Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Регенерация и индивидуальное развитие 8
2.2. Морфофункциональная организация пищеварительного тракта у взрослых голотурий 11
2.2.1. Пищеварительный (выстилающий) эпителий И
2.2.2. Соединительнотканный слой 12
2.2.3. Мезотелий 13
2.2.4. Нервное сплетение 13
2.3. Развитие пищеварительной трубки в онтогенезе голотурий 14
2.3.1. Развитие с полным метаморфозом 14
2.3.2. Развитие с укороченным метаморфозом 15
2.3.3. Проблема происхождения выстилки передних и задних отделов пищеварительного тракта 75
2.4. Физиологическая регенерация кишечного эпителия 16
2.5. Репаративная регенерация пищеварительной трубки 16
2.5.1. Эвисцерация 17
2.5.2. Регенерация у Aspidochirota 18
2.5.3. Регенерация у Dendrochirota 22
2.5.4. Регенерация у Apoda 23
2.5.5. Изменение способности к регенерации в ходе онтогенеза голотурий 23
3. Материал и методика 25
4. Результаты 27
4.1. Строение пищеварительной трубки голотурии eupentacta
Fraudatrixв норме 27
4.2. Развитие пищеварительной трубки в онтогенезе 39
4.3. Регенерация пищеварительной трубки у пентактул 54
4.3.1. Макроморфология регенерирующей пищеварительной трубки... 54
4.3.2. Ультраструктура регенерирующего пищеварительного тракта54
4.4. Регенерация пищеварительной трубки у взрослых голотурий 62
4.4.1. Макроморфология регенерирующей пищеварительной трубки... 62
4.4.2. Микроскопическое строение регенерирующей пищеварительной трубки 64
5. Обсуждение 71
5.1. Строение пищеварительной трубки голотурии eupentacta fraudatrix ъпошь 71
5.2. Формирование пищеварительной трубки в ходе индивидуального развития 75
5.3. Регенерация пищеварительной трубки 77
5.3.1. Стадии регенерации пентактул 77
5.3.2. Стадии регенерации взрослых животных 78
5.3.3. Клеточные источники 79
5.3.4. Изменение механизмов регенерации в онтогенезе 83
5.4. Индивидуальное развитие и регенерация 85
6. Заключение 89
Выводы 91
Список литературы 93
- Пищеварительный (выстилающий) эпителий
- Репаративная регенерация пищеварительной трубки
- Регенерация пищеварительной трубки у пентактул
- Регенерация пищеварительной трубки
Введение к работе
Актуальность проблемы. Регенерация и эмбриогенез являются отражением общей для всех живых существ способности к морфогенезу. Внешнее их сходство заключается в том, что в результате обоих этих процессов происходит формирование новой структуры. В подавляющем большинстве случаев структура, образованная в результате регенерации как морфологически, так и функционально практически не отличается от той, которая была утрачена. В этом случае возникает -вопрос: если регенерация той или иной части тела и ее развитие в ходе онтогенеза могут иметь одинаковый конечный результат, то может ли морфогенез при регенерации рассматриваться как рекапитуляция морфогенетических процессов индивидуального, развития? С одной стороны, поскольку при регенерации образуется заново такой же орган, как и удаленный, то нельзя ожидать, что пути развития этих орі-анов будут совершенно различными. Однако, с другой стороны, сходство между онтогенезом и регенерацией никогда не бывает полным, всегда имеются различия, выраженные в большей или меньшей степени (Лиознер, 1982).
Сравнение индивидуального развития и регенерации полезно в том отношении, что оно позволяет лучше понять характерные особенности обоих процессов. Такое сопоставление также способствует более глубокому пониманию механизмов морфогенеза и их изменений при тех или иных условиях. К сожалению, к настоящему времени только очень немногие органы изучены в достаточной степени для того, чтобы можно было провести детальное сравнение морфогенеза одних и тех же структур при регенерации и в ходе индивидуального развития животного. К числу таких модельных систем относятся конечность, хвост, хрусталик и сетчатка амфибий, а также скелетные мышцы позвоночных (см. обзоры: Карлсон, 1986; Carlson, 1998). Аналогичные данные относительно органов беспозвоночных еще более редки (Долматов, 1996а; Bely, Wray, 2001; Dolmatov, Ginanova,2001).
Голотурии представляют собой удобный объект для изучения процессов регенерации, так как они обладают способностью к относительно быстрому восстановлению утраченных частей тела после самых разнообразных повреждений (Hyman, 1955;.гДолматов, 1999). В частности, эти животные могут в течение нескольких недель полностью восстанавливать внутренние органы, утраченные при эвисцерации. .
Макроанатомические особенности регенерации пищеварительной трубки у взрослых голотурий изучены относительно подробно, выдвинут ряд гипотез о происхождении клеточных источников регенерации (Kffle, 1935; Dawbin, 1949; Smith, 1971а; Mosher, 1956; Bai, 1971; Gibson, П;»Ч"Г, 1W»; і г-іь* ии-Пм.іі.а^^. et al., 1998; Garcia-Arraras et al, 1999; SantfegS^-att^JtTOofimjjaKO аналогичные дан-
l СПетер*»г и, \
\ 09 УЗУ"*.-И)
4 ные для более ранних стадий онтогенеза отсутствуют. Долматовым (1994; 1996а) бьшо показано, что способность к регенерации у голотурий и ее механизмы зависят от возраста животного, тем не менее, причины этого и конкретные механизмы до сих пор не описаны.
Наиболее интересной в этом отношении оказалась голотурия Eupentacta fraudatrix (Holothuroidea, Dendrochirota), пентактулы которой способны восстанавливать утраченные задние части тела, а взрослые особи - только передние (Долматов, 1994).
Общая характеристика.индивидуального развития К fraudatrix была дана. Долматовым и Юшиным (Dolmatov, Yushin, 1993). Ими бьшо показано, что этот вид характеризуется лецитотрофным типом развития с укороченным метаморфозом и отсутствием катастрофической трансформации внутренних органов. В то же время характер закладки и дифференцировки тканей пищеварительной трубки-был освещен недостаточно полно.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение и сравнительный анализ клеточных механизмов морфогенеза пищеварительной системы у голотурии Eupentacta fraudatrix в оэтогенезе и при регенерации после различных способов повреждения. В этой связи необходимо бьшо решить следующие задачи:
Изучить особенности формирования пищеварительной трубки в ходе индивидуального развития голотурии Еfraudatrix.
Исследовать нормальное гистологическое строение стенки пищеварительного тракта у взрослых особей данного вида.
Изучить клеточные механизмы репаративной регенерации пищеварительной трубки у голотурии Е. fraudatrix на разных стадиях онтогенеза
На основании полученных собственных результатов и данных других авторов сравнить различные типы морфогенетических механизмов формировать пищеварительной трубки в ходе индивидуального развития и при регенерации у TtmyrypwiE.fraudatrix.
Научная новизна. На основе наших собственных детальных исследований впервые сделана попытка сопоставления морфогенетических механизмов, лежащих в основе формирования пищеварительной трубки голотурии в ходе нормального онтогенеза и при регенерации. Для изучения цитологических особенностей процессов развития и восстановления были применены современные морфологические методы световой и электронной микроскопии.
При решении этой главной задачи нами бьшо проведено детальное гистологическое исследованиеххроения разных отделов пищеварительной трубки у массового дальневосточного, бида голотурий Е. fraudatrix (Holothuroidea, Dendrochirota),
5 послужившего нам модельным объектом. Впервые на ультрастуктурном уровне исследовано становление тканей пищеварительной трубки в ходе онтогенеза голотурии. Впервые изучены механизмы регенерации пищеварительной трубки у пен-тактул (ювенильных особей) голотурии, показано их принципиальное отличие от таковых у взрослых животных. Кроме того, нам впервые удалось получить доказательства в пользу того, что при регенерации пищеварительной трубки у взрослых голотурий отряда Dendrochirota пищеварительный эпителий может возникать из клеток мезодермального происхождения.
Теоретическое и практическое значение работы. Сопоставление регенерации и нормального онтогенеза важно для понимания наиболее общих закономерностей морфогенеза. Полученные данные дополняют представления о биологии развития- голотурий. Голотурия 1 fraudatrix характеризуется -разнообразием восстановительных реакций на разных стадиях жизненного цикла и поэтому может представлять собой удобный модельный объект для изучения регуляции морфогенетических процессов. Основные результаты работы могут быть включены в программу общих и специализированных курсов по биологии развития для высших учебных заведений.
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались на 1 и 2-й Региональных конференциях по актуальным проблемам морской биологии и экологии (Владивосток, 1998, 1999); ежегодных научных конференциях института биологии моря ДВО РАН (Владивосток, 1999, 2000, 2002); Региональной конференции молодых ученых "Биомониторинг и рациональное использование морских и пресноводных гидробионтов" (ТИНРО, Владивосток, 1999); 2-й немецкоязычной конференции по иглокожим (Германия, Берлин, 2002); региональной конференции молодых ученых ДВО РАН (Владивосток, 2002); 11-й международной конференции по иглокожим (Германия, Мюнхен, 2003); 1-м съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ и 2 находятся в печати.
Структура и объем диссертации. Работа построена в соответствии с традиционным планом и включает в себя введение, обзор литературы, краткую характеристику методов исследования, изложение собственных результатов автора, обсуждение полученных данных и их сопоставление с наблюдениями других авторов,-заключение, выводы и список литературы (104 источника, из которых 33 на русском и 71 на иностранных языках). Диссертация изложена на 101 странице и содержит 22 рисунка.
Пищеварительный (выстилающий) эпителий
Передние и задние отделы пищеварительного тракта (глотка, пищевод, желудок и клоака) выстланы кутикулярным эпителием, образованным Т-образными клетками. Т-образные клетки состоят из плоской апикальной пластинки, тонкой шейки и расширенной ядросодержащей базальной части; по ультраструктуре они сходны с эпидермальными клетками покровов тела. Апикальные части клеток связаны между собой посредством щелевидных или септированных контактов, а их шейки и базальные части отделены друг от друга прослойками соединительной ткани. Выстилающий эпителий отграничен от подлежащей соединительной ткани базальной мембраной, к которой Т - образные клетки прикреплены при помощи полудесмосом. Снаружи Т-образные клетки покрыты кутикулоподобной пластинкой, которая является продолжением кутикулы покровов тела. В цитоплазме располагаются гетерофагосомы, пиноцитозные пузырьки, а также скопления секреторных гранул, содержащих нейтральные гликопротеины и липиды, вероятно, участвующие в построении кутикулы (Feral, Massin, 1982; Елисейкина, 1993; Smiley, 1994; Елисейкина, Лейбсон, 1996). В составе выстилки пищевода и клоаки наряду с Т-образными клетками описаны специализированные железистые клетки - мукоциты. Они могут быть довольно многочисленными и составлять большую часть эпителиального пласта. (Fish, 1967; Feral, Massin, 1982; Елисейкина, Лейбсон, 1996).
Выстилающий эпителий кишечника, в отличие от остальных отделов пищеварительной трубки, не покрыт кутикулой и образован высокими столбчатыми эн-тероцитами. Ферал и Массен (Feral, Massin, 1982) предложили различать три типа энтероцитов.
Везикулярные энтероциты - наиболее многочисленный клеточный тип в кишечнике голотурий. Надъядерная цитоплазма этих клеток заполнена многочисленными плотно расположенными вакуолями с электронопрозрачным содержимым. Эти везикулы дают положительную ШИК-реакцию и содержат нейтральные муко-полисахариды. В цитоплазме везикулярных энтероцитов содержатся также гетеро-фагосомы и миелиноподобные тела.
Гранулярные энтероциты характеризуются наличием в надъядерной цитоплазме округлых электроноплотных секреторных гранул. Содержимое этих гранул, предположительно, имеет зимогеновую природу.
Типичные энтероциты — клетки с многочисленными плотно расположенными митохондриями и хорошо развитым гладким ретикулумом в базалыюй части клетки. Некоторые типичные энтероциты содержат вакуоли с секретом смешанной природы.
В кишечном эпителии встречаются также мукоциты, содержащие крупные электронопрозрачные вакуоли, которые дают положительную реакцию на кислые и/или нейтральные мукополисахариды ( Kawaguti, 1964; Fish, 1967; Feral, Massin, 1982; Елисейкина, 1993; Smiley, 1994; Елисейкина, Лейбсон, 1996).
Соединительная ткань в стенке пищеварительного тракта образована ШИК-положительным основным веществом, содержащим нерегулярно расположенные исчерченные коллагеновые волокна и целомоциты. Соединительнотканная прослойка обычно состоит из двух частей: внутренней рыхлой, в которой расположены гемальные лакуны, и наружной волокнистой. Спикулы, если они есть, чаще всего расположены в наружном соединительнотканном слое (Kawaguti, 1964; Feral, Massin, 1982).
Просвет гемальных лакун заполнен ШИК-позитивной жидкостью, богатой белками, здесь же встречаются все типы целомоцитов. Граница между соединительной тканью и гемальной полостью не всегда четкая, поскольку гемальные сосуды лишены эндотелиальной выстилки (Hyman, 1955; Jensen, 1975), и только для Isostichopus badionotus был описан нерегулярный эндотелий (Herreid et al., 1976, 1977). Иногда гемальная лакуна может быть выстлана мелкими целомоцитами, которые образуют псевдоэндотелий (Feral, Massin, 1982).
Мезотелий голотурий образован двумя основными типами клеток: миоэпите-лиальными клетками и перитонеоцитами (Kawaguti, 1964; Rosati, 1968; Feral, Massin, 1982; Smiley, 1994). Миоэпителиальные клетки формируют продольный и кольцевой слои мускулатуры стенки пищеварительной трубки. Перитонеальные клетки несут на своей апикальной поверхности ресничку, окруженную воротничком микроворсинок (Rosati, 1968; Feral, Massin, 1982). В цитоплазме этих клеток располагается аппарат Гольджи, митохондрии, эндоплазматический ретикулум, а также липидные включения. Перитонеоциты имеют базальные отростки, которые проходят между миоэпителиальными клетками, сквозь нервное сплетение и достигают базальной мембраны. У Aspidochirota, Dendrochirota и Synaptida между пери-тонеальными клетками могут располагаться слизистые клетки (Rosati, 1968; Feral, Massin, 1982).
Гипонейральное нервное сплетение в составе мезотелия пищеварительной трубки было впервые описано Кавагути у Stichopus japonicus (Kawaguti, 1964; Feral, Massin, 1982). Основная масса тел мезотелиальных нервных клеток и их отростков сосредоточена в пространстве между перитонеальными клетками и мускулатурой пищеварительной трубки (Kawaguti, 1964; Garcia-Arraras et al., 1999). Перикарионы нейронов располагаются одиночно или небольшими группами, не образуя значительных скоплений (Garcia-Arraras et al., 1999). Считается, что характерное для других классов иглокожих эпинейральное нервное сплетение, ассоциированное с пищеварительным эпителием, у голотурий отсутствует (Feral, Massin, 1982). Однако, Гарсиа-Аррарас и др. (Garcia-Arraras et al., 1999) обнаружили в составе выстилки пищеварительной трубки голотурии Holohuria glaberrima пептидэргические элементы. Эти авторы также описывают холи-нергические и пептидергические нервные клетки и в составе соединительнотканного слоя.
Развитие с полным метаморфозом (непрямое развитие) характерно для голотурий семейств Holothuriidae, Stichopodidae и Sinaptidae, яйца которых имеют как правило относительно мелкие размеры и содержат небольшое количество желтка (Smiley et al., 1991). У таких голотурий еще на стадии бластулы или гаструлы зародыш покрывается жгутиками, выходит из оболочки и превращается в пелагическую личинку. Период ее плавания продолжается несколько недель; за это время проходит несколько личиночных форм: диплеврула, аурикулярия, долиолярия, и, наконец, пентактула - ювенильная стадия (Иванова-Казас, 1978). Вскоре после гастру-ляции, в составе архентерона выделяются первичный энтероцель (зачаток целоми-ческой мезодермы) и энтодермальный зачаток пищеварительного тракта. На брюшной стороне личинки появляется небольшое впячивание эктодермы - стомодеум, который соединяется с верхней частью зачатка кишки. Энтодермальный зачаток разделяется на пищевод, расширенный желудок и заднюю кишку. Анус, представляющий собой производное бластопора, сдвигается на вентральную сторону. Таким образом, на стадии ранней диплеврулы личиночный пищеварительный тракт уже полностью сформирован, и личинка начинает питаться (Иванова - Казас, 1978; Малахов, Черкасова, 1991; Smiley et al., 1991). В процессе метаморфоза (при превращении долиолярии в пентактулу) анус закрывается, задняя кишка подвергается гистолизу, а пищеварительный эпителий желудка претерпевает значительные морфологические изменения. Позднее дефинитивная кишка отрастает от задней части желудка, образуя при этом характерную петлю. Анус появляется заново на заднем конце тела (Smiley et al., 1986; Малахов, Черкасова, 1992).
Репаративная регенерация пищеварительной трубки
Нормальное функционирование пищеварительной трубки сопряжено с естественным изнашиванием, старением и гибелью специализированных клеток. Практически во всех отделах в выстилающем эпителии были обнаружены диффузно расположенные дегенерирующие клетки с ядрами в состоянии пикноза, лизиса, вакуолизации, с набуханием ядрышка и т.п. (Филимонова, 1979; Лейбсон, 1981а, 1989). Обновление клеточной популяции происходит в процессе физиологической регенерации, который был подробно изучен Н.Л. Лейбсон и ее сотрудниками (см. обзоры: Лейбсон, 1986, 1989). Ими было показано, что выстилка пищеварительного тракта голотурий и других иглокожих характеризуется отсутствием четко обособленных камбиальных зон, а делящиеся клетки диффузно рассеяны в эпителии кишки по всей ее длине и периметру и по всей высоте складок. Участки со сгущениями митозов и/или меченных 3Н-Т ядер носят, как правило, случайный характер, мало отличаются от соседних по своей морфологии и, вероятно, отражают локальные синхронизации в эпителии.
Лейбсон (1986) считает, что у голотурий физиологическая регенерация кишечного эпителия может осуществляться как за счет деления основных эпителио-цитов выстилки, совмещающих черты дифференцированных и камбиальных элементов, так и за счет наличия субпопуляции низкодифференцированных резервных клеток, причем допускается возможность того, что эти низкодифференцированные элементы входят в пищеварительный эпителий со стороны подлежащих тканевых слоев и мезентерия, то есть, восстановление кишечного эпителия частично происходит за счет клеток, возникающих во «внешнем камбии», находящемся за пределами самой выстилки.
Способность голотурий к быстрому (в течение нескольких недель) восста 17 новлению внутренних органов является одной из наиболее ярких особенностей биологии голотурий. Такая высокая регенераторная способность отчасти связана с явлением эвисцерации, которая характерна для представителей отрядов Aspidochirota и Dendrochirota. Виды отрядов Apoda, Molpadonia и Elasipoda не способны к эвисцерации, однако, после поперечного разрезания по крайней мере некоторые представители этих систематических групп способны к регенерации задних отделов кишки (см. обзоры: Долматов, 19966, 1999). В течение всего периода восстановления пищеварительного тракта голотурии, естественно, не могут питаться; показано, однако, что энергетические потребности животного в этом случае удовлетворяются за счет утилизации запасов гликогена стенки тела и гонады (Ламаш, 1991).
Большинство аспидохирот эвисцерирует через задний конец тела. При этом через разрыв в стенке клоаки выбрасывается большая часть пищеварительной трубки вместе со связанными с ней структурами (одним или обоими водными легкими, гемальными сосудами и частью гонадных трубочек). После выброса у голотурий сохраняются начальные отделы пищеварительной системы вплоть до пищевода, кишечный мезентерий, а также клоака и иногда одно водное легкое (Bertolini, 1930, 1932; Dawbin 1949; Bai, 1971; Leibson, 1992; Долматов, 19966). У некоторых аспидохирот, например Holothuria difficilis, Н. parvula и Н. surinamensis, эвисцерация происходит непосредственно через разрыв в стенке тела (КШе, 1937; Emson, Wilkie, 1980; Долматов, 19966).
Только у двух видов из отряда Dendrochirota наблюдается эвисцерация через задний конец тела (Emson, Wilkie, 1980), остальные же изученные дендрохироты эвисцерируют через передний конец. При этом происходит отделение утонченной передней части стенки тела (интроверта) и удаление аквафарингеального комплекса, всего пищеварительного тракта, за исключением клоаки, части половых трубочек и иногда одного водного легкого. После эвисцерации остается стенка тела, кишечный мезентерий, клоака, основание гонады с гонодуктом и одно или оба водных легких (КШе, 1935; Лейбсон, Долматов, 1989; Leibson, 1992; Долматов, 19966).
В процессе эвисцерации происходит быстрый разрыв тканей в строго опре 18 деленных местах. Большую роль при этом играют локальные изменения механических свойств соединительной ткани в месте разрыва. В частности, увеличение концентрации катионов К+, вероятно, может вызывать блокирование анионных сайтов в молекулах гликозаминогликанов. Это приводит к нарушению взаимодействия компонентов соединительнотканного матрикса, дезорганизации коллагеновых волокон и, в конечном итоге, - к быстрому снижению механической прочности ткани (Byrne, 1984, 1985а, 2001). Предполагается, что процесс эвисцерации находится под нервным и/или гуморальным контролем. В частности, из целомической жидкости эвисцирирующей голотурии Eupentacta quinquesemita выделен фактор эвисцерации, возможно, нейросекреторной природы (Byrne, 1986а). Кроме того, недавно были описаны несколько нейропептидов, регулирующих механические свойства соединительной ткани: голокинины (holokinin 1, holokinin 2), NGIWY - амид (NGIWYamide) и стихопин (stichopin) (Birenheide et al., 1998), причем стихопин оказывает свое воздействие путем ингибирования влияния ацетилхолина на соединительную ткань. В связи с этим, представляют интерес также данные о том, что антагонист ацетилхолина тубокурарин способен индуцировать эвисцерацию у Е. quinquesemita (Byrne, 1986а).
Функциональное и физиологическое значение эвисцерации еще не до конца понято. Предполагают, что она может быть связана с изгнанием эндопаразитов, отвлечением хищников, освобождением от накопленных в тканях конечных продуктов метаболизма, снижением метаболических затрат при переживании неблагоприятных условий (Byrne, 1985b; Долматов, 19966). У голотурии Е. quinquesemita эвисцерация в природных условиях носит сезонный характер (Byrne, 1985b, 1986b); причины и значение этого феномена также не ясны. 2.5.2. Регенерация у Aspidochirota 2.5.2.1. Макроанатомические особенности регенерации
Изученные виды аспидохирот могут быть разделены на две группы по способу регенерации пищеварительной трубки. У Stichopus regalis, S. mollis, Holothuria scabra и Actinopyga agassizi зачаток пищеварительной трубки появляется в виде непрерывного небольшого утолщения на протяжении всего свободного края мезентерия, от пищевода до клоаки (Bertolini, 1930; Dawbin, 1949; Mosher, 1956; Bai, 1971), а у H. tubulosa, Н. floridana, Н. impatiens, Н. glaberrima и Apostichopus japonicus происходит формирование двух зачатков (от пищевода и клоаки), которые растут навстречу друг другу вдоль свободного края мезентерия и впоследствии объединяются (Bertolini, 1932; Kille, 1936; Leibson, 1992; Garcia-Arraras et al., 1998). Для S. mollis, H. scabra и A. agassizi на ранних стадиях регенерации отмечено увеличение ширины мезентерия, наиболее выраженное в тех местах, где он образует углы и петли (Dawbin, 1949; Mosher, 1956; Bai, 1971). Свободный край мезентерия становится менее изогнутым, а его длина, соответственно, значительно уменьшается. Это позволяет осуществить процесс восстановления с минимальной затратой внутренних ресурсов, т.к. животное в этом случае начинает питаться намного раньше, чем если бы пищеварительная трубка восстанавливалась вдоль всей первоначальной длины мезентерия (Dawbin, 1949). После образования зачатка пищеварительной трубки, происходит дальнейшее увеличение в диаметре и рост в длину, появляются петли кишечника, характерные для интактных животных (Dawbin, 1949; Mosher, 1956; Bai, 1971). 2.5.2.2. Клеточные источники регенерации
Регенерация пищеварительной трубки у пентактул
После поперечного разрезания все задние половинки погибали в течение нескольких дней. Большинство передних половинок, напротив, выживали и успешно регенерировали утраченные части тела. Сразу после разрезания у передних половинок пентактул Е. fraudatrix задний конец остатка пищеварительного тракта выдается из раны и выворачивается выстилкой наружу (Рис. 15А). В течение последующих двух дней после операции в результате разрушения концевого отдела кишки рана закрывается соединительной тканью стенки тела. На поверхности раны восстанавливается покровный эпителий и кутикула. Остаток кишечной трубки, слепо замкнутый на заднем конце, целиком находится внутри тела животного (Рис. 15Б). Между концом кишки и стенкой тела располагается небольшое соединительнотканное утолщение, идущее по краю мезентерия, в котором обнаруживаются цело-моциты.
На 14 сутки регенерат кишечной трубки врастает в соединительную ткань задней стенки тела, оставаясь слепо замкнутым на диетальном конце. Навстречу кончику регенерата происходит впячивание покровного эпителия, соответствующее зачатку ректума.
На 20 сут после разрезания восстановление пищеварительной трубки, в основном, заканчивается. К этому времени задний кончик кишки дорастает до зачатка ректума и соединяется с ним (Рис. 15В).
Через 12 часов после операции в тканях задней части остатка пищеварительной трубки наблюдаются дегенеративные изменения. Наибольшей трансформации подвергаются везикулярные энтероциты: цитоплазма становится более электроно плотной, уменьшается количество и размер секреторных вакуолей, значительно увеличивается число аутофагосом (Рис. 16А, 17А). Последние часто содержат остатки шероховатого эндоплазматического ретикулума (ШЭР), миелиноподобные структуры и аморфный материал средней электронной плотности. Фагосомы могут сливаться друг с другом, формируя достаточно крупные образования. В цитоплазме гранулярных энтероцитов появляются фагосомы с гомогенным содержимым средней электронной плотности, а также концентрические скопления ШЭР. Кишечный эпителий передней части пищеварительной трубки, находящейся внутри животного, на данном этапе практически не меняется.
На 4-е сут после операции в выстилающем эпителии по всей длине кишки отмечаются дегенерирующие клетки, для которых характерна электроноплотная цитоплазма и еще более плотное пикнотизированное ядро. Цистерны ШЭР в таких клетках собраны в плотные концентрические скопления (Рис. 16Б, 17Б). В везикулярных энтероцитах обнаруживается большое число фагосом и миелиноподобных структур.
Одновременно в тканях пищеварительной трубки отмечаются первые признаки восстановления. В выстилающем эпителии кишечника появляются митотиче-ски делящиеся энтероциты (Рис. 16В, 17Б, В), а на границе между желудком и кишечником в митоз вступают Т-образные эпителиоциты (Рис. 16Г, 17В). Делящиеся клетки в эпителии распределены равномерно, не образуя видимых скоплений. Ми-тотические фигуры локализованы в основном в апикальной части эпителиального пласта. При делении клетки округляются, но при этом сохраняют контакты с соседними клетками и не полностью утрачивают признаки своей специализации: в цитоплазме везикулярных энтероцитов встречаются секреторные вакуоли, а в Т-образных клетках - мультивезикулярные тельца и микропузырьки. В обоих типах делящихся клеток обнаруживаются фагосомы.
Мезотелий на уровне желудка и границы между желудком и кишечником в этот период сохраняет черты нормальной организации: хорошо различаются мио-эпителиальные и перитонеальные клетки, встречаются тяжи нервных отростков (Рис. 17В). Тем не менее, некоторые клетки мезотелия этих отделов претерпевают процессы дедифференцировки, оставаясь, однако, в составе эпителия и сохраняя десмосомы. В цитоплазме дедифференцирующихся миоэпителиальных клеток происходит конденсация миофиламентов с образованием плотных веретеновидних структур (ВСМ) (Рис. 16Д, 17В), которые либо фагоцитируются в самих клетках, либо путем экзоциоза выбрасываются в перивисцеральный целом. Как в миоэпителиальных, так и в перитонеальных клетках обнаруживаются крупные фагосомы. Ближе к заднему концу регенерата кишечника дедифференцировка более выражена, мезотелий кончика регенерата состоит из одного слоя однотипных дедиффереици-рованных лишенных миофиламентов клеток (Рис. 16Е, 17Б). Эти клетки имеют различную форму и соединены между собой посредством десмосом. Большую часть объема этих клеток занимает округлое или эллипсоидное ядро, в цитоплазме содержатся митохондрии, небольшое число цистерн ШЭР, могут встречаться фагосомы. В таком дедифференцированном эпителия отсутствуют нервные отростки гипоневрального сплетения, характерные для мезотелия в норме.
В соединительнотканном слое стенки кишки, особенно кончика, встречаются фибробласты с расширенными цистернами ШЭР, заполненными материалом средней электронной плотности, часто от этих клеток отходит "шлейф" коллагеновых фибрилл. В цитоплазме фибробластов могут также обнаруживаться фагосомы, иногда в значительных количествах.
На 6-е сутки после операции везикулярные энтероциты задней части кишечника также характеризуются наличием в цитоплазме фагосом и крупных миелипо-подобных структур (часто по нескольку в одной клетке). В некоторых везикулярных энтероцитах аппарат Гольджи активирован и состоит из стопок расширенных цистерн, заполненных аморфным компонентом низкой электронной плотности (Рис. 18А). Содержимое цистерн аппарата Гольджи сходно с таковым секреторных гранул, расположенных рядом. В гранулярных энтероцитах встречаются плотные концентрические скопления ШЭР (Рис. 18Б).
На всем протяжении кишечника в выстилающем эпителии довольно обычны дегенерирующие клетки, а также обнаруживаются одиночные диффузно расположенные митотически делящиеся энтероциты. Т-образные эпителиоииты желудка имеют нормальное строение, иногда в их цитоплазме встречаются крупные фагосомы.
Регенерация пищеварительной трубки
Исходя из полученных данных, процесс регенерации кишки у 5-месячных пентактул голотурии Е. fraudatrix условно можно разделить на три основные стадии. Продолжительность первой стадии составляет около двух суток с момента разрезания. Эта стадия характеризуется тем, что рана остается открытой, а перерезанный конец кишки выдается из раны наружу. В кишечном эпителии, особенно в месте повреждения, происходят дегенеративные изменения, о чем свидетельствует большое количество аутофагосом и плотных концентрических скоплений ШЭР в энтероцитах. К концу первой стадии задняя часть кишки полностью дегенерирует, и стенка тела в месте разреза закрывается. В свободном крае мезентерия между кончиком остатка пищеварительной трубки и задней стенкой тела формируется соединительнотканное утолщение.
Вторая стадия (2-20 сут) характеризуется активными морфогенетическими процессами. Остаток кишечной трубки в это время слепо замкнут и целиком находится внутри тела животного. Между ним и задним концом животного по краю мезентерия формируется соединительнотканный тяж. В выстилающем эпителии и мезотелии появляются митозы. Митотически делящиеся клетки располагаются диффузно по длине кишки, никаких скоплений или бластемы нами обнаружено не было. Делящиеся клетки в выстилающем эпителии дедифференцированы лишь частично: на протяжении всего митотического цикла в цитоплазме сохраняются специфические органоиды, например, секреторные вакуоли. Делящиеся энтероци-ты и Т-образные клетки связаны с соседними клетками десмосомами, то есть остаются в составе эпителия. За счет пролиферации пищеварительный эпителий кишки постепенно врастает в соединительнотканное утолщение края мезентерия, и таким образом формирует выстилку задних отделов пищеварительного тракта.
В отличие от кишечного эпителия, мезотелиальные клетки в процессе регенерации дедифференцируются полностью, что выражается в изменении формы клеток и разрушении сократительного аппарата миоэпителиальных клеток. Дедиф-ференцировка начинается на заднем конце кишки, вблизи от места повреждения, и постепенно распространяется вперед, к желудку. Дедифференцированные клетки приобретают способность к митотическому делению и, вероятно, к миграции, оставаясь, однако связанными между собой посредством межклеточных контактов. Впоследствии в мезотелии начинается редифференцировка: в базальной части миоэпителиальных клеток появляются пучки миофиламентов, а в толще мезотелия обнаруживаются тяжи нейритов.
На протяжении всей второй стадии продолжаются процессы дегенерации. На это указывает наличие клеток с пикнотизированным ядром, электроноплотной цитоплазмой и концентрическими скоплениями ШЭР. Диффузное распределение как дегенерирующих, так и делящихся клеток по всей длине кишки означает, что в процессы перестройки вовлечена вся пищеварительная система.
На третьей стадии (20-31 сут) анатомическая целостность пищеварительного тракта полностью восстановлена: кишечник переходит в ректум, который открывается наружу анальным отверстием. В задней части кишки происходит дифферен-цировка тех отделов, которые были утрачены при повреждении, а к 31-м сут после нанесения повреждения этот процесс практически завершается.
Полученные нами результаты показывают, что регенерация пищеваритель 79 ной системы у взрослых особей голотурии Е. fraudatrix осуществляется в несколько стадий. На первой стадии (5-7 сут) происходит формирование соединительнотканного зачатка в свободном крае дорзального мезентерия на переднем конце тела животного. Целомический эпителий, покрывающий вентральную поверхность зачатка дедифференцируется и погружается в соединительную ткань. На второй стадии (10 сут после эвисцерации) передний зачаток приобретает трубчатую форму: в нем формируется центральная полость, выстланная эпителием, клетки которого начинают дифференцироваться в энтероциты. Появляется задний зачаток пищеварительной трубки, растущий вперед от клоаки по свободному краю вентрального мезентерия. Выстилка клоаки за счет пролиферации клеток, врастает в соединительнотканное утолщение вентрального мезентерия и дает начало пищеварительному эпителию заднего зачатка. Этот эпителий образован уплощенными везикулярными энтероцитами, характерными для клоаки в норме. На протяжении третьей стадии, в течение 10-27 сут после эвисцерации, зачатки растут навстречу друг другу, продолжается дифференцировка клеток пищеварительного эпителия. Четвертая стадия (27 сут после эвисцерации) характеризуется тем, что оба зачатка объединяются, образуя непрерывную пищеварительную трубку. Гистологическое строение пищеварительного эпителия неотличимо от такового у интактных животных. В дальнейшем кишечник постепенно удлиняется и утолщается, образуя характерные петли.
Основными тканевыми системами кишечника голотурий являются два эпителия - кишечный и целомический. Соответственно, одной из целей исследований регенерации пищеварительной системы является выяснение клеточных источников происхождения этих тканей.
Как у ювенильных, так и у взрослых особей голотурии Е. fraudatrix мезоте-лий регенерирует за счет собственных клеток. Формирование целомического эпителия восстанавливающегося органа за счет собственного клеточного материала является, по-видимому, общим правилом для всех изученных голотурий (Dolmatov, 1992; Garsia-Arraras et al., 1998; VandenSpiegel et al., 2000; Шукалюк, Долматов, 2001; Garsia-Arraras, Greenberg, 2001; данное исследование). Строение целомиче 80 ского эпителия у иглокожих достаточно разнообразно и варьирует в зависимости от органа, который он покрывает. Тем не менее, основными компонентами его являются два клеточных типа - перитонеоциты и миоэпителиальные клетки (Byrne, 1994; Chia, Koss, 1994; Smiley, 1994). На ранних стадиях регенерации оба этих клеточных типа дедифференцируются. В ходе дедифференцировки сократительный аппарат миоэпителиальных клеток разрушается, а составлявшие его миофиламенты группируются в плотные веретеновидные структуры (ВСМ) (Dolmatov, 1992; Dol-matov et al., 1996). Они достаточно долго могут сохраняться в цитоплазме, в связи с чем являются хорошими естественными маркерами дедифференцированных миоэпителиальных клеток. Наличие ВСМ в митотически делящихся клетках указывает на то, что миоэпителиальные клетки после дедифференцировки способны к делению (Dolmatov, Ginanova, 2001; данная работа). Дедифференцировка перитонеальных клеток сопровождается изменением формы клетки и фрагментацией пучков внутриклеточных филаментов (у взрослых животных). Клетки дедифферицированного целомического эпителия приобретают способность к миграции в область повреждения, причем клетки перемещаются не поодиночке, а единым эпителиальным пластом, сохраняя межклеточные контакты.
Наиболее спорным вопросом регенерации голотурий является происхождение кишечной выстилки. Подробный анализ гипотез происхождения пищеварительного эпителия голотурий был дан в обзоре Гарсиа-Аррараса и Гринберга (Garcia-Arraras, Greenberg, 2001). У голотурий, относящихся к отряду Apoda и у ряда изученных представителей отряда Aspidochirota пищеварительный эпителий регенерата происходит за счет клеток энтодермальной выстилки остатка пищеварительной трубки (Bertolini, 1932; Smith, 1971а, b; Gibson, Burke, 1983; Garcia-Arraras et al., 1998; Шукалюк, Долматов, 2001). Основными механизмами, обеспечивающими восстановление кишки, являются либо морфаллактическая перестройка остатка органа (у Apoda), либо дедифференцировка и пролиферация клеток кишечного эпителия, что и обеспечивает врастание последнего в соединительнотканное утолщение края мезентерия (у Aspidochirota). У ювенилов голотурии Е. fraudatrix кишечному эпителию регенерирующих отделов пищеварительной трубки дает начало выстилка остатка кишки, то есть вновь образованный пищеварительный эпи 81 телий остается энтодермальным по своему происхождению.
В случае взрослых голотурий отряда Dendrochirota проблема осложняется тем, что при аутотомии, в связи с передним способом эвисцерации, удаляются почти все энтодермальные ткани. Только в заднем конце животного сохраняется клоакальный отдел кишки энтодермального происхождения. Следовательно, формирование кишечного эпителия в переднем зачатке теоретически может происходить только за счет эктодермальных и/или мезодермальных клеток. Согласно нашим данным, эктодерма не принимает участия в восстановлении кишки. С помощью анализа серийных срезов было установлено, что микрополости, которые появляются в переднем зачатке на ранних этапах регенерации взрослых голотурий Е. frau-datrix, образуют во внеклеточном матриксе соединительнотканного утолщения единую незамкнутую разветвленную полость, сообщающуюся с перивисцеральным целомом, а выстилка этой полости образована погрузившемся в соединительную ткань целомическим эпителием. Строение клеток выстилки микрополостей сходно со строением дедифференцированного целомического эпителия на поверхности зачатка. Дополнительным доказательством мезодермальной природы клеток, ограничивающих микрополости, является наличие в их цитоплазме ВСМ. Погружение целомического эпителия начинается сразу за зачатком аквафарингеального комплекса, в месте развития амбулакрального кольца. В дальнейшем в результате миграции и пролиферации погрузившихся клеток полость распространяется вперед и назад в соединительной ткани зачатка, формируя выстилку кишки. Связь с поверхностным целомическим эпителием утрачивается, и клетки, оказавшиеся внутри зачатка, дифференцируются в клеточные типы, характерные для пищеварительного эпителия.
