные частицы с помощью магнитного штатива и отбирали супернатант. Промывали магнитные частицы, используя магнитный штатив, четыре раза по 400 мкл 0,1х промывочным буфером.
Элюция мРНК. Суспендировали магнитные частицы в 25 мкл воды, свободной от РНаз, и инкубировали при 70С 5 мин. Собирали магнитные частицы с помощью магнитного штатива и переносили супернатант, содержащий мРНК, в стерильную пробирку.
Синтез первой цепи кДНК выполняли на матрице мРНК с помощью фермента обратной транскриптазы Superscript (GIBCO BRL, США) и гексануклеотидов фирмы Силекс М (Россия).
К 17 мкл раствора мРНК добавляли 1 мкл random праймер, инкубировали при 70С в течение 10 мин и охлаждали на льду. Затем добавляли 4 мкл 5х реакционного буфера, 2 мкл 0.1М DTT и 1 мкл смесь дНТФ. Выдерживали в течение 10 мин при комнатной температуре, затем добавляли 2 мкл полимеразы. Конечный объём реакционной смеси составлял 40 мкл. Инкубировали в водяной бане в течение 60 мин при 42С, а затем 10 мин - при 70С для остановки реакции.
Используемый нами протокол синтеза кДНК на матричной РНК позволяет на несколько порядков снизить вероятность контаминации геномной ДНК. Однако, нами был проведен дополнительный контроль. Были синтезированы праймеры для РАХб из разных экзонов (9-го и 10-го) (Таблица 2). Серым выделены последовательности праймеров. Получение двух ПЦР-фрагментов (252 и 350 н.п.) означает считывание последовательности интрона в 98 н.п., которая находится между 9-м и 10-м экзонами. Амплификацию проводили при 40 циклах. На всех проанализированных кДНК библиотеках был получен только один фрагмент размером 252 н.п., что свидетельствует об отсутствии контаминации геномной ДНК.
Для оценки уровня экспрессии исследуемых генов, кДНК из тканей глаз были предварительно отнормированы по рибосомальному белку, RPL19, количество мРНК которого в клетках различного типа считается одинаковым. Праймеры для RPL19 представлены в таблице 3. кДНК считались отнормированными, если уровень экспрессии RPL19 в библиотеках различных структур глаза был одинаков. В случае необходимости изменяли количество кДНК в реакционной смеси.
Локализация мРНК PITX2 в тканях развивающегося глаза
Для подтверждения и уточнения данных ГШР-анализа об экспрессии одного из исследуемых генов - PITX2 - был использован метод in situ гибридизации, который позволил локализовать мРНК этого гена в глазу человека на 9.5-10 и 20 неделях развития. Для этого синтезировали антисмысловой РНК-зонд, комплементарный мРНК PITX2, и смысловой РНК-зонд, идентичный мРНК изучаемого гена, используемый в качестве отрицательного контроля. Эффективность мечения зондов оценивали на фильтрах, методом прямой детекции РНК, с использованием антител к дигоксигенину и последующей колориметрической реакцией. Подбирали концентрацию зонда, достаточную для проявления отчетливого гибридизационного сигнала, при практически отсутствующем фоновом окрашивании.
В ходе подготовки материала, а точнее на этапе приготовления криосрезов, мы столкнулись с трудностями работы с глазом, находящимся на ранней стадии развития, соответствующей 9.5-10 неделе. Так как на этой стадии развития роговица очень тонкая, то трудно избежать ее механического повреждения. В связи с этим нам не удалось проанализировать локализацию мРНК PITX2 в роговице на 9.5-10 неделе пренатального развития.
Распределение мРНК РІТХ2 в тканях глаза человека на ранней стадии, соответствующей 9.5-10 неделям развития, имеет следующий характер (Рис. 18). Транскрипты РІТХ2 на этой стадии выявлены в эпителии (эпхр) и формирующихся волокнах хрусталика (вхр) (Рис. 18.А), в которых активно идут процессы пролиферации и дифференцировки. Кроме того, мРНК исследуемого гена выявлена в области формирующегося иридо-корнеального угла в мигрирующих клетках нейромезенхимы (мк) (Рис. 18.В). Эти клетки участвуют в формировании всех структур переднего сегмента глаза и склеры.
Нами выявлена экспрессия гена PITX2 в наружном (ннс) и внутреннем (вне) нейробластических слоях сетчатки (Рис. 18.Д), в которых идет дифференцировка клеток. В контроле ни в одной анализируемой ткани окрашивания не наблюдается (Рис. 18.Б,Г,Е). Темная полоса на рисунке 18.Г,Е соответствует пигментному эпителию (пэ).
На поздней стадии развития, соответствующей 20 неделе, с помощью in situ гибридизации выявлены некоторые отличия в локализации мРНК Р1ТХ2 (Рис. 19). Глаз на этой стадии развития значительно продвинут в развитии по сравнению с 9.5-10 неделей. Гибридизационный сигнал выявлен в клетках эпителия (эпр), эндотелия (энр) и стромы (стр) роговицы (Рис. 19.А). В хрусталике окрашивание детектируется в ядрах эпителия (эпхр) и формирующихся волокнах (вхр) (Рис. 19.В).
В сетчатке к 20 неделе развития, по сравнению с 9.5-10 неделей, произошли существенные изменения в морфологии. Сформировались все слои сетчатки, продолжается дифференцировка клеток ганглиозного и внутреннего ядерного слоев. Кроме морфологических изменений наблюдается изменение в распределении мРНК PITX2 в этой структуре. В сетчатке на этой стадии развития мРНК PITX2 локализуется в ядрах клеток внутреннего ядерного слоя (вяс) и ганглиозного слоев (гк) (Рис. 19.Д). В клетках наружного ядерного слоя (няс) сетчатки окрашивания не выявлено. В контроле гибридизационного сигнала не обнаружено (Рис. 19.Б,Г,Е).
Таким образом, использование метода in situ гибридизации позволило нам выявить спектр распределения мРНК PITX2 в различных тканях глаза человека на 9.5-10 и 20 неделях пренатального развития. Полученные данные по локализации мРНК РІТХ2 в клетках роговицы, хрусталика и сетчатки совпадают с результатами ГЩР-анализа о наличии транскриптов РІТХ2 в этих структурах. Метод in situ гибридизации не позволяет выявить окрашивание в клетках пигментного эпителия из-за содержания в них пигментных гранул. Для этого необходимо использование других методов, например, флуоресцентное окрашивание. Тем не менее, нам удалось выявить локализацию PITX2 в ряде других тканей и проследить изменение распределения экспрессии этого гена в ходе развития. Интенсивный гибридизационный сигнал на 20 неделе развития детектируется во всех слоях роговицы (Рис. 19.А). В эпителии и формирующихся волокнах хрусталика мРНК PITX2 выявлена на 9.5-10 и 20 неделях развития (Рис. 18.А, Рис. 19.В). В сетчатке локализация экспрессии гена PITX2 изменяется в ходе развития: на 9.5-10 неделе PITX2 детектируется во внутреннем (вне) и наружном (ннс) нейробластических слоях (Рис. 18.Д), а на 20 неделе - во внутреннем ядерном слое (вяс) и слое ганглиозных клеток (гк) (Рис. 19.Д).
Экспрессия TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в хрусталике в ходе пренатального развития
В ходе эмбриогенеза дифференцировка клеток хрусталика начинается очень рано, на стадии формирования глазного бокала и хрусталикового пузырька, что соответствует 4-5 неделям пренатального развития. Клетки эпителия хрусталика смещаются в экваториальную область хрусталика, удлиняются и по мере перемещения в зону ядра хрусталика денуклеируются. Рост хрусталика продолжается всю жизнь за счет пролиферации эпителиальных клеток экваториальной области, формирующих новые хрусталиковые волокна.
Ряд особенностей этой структуры, в частности относительная изоляция хрусталика, позволяет рассматривать его в качестве удобной модели для исследования. Молекулярно-генетические механизмы гистогенеза хрусталика достаточно хорошо изучены (Beebe et al., 2004; Dawes et al., 2007; Wormstone et al., 2004). Однако данные по экспрессии транскрипционных факторов Pitx2/PITX2 и Foxcl/FOXCl в ходе гистогенеза хрусталика человека в литературе отсутствуют. Имеются данные об экспрессии гена FOXC1 в хрусталике глаза взрослого человека. При этом с помощью количественного метода ПНР в реальном времени показано, что уровень экспрессии этого гена в хрусталике ниже, чем в других тканях глаза (Wang et al., 2001).
Нами впервые получены результаты, свидетельствующие о наличии мРНК Р1ТХ2 и FOXC1 в хрусталике с 9.5 до 21 недели пренатального развития (Рис. 12-17). С помощью in situ гибридизации показано, что мРНК PITX2 локализуется в ядрах клеток эпителия и формирующихся волокон хрусталика как на ранней стадии развития, соответствующей 9.5 неделе (Рис. 18.А), так и на более продвинутой, соответствующей 20 неделе (Рис. 19.В). Эти данные согласуются с результатами иммуногистохимического анализа о локализации белков PITX2 и FOXC1 в ядрах клеток эпителия и формирующихся волокон хрусталика в период с 8 до 22 недели развития (Рис. 24.А; Рис. 25.В; Рис. 26.В; Рис. 27.В; Рис. 28.А; Рис. 29.В; Рис. 30.В; Рис. 31.В).
Результаты исследования экспрессии генов PITX2 и FOXC1 в хрусталике с 8 до 22 недель пренатального развития, когда активно идет морфогенез этой структуры, позволяют предположить участие транскрипционных факторов РІТХ2 и FOXC1 в процессах гистогенеза хрусталика: пролиферации, дифференцировке. Полученные нами результаты могут свидетельствовать о новых еще не известных функциях РІТХ2 и FOXC1 в морфогенезе глаза человека. Функциональная роль этих транскрипционных факторов в формировании хрусталика не ясна и требует дальнейших исследований.
Экспрессия гена, кодирующего сигнальный белок TGFbeta2, изучена достаточно хорошо в хрусталике взрослого человека (Kampmeier et al., 2006; Dawes et al., 2007; Yao et al., 2008). Известно, что мутации этого гена приводят к различным аномалиям хрусталика (Lee et al., 2002; Shirai et al., 2006).
Систематические исследования экспрессии гена TGFbeta2 в период с 9.5 до 22 недели развития в хрусталике человека нами проведены впервые.
Показано наличие мРНК TGFbeta2, как PITX2 и FOXC1, в хрусталике в анализируемый период развития (Рис. 12-17). С помощью иммуногистохимии показано, что TGFbeta2 в хрусталике имеет дифференциальный характер экспрессии. На 10.5 неделе развития белок TGFbeta2 локализуется в клетках эпителия и формирующихся волокнах хрусталика (Рис. 20.В), что вероятно связано с участием этого сигнального белка в регуляции процесса пролиферации. Это предположение подтверждается данными о том, что на последующих стадиях развития, 12, 17 и 24 недели, белок TGFbeta2 выявляется в герминативной зоне (Рис. 21.В, Рис. 22.В; Рис. 23.В), в которой локализуются пролиферирующие клетки. Полученные нами результаты согласуются с данными литературы об экспрессии гена TGFbeta2 в герминативной и транзиторной зонах и формирующихся волокнах хрусталика у взрослых крыс и мышей (Pelton et al., 1991; Gordonhomson et al., 1998). В эпителии хрусталика человека с 12 до 22 недель TGFbeta2 не выявлен, так же как в хрусталике взрослых мышей (Pelton et al., 1991). Но известно, что у мышей хрусталик является основным источником этого белка для других тканей развивающегося глаза (Ittner et al., 2005).
Полученные нами результаты и данные литературы свидетельствуют о том, что TGFbeta2 не только принимает участие в нормальной физиологии и патофизиологии хрусталика взрослого человека, но и регулирует гистогенез этой структуры в эмбриогенезе. Экспрессия этого сигнального белка в пролиферирующих клетках переднего эпителия хрусталика на 10.5 неделе и в герминативной зоне хрусталика с 12 до 22 недель может быть связана с участием TGFbeta2 в гистогенезе хрусталика в качестве регулятора пролиферации.
