Введение к работе
Актуальность проблемы. Нох- и РагаНох-геиы - эволюционно
консервативные, кластерные регуляторные гены, важные участники разнообразных морфогенезов у билатеральных животных. Кластеры Нох- и РагаНох-генов, вероятно, приходятся друг другу паралогами, и возникли при дупликации древнего ProtoHox-кластера еще до расхождения Cmdaua и Bilatena (Brooke et al, 1998, Fernei, Holland, 2001; Gaicia-Feinandez, 2005). В полноразмерном виде Нох- и РагаНох-кластери обнаружены только у Bilatena. Возможно, само возникновение Bilatena сопряжено с появлением полноразмерных Нох- и РагаЯаг-кластеров, число генов в которых увеличивалось за счет дупликаций и дивергенции.
Яох-гены давно известны в качестве ключевых спецификаторов передне-задней оси. Пространственная колинеарность их экспрессии обнаружена у представителей всех трех эволюционных ветвей Bilatena: Deuterostomia (ланцетник, курица, мышь), Ecdysozoa (насекомые, ракообразные), и Lophotiochozoa (полихеты, моллюски).
ParaHox-кластер состоит из трех генов - Gsx/Gsh, Xlox/Pdx и Cdx/Cad. Этот кластер, впервые описанный у ланцетника (Biooke et al., 1998), исследован далеко не так подробно. Широкий анализ функции РагаЯох-кластера в рамках больших филогенетических категорий осложнен эволюционной утратой отдельных РагаНох-генов у классических объектов биологии развития. У дрозофилы нет гена ХЬх, а у нематоды C.elegans сохранился только Cad (Pall)). Ланцетник и позвоночные обладают целостным и полноразмерным РагаНох-кпастером, который мог сохранить анцестральные черты, как организации, так и функции.
Согласно версии Питера Холанда (Holland, 2001) - первооткрывателя РагаНох-кластера, этот кластер мог участвовать в дифференциации пищеварительной трубки у последнего общего предка Bilatena. Известно, что Xlox и Cad - комплементарным образом паттернируют у ланцетника и млекопитающих пищеварительную трубку от двенадцатиперстной до задней кишки. Однако, у всех изученных вторичноротых животных, передний ParaHox - Gsh, не экспрессируется в передних отделах пищеварительной системы. У мыши транскрипты Gshl (кластерный ген) и Gsh2 (внекластерный ген) обнаружены в отдельных клетках уже оформленной поджелудочной железы (Rosanas-Urgell et al, 2005), в развивающемся головном и спинном мозге (Valeiius et al., 1995; Goibin et al, 2000 ). Возможно, у Deuterostomia, ортологи Gsh утратили анцестральную функцию в связи с изменениями в программе развития стомодеума. Если это так, разумно вести поиск анцестральной функции ParaHox-кластера среди Piotostomia - первичноротых животных из эволюционных ветвей Ecdysozoa и Lophotiochozoa
У первичноротых из эволюционной ветви Ecdysozoa не найден представитель с полноразмерным кластером РагаНох-тенов. Gsh (Ind) дрозофилы не экспрессируется в стомодеуме, но его транскрипт и белок обнаруживаются в отдельных клетках головного мозга и в промежуточных нейронах вентрального нервного ствола. Cad у Drosophila важный координационный ген, необходимый для формирования многих структур задней области тела, в том числе и задней кишки. К сожалению, нет данных о картине транскрипции ParaHox-генов у базовых Ecdysozoa, в частности у примитивных ракообразных и хелицеровых.
Среди Lophotiochozoa обнаружены виды, сохранившие все гены РагаНох-кластера (Barucca et al, 2006; Ferner, Holland, 2001, Park et al, 2006, Frobius, Seaver, 2006). К сожалению данных о характере экспрессии этих генов очень мало. Единственная работа, посвященная этой тематике была выполнена на полихете из рода Capitella (Fiobius, Seaver, 2006). Это единственный представитель
-4-Lophotrochozoa, у которого была изучена экспрессия всех ParaHox-геяоъ. У Capitella ортолог Gsh - Capl-Gsx экспрессируется только в парных ганглиях головного мозга. Удивительно, но постериорный ParaHox - Capl-Cdx, коэкспрессируется здесь с Capl-Gsx, и имеет ещё несколько необычных для него доменов экспрессии Известно, что Capitellidae далеки от базальных представителей типа (Bleidorn et al., 2003; Hall et al., 2004), что делает их не самыми удачным объектами для поиска анцестральных морфогенетических программ. Возможно, аберрантная во многих отношениях экспрессия Capl-Cdx (в развивающемся мозге и в передних отделах кишки) - один из косвенных показателей этой филогенетической удаленности от предковой формы.
Таким образом, среди исследованных Bilatena, не найден представитель с колинеарной экспрессией РагаНох-генов в границах единой тканевой системы или системы органов. Это может означать, что координированная экспрессия генов ParaHox-кластера или была рано утрачена во всех трех эволюционных ветвях Bilatena, или не существовала вовсе. В последнем случае остается открытым вопрос о тех механизмах, которые поддерживают структурную целостность кластера ParaHox-генов у Deuterostomia. Поскольку это состояние не может быть вторичным, очевидно, кластерность РагаНох-генов должна иметь функциональный смысл. Сопряженная активность кластерных генов может говорить о наличии единого регуляторного модуля у всей системы этих генов или о вторичной, сайт-специфической регуляции каждого из участников, сохраняющей, тем не менее, такую упорядоченность в силу эволюционной инертности. Поиск координированной экспрессии РагаЯол-кластера, как следствия координированной регуляции, стал предметом настоящего исследования
Объект, на котором проводилось исследование - эррантная полихета Nereis virens, относится к более примитивным полихетам, чем Capitella (Bleidoin et al., 2003). Для этой полихеты характерно наличие двух личиночных стадий - не сегментированной трохофоры и сегментированной нектохеты. Исследование древних регуляторных генов, таких как Нох- и ParaHox гены, чрезвычайно интересно у видов с непрямым развитием, поскольку личиночная экспрессия может пролить свет на анцестральную роль этих генов, стоящих у истоков морфологического разнообразия Bilatena
Цель и задачи исследования. Основная цель представленной работы - как можно более полно охарактеризовать экспрессию генов РагаЯог-кластера у полихеты Nereis virens, чтобы дать сравнительную характеристику общим и частным закономерностям экспрессии этих регуляторов у типичного представителя ветви Lophotrochozoa. Были поставлены следующие задачи:
Выявить паттерны экспрессии ParaHox-тенов на разных стадиях ларвального и постларвального онтогенеза Nereis virens.
Провести сравнительный анализ особенностей ларвальной и постларвальной экспрессии.
Исследовать характер экспрессии ParaHox-тенов, на предмет возможной осевой упорядоченности.
Научная новизна работы. В представленной работе впервые показана
колинеарная экспрессия генов РагаЯос-кластера. Аксиально-упорядоченный рисунок транскрипции трех ParaHox-гепов обнаружен в пределах двух тканевых систем -пищеварительной и нервной Этот факт подтверждает гипотезу о возможном анцестральном участии ЛггаЯоя-кластера в паттернировании пищеварительной трубки у общего предка билатеральных животных. Исследование впервые выявило параллель в характере активации кластеров Нох- и ParaHox-геноь. Эти данные указывает на возможность существования механизма, управляющего координированной экспрессией предкового ProtoHox-кластера, присущего последнему общему предку Bilateria и Cnidana.
-5-Практическая ценность. Приведенные данные позволяют говорить об особенностях ЛггаЯоя-экспрессии на уровне большой таксономической категории -Eumetazoa и помогают лучше представить последнего гипотетического предка Bilatena.
Апробация работы. Данные диссертационной работы были представлены на III съезде ВОГИС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004) и на симпозиуме «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза (Москва, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 108 стр., состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Текст диссертации иллюстрирован 49 рисунками и 26 цветными таблицами.
