Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о роли иммунной системы в регуляции регенераторных процессов 14
1.1. Современные представления о регенерации тканей 14
1.2. Механизмы регуляции восстановительных процессов 18
1.3. Иммунная регуляция регенерации 20
1.3.1. Элементы иммунной системы, осуществляющие регуляцию восстановительных процессов 21
1.3.2. Роль лимфоцитов в регуляции регенерации медленно и интенсивно обновляющихся тканей 24
1.3.3. Участие макрофагов в регуляции регенерации медленно и интенсивно обновляющихся тканей 30
1.4. Перспективы использования иммунокорректоров для изучения морфогенетической функции иммунной системы 32
Глава 2. Методические вопросы исследования 39
2.1. Характеристика лабораторных животных 39
2.2. Исследование регенераторных процессов в печени 40
2.2.1. Методика резекции печени 40
2.2.2. Оценка состояния регенерата печени 41
2.3. Исследование регенераторных процессов в кроветворной ткани 42
2.3.1. Исследование показателей периферической крови 43
2.3.2. Исследование клеток костного мозга 44
2.4. Изучение состояния иммунной системы при регенерации 45
2.4.1. Исследование тимуса и селезенки 45
2.4.2. Исследование морфогенетической функции лимфоидных клеток 45
2.5. Методы изменения функционального состояния различных клеток иммунной системы 46
2.6. Статистические методы, использованные для обработки экспериментального материала 48
Глава 3. Влияние иммунокорректоров на регенерацию печени после частичной гепатэктомии 49
3.1. Регенерация печени и реакция лимфоидных органов крыс на частичную гепатэктомию 49
3.1.1. Регенерация печени крыс 49
3.1.2. Реакция лимфоидных органов крыс на частичную гепатэктомию 52
3.2. Влияние полиоксидония на регенерацию печени крыс 53
3.2.1. Регенерация печени крыс после частичной гепатэктомии при введении полиоксидония 53
3.2.2. Реакция лимфоидных органов крыс на частичную гепатэктомию при введении полиоксидония 56
3.3. Влияние тималина на регенерацию печени крыс 57
3.3.1. Регенерация печени крыс после частичной гепатэктомии при введении тималина 57
3.3.2. Реакция лимфоидных органов крыс на частичную гепатэктомию при введении тималина 60
3.4. Влияние тамерита на регенерацию печени крыс 61
3.4.1. Регенерация печени крыс после частичной гепатэктомии при введении тамерита 61
3.4.2. Реакция лимфоидных органов крыс на частичную гепатэктомию при введении тамерита 64
3.5. Сравнительная оценка влияний иммунокорректоров на регенерацию печени крыс 64
Глава 4. Роль иммунной системы в регуляции регенерации печени 77
4.1. Влияние лимфоидных клеток на регенерацию печени интактных реципиентов 77
4.1.1. Влияние спленоцитов на регенерацию печени интактных реципиентов 77
4.1.2. Влияние тимоцитов на регенерацию печени интактных реципиентов 80
4.2. Влияние лимфоидных клеток животных, получавших полиоксидоний, на регенерацию печени интактных реципиентов 82
4.2.1. Влияние спленоцитов животных, получавших полиоксидоний, на регенерацию печени интактных реципиентов 82
4.2.2. Влияние тимоцитов животных, получавших полиоксидоний, на регенерацию печени интактных реципиентов 84
4.3. Влияние лимфоидных клеток животных, получавших тималин, на регенерацию печени интактных реципиентов 87
4.3.1. Влияние спленоцитов животных, получавших тималин, на регенерацию печени интактных реципиентов 87
4.3.2. Влияние тимоцитов животных, получавших тималин, на регенерацию печени интактных реципиентов 89
4.4. Влияние лимфоидных клеток животных, получавших тамерит, на регенерацию печени интактных реципиентов 91
4.4.1. Влияние спленоцитов животных, получавших тамерит, на регенерацию печени интактных реципиентов 92
4.4.2. Влияние тимоцитов животных, получавших тамерит, на регенерацию печени интактных реципиентов 94
4.5. Заключение 96
Глава 5. Влияние иммунокорректоров на регенерацию крови после острой массивной кровопотери 106
5.1. Характеристика системы крови крыс после кровопотери 106
5.2. Некоторые параметры морфофункционального состояния селезенки и тимуса после кровопотери 110
5.3. Влияние полиоксидония на кроветворение крыс после кровопотери 111
5.4. Некоторые параметры морфофункционального состояния селезенки и тимуса после кровопотери при введении полиоксидония 115
5.5. Влияние тималина на кроветворение крыс после кровопотери 115
5.6. Некоторые параметры морфофункционального состояния селезенки и тимуса после кровопотери при введении тималина 119
5.7. Влияние тамерита на кроветворение крыс после кровопотери 119
5.8. Некоторые параметры морфофункционального состояния селезенки и тимуса после кровопотери при введении тамерита 123
5.9. Сравнительная оценка влияний иммунокорректоров на систему крови после острой массивной кровопотери 123
Глава 6. Роль иммунной системы в регуляции кроветворения 128
6.1. Влияние лимфоидных клеток на регенерацию крови интактных реципиентов 128
6.1.1. Влияние спленоцитов на регенерацию крови интактных реципиентов 128
6.1.2. Влияние тимоцитов на регенерацию крови интактных реципиентов 131
6.2. Влияние лимфоидных клеток животных, получавших полиоксидоний, на регенерацию крови интактных реципиентов 134
6.2.1. Влияние спленоцитов животных, получавших полиоксидоний, на регенерацию крови интактных реципиентов 134
6.2.2. Влияние тимоцитов животных, получавших полиоксидоний, на регенерацию крови интактных реципиентов 137
6.3. Влияние лимфоидных клеток животных, получавших тималин, на регенерацию крови интактных реципиентов 140
6.3.1. Влияние спленоцитов животных, получавших тималин, на регенерацию крови интактных реципиентов 140
6.3.2. Влияние тимоцитов животных, получавших тималин, на регенерацию крови интактных реципиентов 143
6.4. Влияние лимфоидных клеток животных, получавших тамерит, на регенерацию крови интактных реципиентов 146
6.4.1. Влияние спленоцитов животных, получавших тамерит, на регенерацию крови интактных реципиентов 146
6.4.2. Влияние тимоцитов животных, получавших тамерит, на регенерацию крови интактных реципиентов 149
6.5. Заключение 152
Заключение 158
Выводы 163
Литература 165
- Элементы иммунной системы, осуществляющие регуляцию восстановительных процессов
- Методы изменения функционального состояния различных клеток иммунной системы
- Регенерация печени крыс после частичной гепатэктомии при введении полиоксидония
- Влияние тимоцитов животных, получавших полиоксидоний, на регенерацию печени интактных реципиентов
Введение к работе
Актуальность исследования. Проблема регенерации тканей является одним из ключевых вопросов биологии. Этот процесс обеспечивает тканевой гомеостаз в физиологических условиях и восстановление утраченных структур, нарушенных функций при повреждении. Чрезвычайно важна эта проблема и для медицины, поскольку большинство заболеваний в той или иной степени связаны с повреждением органов, а эффективность проводимой терапии определяется течением репаративных процессов. Вместе с тем многие механизмы регенераторного процесса и особенно его регуляция остаются недостаточно изученными.
Исследователи уже давно обратили внимание на способность иммунной системы влиять на репаративные процессы. Однако первоначально этот эффект связывали с повреждающим действием гуморальных антител на стареющие и измененные клетки. Это послужило основой использования цитотоксических сывороток в эксперименте и клинике для целенаправленного воздействия на регенерацию органов и тканей [128].
Качественно новое развитие теория иммунологической регуляции восстановительных процессов получает в 60-е годы, когда было доказано, что наряду с цензорной функцией иммунная система обладает и морфогенетической [10,11,165]. В последние годы это направление приобретает все большее признание и распространение [13,45,51,140,141,153,188]. Наиболее детально изучена морфогенетическая функция лимфоцитов. Известно, что уже интактные клетки обладают морфогенетической активностью. Так, у животных с подавленной облучением физиологической регенерацией введенные извне лимфоциты интактных животных оказывают нормализующее этот процесс действие.
Однако эффект выражен больше у лимфоцитов животных с повреждением какого-либо органа. Малые лимфоциты оперированных
животных в условиях адоптивного переноса побуждают нелимфоидные клетки неоперированного реципиента к делению, причем преимущественно в том органе, который поврежден у оперированного донора. Исследование этого явления, названного феноменом передачи «регенерационной информации», было начато работами А.Г. Бабаевой [10,11].
В активирующем регенерацию эффекте иммунной системы существенная роль отводится Т-супрессорам. По мнению А.Г. Бабаевой (1985) при удалении ткани органа (любой вариант оперативного вмешательства) имеет место снижение функции или числа Т-супрессоров, на фоне которого происходит стимуляция других популяций лимфоцитов, размножение лимфоидных клеток в селезенке и лимфатических узлах, которое обеспечивает усиление пролиферативных процессов не только клеток лимфоидного ряда, но и других тканевых систем. Имеющиеся данные указывают на то, что реализация морфогенетической функции лимфоцитами происходит аналогично реализации их иммунологической активности за счет клеточных контактов [7,24,25] и продукции лимфокинов [104].
Имеются отдельные указания, что в регуляции регенераторного процесса принимают участие не только лимфоциты, но и другие элементы иммунной системы. На модели частичной гепатэктомии удалось показать, что уже в пререпликативном периоде регенерации печени происходит резкое повышение активности лизосомных гидролаз во фракции купферовских макрофагов. При стимуляции клеток Купфера ход регенерации гепатоцитов ускоряется, а при торможении их поглотительной способности до частичной резекции печени или в первые часы после нее замедляется. Предполагается, что вскоре после частичной гепатэктомии купферовские клетки начинают выделять в микросреду факторы, стимулирующие пролиферацию гепатоцитов [88].
На участие нейтрофилов в регуляции регенераторного процесса указывают И.И. Долгушин и О.В. Бухарин [51], которые на модели адоптивного переноса показали, что перитонеальные нейтрофилы интактных мышей F| (CBAxC57BL) при трансплантации сингенным животным со стандартной
ожоговой травмой (25-30 % поверхности тела) заметно ускоряет эпителизацию раны. Этот стимулирующий эффект авторы связывают с секретируемыми нейтрофилами низкомолекулярными пептидами.
Таким образом, в настоящее время показано, что разные элементы иммунной системы принимают участие в регуляции регенераторного процесса. Несмотря на все выше приведенные данные, доказанным является лишь существование данного феномена, а многие проблемы морфогенетической функции иммунной системы, еще далеки от своего решения. Это касается, прежде всего, роли функционального состояния иммунной системы в регуляции регенерации. Требуют своей расшифровки механизмы, регулирующие морфогенетическую функцию иммунокомпетентных клеток. Совершенно не изучена проблема участия антигенпрезентирующих клеток в морфогенетической функции.
В различных органах и тканях имеются свои особенности протекания регенераторного процесса. Выделяют медленно и интенсивно обновляющиеся; ткани, в которых выражены клеточные и внутриклеточные механизмы, либо преобладает один из них. На сегодняшний день остается не исследованным вопрос о связи типа регенерации ткани с морфогенетической функцией иммунной системы.
Остается совершенно нерешенным вопрос о взаимоотношении морфогенетической и защитной функциями иммунной системы, что особенно важно для клинической медицины. Неизвестно почему и как лимфоциты приобретают свойства стимулировать регенерацию именно в поврежденном органе, когда практически отсутствуют изменения антигенных свойств, но реакция лимфоидных клеток не только не предотвращается, а наоборот, становится более выраженной [11].
Расшифровка механизмов морфогенетической функции иммунной системы создает теоретическую основу для разработки целенаправленного на нее воздействия. В этом направлении имеются лишь единичные исследования. В частности, Черешнева М.В. и соавторы показали, что включение в
стандартную схему терапии синтетического иммуномодулятора полиоксидония приводит к более упорядоченному компактному бессосудистому строению рубцовой ткани глаза при незначительной выраженности реактивных изменений, т.е. оптимизирует регенераторный процесс [141]. Эффективны иммунокорректоры и для стимуляции регенерации кости [96]. Однако все известные на сегодняшний день иммунокорректоры изучены с точки зрения их влияния на показатели иммунного статуса. Данных, касающихся влияния их на морфогенетическую функцию, нами не найдено. В то же время, использование этих препаратов может помочь решить ряд из поставленных выше вопросов, позволит отобрать наиболее эффективные в терапевтическом плане препараты и предложить принципиально новые пути для стимуляции восстановительных процессов.
Все вышеизложенное свидетельствует о том, что определение механизмов иммунной регуляции регенерации тканей является актуальной научной проблемой и требует целенаправленных специальных исследований.
Цель исследования: изучить роль функционального состояния иммунной системы и ее отдельных звеньев в регуляции регенерации тканей с разной восстановительной способностью.
Задачи исследования:
Изучить особенности иммунологической регуляции репаративной регенерации тканей с разным характером и темпом физиологической регенерации: медленно - (печень) и интенсивно - обновляющиеся (кроветворная ткань).
Исследовать влияние иммунной системы на ход регенераторного процесса после ее индукции повреждением.
Определить значение активности иммунной системы в регуляции регенерации печени и кроветворной ткани с помощью активации ее полиоксидонием.
Установить эффект стимуляции функции иммунной защиты Т-лимфоцитов с помощью тималина на их морфогенетическую функцию.
Оценить вклад антигенпрезентирующих клеток (макрофагов) в реализацию морфогенетической функции иммунной системы с помощью активации их тамеритом.
Оценить возможность использования иммунокорректоров для целенаправленного влияния на регенерацию органов и тканей в эксперименте и клинической практике.
Научная новизна исследования:
Впервые проведено исследование морфогенетической функции лимфоцитов при изменении функционального состояния иммунной системы под влиянием иммунокорректоров и доказано, что проявление морфогенетических свойств лимфоцитов зависит от времени после повреждения и не зависит от типа повреждаемой ткани и скорости репаративных процессов в ней.
Показано, что клетки иммунной системы способны не только передавать регенераторный стимул но, и регулируют течение восстановительного процесса.
Впервые продемонстрировано, что стимуляция защитной функции Т-лимфоцитов тималином приводит к уменьшению их способности стимулировать клеточный тип регенерации.
Показано, что на морфогенетическую функцию тимоцитов и спленоцитов существенное влияние оказывают антигенпрезентирующие клетки — макрофаги и предложена гипотеза о существовании 2-х механизмов в формировании морфогенетических свойств лимфоцитов: макрофагзависимого и макрофагнезависимого.
Обнаружено, что внутриклеточные процессы регенерации контролируются Т-лимфоцитами, а для запуска клеточных механизмов необходимым компонентом является макрофаг, что обосновывает возможность
целенаправленного воздействия на регенераторный процесс с помощью иммунокорректоров.
Теоретическая значимость работы. Результаты исследования объясняют механизмы влияния клеток иммунной системы: лимфоцитов и макрофагов на процессы восстановления поврежденных органов и тканей и расширяют современные представления об их участии в регуляции регенерации. Полученные данные доказывают, что для проявления морфогенетической функции иммунной системы важным является ее функциональное состояние в целом, Т-клеточного и макрофагального звеньев. Выявлены различия в иммунологической регуляции внутриклеточной и клеточной регенерации. Проведенное исследование создает теоретическую основу для разработки новых методов влияния на регенерацию путем воздействия на иммунную систему.
Практическая значимость работы. Разработана модель для изучения иммунологической регуляции регенерации с помощью иммунокорректоров. Экспериментально обоснована возможность применения полиоксидония, тималина, тамерита в клинической практике для ускорения восстановительных процессов в поврежденных органах и тканях.
Положения, выносимые на защиту.
Состояние иммунной системы в целом и ее Т-клеточного и макрофагального звеньев оказывает существенное влияние на репаративную регенерацию тканей независимо от их типа и темпа физиологической регенерации.
Между механизмами иммунной защиты и морфогенетической функцией лимфоидных клеток существуют реципрокные взаимоотношения.
Активация лимфоцитами клеточных механизмов регенерации зависит от макрофагов, а внутриклеточная является макрофагнезависимой.
Иммунная система принимает участие не только в индукции пролиферации поврежденной ткани, как это полагалось ранее, но участвует и в регуляции последующих этапов регенерации.
Иммунокорректоры являются эффективным средством модуляции восстановительных процессов поврежденных тканей.
Апробация работы. Работа апробирована на заседании XI международного симпозиума «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2003), 4-ой Международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование в XXI веке» (Москва, 2003), 7-ом Всероссийском научном Форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), Ш-ей конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2003), 3-ем съезде иммунологов России (Екатеринбург, 2004), 2-ой Всероссийской научно-практической конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), третьем Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004). По материалам исследования опубликовано 11 научных работ.
Внедрение. Результаты диссертационной работы используются в учебном
процессе на кафедре физиологии человека и животных Уральского
государственного университета имени A.M. Горького, кафедре физиологии и
безопасности жизнедеятельности Российского государственного
профессионально-педагогического университета, кафедрах патологической физиологии, иммунологии и аллергологии Челябинской государственной медицинской академии, в научных разработках Института иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук.
Элементы иммунной системы, осуществляющие регуляцию восстановительных процессов
Основная часть иммунной системы представлена популяциями высокоспециализированных подвижных клеток. Клеточные элементы иммунной системы организованы в тканевые или органные структуры, либо рециркулируют в крови и лимфе [38]. В процесс реализации регуляторных влияний активно вовлекаются циркулирующие лейкоциты, а также клетки, фиксированные в тканях, в частности моноциты или макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, тучные клетки, а также тромбоциты и лимфоциты [183].
Кооперирование и координация между клетками обеспечиваются, с одной стороны, выделяемыми ими физиологически активными веществами -медиаторами, а с другой - разнообразием лимфокинов и монокинов, освобождаемых на различных стадиях активации иммунной системы, влияющих на каждый тип клеток, изменяющих у последних пролиферацию, миграцию и свойства клеточной поверхности, а также секрецию медиаторов [140]
Основным клеточным компонентом всех лимфоидных органов является лимфоцит. Различают три класса лимфоцитов: В - лимфоцит -предшественники антителообразующих клеток (плазматических), Т -лимфоциты, натуральные киллеры. Имеются литературные данные, что в реализации морфогенетической функции принимают участие Т-лимфоциты за счет клеточных контактов или продукции лимфокинов [57,63,134,159].
Важнейшую группу клеток иммунной системы составляют антигенпредставляющие клетки, назначение которых состоит в обработке антигена и представлении его Т-хелперам. Эту группу образуют макрофаги и дендритные клетки. Указанную функцию выполняют также В - лимфоциты. Вероятно, эти клетки выполняют ту же функцию, что и рецепторы в нервной системе, т.е. преобразуют сигнал для передачи в другие отделы системы. Вместе с тем они помимо рецепторной могут выполнять и другие функции [149]. Так, моноциты-макрофаги вырабатывают широкий спектр физиологически активных факторов, многие из которых рассматриваются как регуляторы функций и процессов, не связанных с иммунной защитой. В числе таких регуляторов: интерлейкины 1а, 1р, интерфероны а и у, макрофагальный ростковый фактор, колониестимулирующий фактор гранулоцитов и моноцитов и другие (всего около 120) [86,129]. Уже один этот далеко не полный перечень позволяет признать макрофаги полифункциональными клетками, способными изменять многие функции в организме.
Нейтрофилы также способны воздействовать на различные системы организма. Так, в них имеются ферментные системы, производящие мощные вазоактивные пептиды. Например, в нейтрофилах животных обнаружены сериновая протеиназа, превращающая ангиотензиноген плазмы в ангиотензин II [189]. Последний сужает кровеносные сосуды, повышает кровяное давление и регулирует образование альдостерона. Нейтральные и кислые протеазы нейтрофилов принимают участие в образовании кинина, а кинины влияют на сократимость и проницаемость мелких кровеносных сосудов [140].
На участие нейтрофилов в регуляции регенераторного процесса указывают И.И. Долгушин и О.В. Бухарин [51], которые на модели адоптивного переноса показали, что перитонеальные нейтрофилы интактных мышей F (CBAxC57BL) при трансплантации сингенным животным со стандартной ожоговой травмой (25-30% поверхности тела) заметно ускоряет эпителизацию раны. Этот стимулирующий эффект авторы связывают с секретируемыми нейтрофилами низкомолекулярными пептидами. Они обнаружили ускорения отторжения ожогового струпа и эпителизации раны под влиянием как супернатанта активированных нейтрофилов, так и при введении животным выделенных из него фракций, обозначенных как А1, А5 и HI. Самой активной оказалась А1-фракция. Гранулы базофилов и тучных клеток содержат гистамин, гепарин, АТФ, протеолитические ферменты, трипсиноподобную эстеразу, пероксидазу, ферменты, переводящие кининоген в кинин. Уже сам перечень физиологически активных веществ указывает на их возможность влиять на тонус сосудов и их проницаемость, на нервную и эндокринную системы, пролиферативные процессы в тканях [140].
Имеется определенное количество аргументов в пользу регуляторного влияния эозинофилов. Предполагается, что они служат отрицательными модуляторами воспаления и содержат гистаминазу, киназу, лизофосфолипазу, арилсульфатазу В, фосфолипазу D. Большинство этих ферментов высвобождается или появляется на клеточной поверхности лишь при активации клеток. Следует обратить внимание на то, что перечисленные и другие ферменты эозинофилов могут нейтрализовать продукты тучных клеток или служить «мусорщиками», способствующими уничтожению клеточных остатков. Одной из возможных функций эозинофилов, опосредованных простагландином Еі, является прямое подавление высвобождения гистамина [210].
Также установлено, что при повреждении кожи хомячка область раны подвергается выраженной эозинофильной инфильтрации. Эозинофилы выделяют трансформирующие ростковые факторы а и Pi [216]. Введение таким животным анти-интерлейкин-5-моноклональных антител, снижающих миграцию эозинофилов в рану, приводит к значительному ускорению ее закрытия путем эпителизации. Это позволило предположить тормозящий эффект данных клеток на регенерацию кожи [217]. Эозинофильная инфильтрация кожной раны, а также наличие в этих клетках трансформирующего росткового фактора а и его м-РНК обнаружены и у кролика [213]. Кроме того, эозинофилы выделяют ростковый фактор гепатоцитов, влияющий на регенерацию альвеолярного эпителия II типа и других эпителиальных клеток, продукция которого инициируется интерлейкином 5 [211]. Тромбоциты еще совсем недавно формально не включали в иммунную систему, но исследования последних лет позволили рассматривать тромбоциты в качестве эффекторов иммунной системы. Потенциальные мишени тромбоцитов - молодые особи трематод, а также T.gongii и T.cruzi. Тромбоциты, подобно макрофагам и другим эффекторным клеткам, обладают поверхностными Fee-рецепторами, с участием которых осуществляется их антителозависимое цитотоксическое действие, ассоциированное с IgE [106]. Активированные тромбоциты секретируют факторы роста и свертывания, вазоактивные амины и липиды, нейтральные и кислые гидролазы. Каждое из этих веществ играет определенную роль в регуляции функций.
Методы изменения функционального состояния различных клеток иммунной системы
Морфогенетическую функцию изучали в модели адоптивного переноса по выраженности регенераторных процессов в органах, одноименных поврежденному в организме донора. Лимфоидные клетки (спленоциты или тимоциты) для трансплантации реципиентам получали от доноров через 4 или 17 часов (донорский интервал) после частичной гепатэктомии или после массивной кровопотери. Указанные донорские интервалы были выбраны в связи с тем, что на данные сроки лимфоидные клетки донора обладали наибольшими стимулирующими свойствами [11]. Из лимфоидных клеток донора готовили суспензию по методу Н.А. Краскиной [72], для чего ткань селезенки массой 150-300 мг. или весь тимус смешивали с 5 мл среды 199 на холоде. Ткани измельчали ножницами и пропускали через инъекционные иглы уменьшающегося диаметра. Производили подсчет ядер клеток в камере Горяева с использованием лейкоцитарного меланжера. Число жизнеспособных клеток определяли с помощью окраски клеток 0,1% раствором трипанового синего. Конечную концентрацию клеток в суспензии доводили до 60-80 106 в 1 мл.. Указанное количество спленоцитов или тимоцитов вводили реципиентам внутривенно (в хвостовую вену). Опыты были поставлены с введением цельной взвеси клеток селезенки, так как в специальном исследовании было показано, что ее активность зависит от фракции малых лимфоцитов [11].
Состояние регенераторных процессов в печени или костном мозге реципиентов оценивали через 48 часов после трансплантации лимфоидных клеток (спленоцитов или тимоцитов). С целью изменения функционального состояния иммунной системы в эксперименте были использованы фармакологические препараты, занесенные в Регистр лекарственных средств России и относящиеся к группе иммуномодуляторов фарм. группа 6.5. [105]. Все препараты вводились донорам однократно за час до воздействия с целью целенаправленно подействовать на определенное звено иммунной системы. Именно последнее было определяющим в выборе препаратов. 1. Полиоксидоний. Вводили внутримышечно в дозе 0,1мг/кг [141]. Этот препарат стимулирует активность подвижных тканевых и циркулирующих в крови макрофагов, оседлых фагоцитов ретикулоэндотелиальной системы, обладает неспецифическим защитным действием от широкого спектра патогенов, стимулирует элиминацию чужеродных микрочастиц из крови. Полиоксидоний усиливает кооперацию Т- и В-лимфоцитов, восстанавливает количество общих Т-клеток, не изменяет содержание В-клеток, при совместном введении с антигеном повышает специфический антителогенез [150]. 2. Тималин. Вводили внутримышечно в дозе 0,1 мг/кг. Этот препарат вызывает повышение сниженных показателей Т-системы иммунитета, нормализацию соотношения Т-хелперов, Т-супрессоров и В-лимфоцитов, увеличение катионных белков в нейтрофильных лейкоцитах. Тималин, взаимодействуя с мембраной Т-лимфоцитов, активизирует экспрессию специфических рецепторов. Снижает повышенное при иммунодефицитах содержание глюкозы, холестерина, азота, мочевины, способствует восстановлению нормальной циклазной системы и спектра изоферментов ЛДГ, улучшению процессов созревания Т-лимфоцитов, появлению их зрелых форм. При нарушениях иммунной системы, характеризующихся повышением ряда показателей иммунитета, тималин уменьшает исходно повышенные сдвиги в Т-клеточном звене иммунной системы. Нормализует нарушения фагоцитоза. Улучшает течение процессов клеточного метаболизма [150]. 3. Тамерит. Вводили внутримышечно в дозе 2 мг/кг. Этот препарат обладает противовоспалительным, иммуномодулирующим и антиоксидантным действием. Его основные фармакологические эффекты обусловлены способностью воздействовать на функционально-метаболическую активность макрофагов, а также нейтрофильных гранулоцитов. Иммуномодулирующие свойства проявляются в восстановлении нормальной антигенпрезентирующей и секреторной функций клеток моноцитарно-макрофагального звена, стимуляции микробицидной системы нейтрофильных гранулоцитов и 48 антитоксической активности естественных киллеров, а также иммунокорригирующим действием в отношении клеточного и гуморального иммунитета. Препарат стимулирует репарацию тканей [1]. 2.6. Статистические методы, используемые для обработки экспериментального материала Обработку результатов проводили на основе методов вариационной статистики с применением параметрических критериев, используя компьютерную программу «Microsoft Excel». Вычислялась средняя арифметическая величина, стандартное отклонение, ошибка средней арифметической величины. Для оценки достоверности различий между двумя средними арифметическими определяли критерий Стьюдента и затем находили р (вероятность ошибки). При р 0,05 различия между средними арифметическими величинами считались достоверными. Кроме этого, для статистического сравнения значений митотического индекса использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.
Регенерация печени крыс после частичной гепатэктомии при введении полиоксидония
Кроме этого, при активации иммунной системы полиоксидонием и макрофагов тамеритом увеличивается ядерно-цитоплазматический индекс в более отдаленных от места резекции участках, что свидетельствует об увеличении числа полиплоидных гепатоцитов. При действии тималина имеется лишь тенденция к его увеличению.
Митотический индекс в деструктивно-реактивную фазу не изменяется, т.е. активация иммунной системы не влияет на течение клеточной формы регенерации печени в данную фазу.
Оценку развития процессов внутриклеточной регенерации можно проводить по числу двуядерных клеток и исследования показали, что на нее, в отличие от клеточной регенерации, препараты влияют по-разному. При этом наиболее выраженный эффект в отличие от рассматриваемых ранее показателей проявляется при использовании полиоксидония. Количество двуядерных гепатоцитов резко возрастает во всей ткани органа и увеличивается по направлению от 1-го участка к 3-му. Тималин по своему эффекту несколько уступает полиоксидонию и вызывает равномерное увеличение показателя во всей ткани. Тамерит же существенно не влияет на изменение количества двуядерных клеток печени в ответ на резекцию. Однако во 2-ом и 3-ем участках препарат отменяет данную реакцию (Рис.6). Наблюдаемое увеличение в столь ранние сроки эксперимента можно объяснить тем, что в некоторых тканях клетки могут надолго задерживаться в вг-фазе и после стимула к пролиферации сразу делиться, не проходя S-фазы [114]. По-видимому, активированные клетки иммунной системы задействуют большее количество клеток в данной фазе и увеличивают число ацитокинетических митозов, т.е. митозов без цитотомии, которые являются одним из способов образования двуядерных клеток, о чем свидетельствует рост количества двуядерных клеток при введении полиоксидония. Увеличение же при введении тималина свидетельствует о важной роли Т-лимфоцитов в этом механизме. При этом роль макрофагального звена незначительна. Однако различия в эффектах полиоксидония и тималина дают основание предполагать существование и других механизмов влияния иммунной системы на внутриклеточные процессы регенерации в деструктивно-реактивную фазу.
Пролиферативная фаза у нелеченных животных характеризуется нарастанием массы сохранившейся части органа за счет как сухой массы, так и жидкости, снижением количества гепатоцитов на единицу площади и увеличением их размеров во всех зонах, повышением размеров ядер в 1-ом и 2-ом участках по сравнению с первой фазой, увеличенным ядерно-цитоплазматическим индексом. Под влиянием полиоксидония и тамерита масса регенерирующей печени увеличивается более значительно, чем в контроле, хотя эффект препаратов выражен в одинаковой степени. Тималин же не изменяет динамику восстановления массы органа (Рис.2).
При этом сухая масса ткани как у леченных препаратами, так и у контрольных животных через 17 часов после операции достигает величины, соответствующей показателю непосредственно после резекции. В тоже время содержание жидкости в органе продолжает нарастать. При этом различия в действии препаратов и их эффект по отношению к контрольным животным физиологически не значимы (Рис.3).
Введение оперированным животным полиоксидония и тималина приводит к тому, что отмеченные в деструктивно-реактивную фазу увеличение числа гепатоцитов на единицу площади сохраняется и на 17 часов после резекции. При этом если в случае полиоксидония все же отмечается тенденция к снижению числа клеток, то при введении тималина в 1-ом и 2-ом участках изменения носят противоположную направленность. При использовании тамерита изменения показателя аналогичны таковым у контрольных животных.
В пролиферативную фазу регенерации печени у контрольных животных во всех участках органа гепатоциты представлены более крупными клетками, а у крыс, леченных полиоксидонием и тималином, более мелкими. При этом диаметр гепатоцитов после применения тималина меньше, чем после полиоксидония. У животных, получавших тамерит, гепатоциты не отличаются по размерам от контрольных крыс (Рис.7).
У опытных животных размеры ядер в пролиферативную фазу регенерации, как и в контроле, во всех участках увеличиваются. В 1-ом и 2-ом участках это увеличение менее выражено, чем у нелеченных животных, а в 3-ем соответствует контролю. Различий в действии препаратов выявить не удается (Рис.8). Ядерно-цитоплазматический индекс при этом повышен во всех случаях, причем в большей степени при использовании тималина.
Митотический индекс в пролиферативную фазу увеличивается только при активации макрофагального звена тамеритом.
При оценке внутриклеточной регенерации по числу двуядерных клеток выявлены следующие закономерности. Активация иммунной системы полиоксидонием приводит к тому, что количество двуядерных клеток в пролиферативную фазу остается повышенным во всей массе органа в той же степени, что и в первую фазу регенерации печени. В случае же активации Т-лимфоцитов тималином первоначальное увеличение доли этих клеток сменяется падением показателя не только относительно деструктивно-реактивной фазы, но и по отношению к контролю и интактным животным. Данные изменения можно объяснить наличием бимитозов, т.е. митозом двуядерных клеток. При данном делении в метафазе наступает объединение хромосомных наборов в одну метафазную пластинку и в результате образуются ядра следующего уровня плоидности. Последнее подтверждается также и повышением ядерно-цитоплазматического индекса.
При активации макрофагов количество двуядерных клеток в данную фазу увеличивается в большей степени во 2-ом участке, по-видимому, за счет ацитокинетических митозов, в которых клетка проходит все фазы нормально, но цитотомия не наступает (Рис.9).
Таким образом, активация различных звеньев иммунной системы изменяет течение регенераторного процесса в печени после частичной гепатэктомии, при этом активация иммунной системы в целом и отдельно Т-звена в большей степени влияет на внутриклеточную регенерацию, а макрофагов - на клеточную.
Влияние тимоцитов животных, получавших полиоксидоний, на регенерацию печени интактных реципиентов
При введении тамерита животным после кровопотери через 4 часа увеличивается масса селезенки при неизменной клеточности. Через 17 часов наблюдается снижение количества тимоцитов (Табл.45).
Несмотря на то, что в основе кровопотери также как и при резекции печени лежит убыль клеток, реакция на нее кроветворной ткани имеет свои особенности определяемые спецификой воздействия и регенераторным потенциалом гемопоэтической ткани. Во-первых, если при резекции печени в равной степени удаляются все пулы гепатоцитов, то при кровопотере главным образом зрелые циркулирующие в периферической крови клетки. Во-вторых, в физиологических условиях регенераторный потенциал гепатоцитов не высок и оперативное вмешательство является сигналом к внутриклеточной и клеточной регенерации. Кроветворная же ткань интенсивно регенерирует и в физиологических условиях, обеспечивая постоянство клеток крови. Кровопотеря же лишь интенсифицирует этот процесс.
В результате перечисленных особенностей в реакции системы крови на кровопотерю, в отличие от реакции печени на резекцию, не удается выделить 2-х фаз регенерации. Вместе с тем в регенерации печени и системы крови можно выделить и ряд общих черт. И в том, и другом случае на ранние сроки (4 часа) после экстремального воздействия развивается лимфоцитарная инфильтрация ткани, значительно ослабевающая к 17 часам. При обоих воздействиях отмечается полиплоидизация клеток: гепатоцитов в печени, мегакариоцитов в костном мозге. Как и при регенерации печени в циркуляцию поступают мелкие клетки - эритроциты. Эритроидные клетки, однако, более насыщены гемоглобином. Наконец, воздействие на иммунную систему иммунокорректорами изменяет течение регенераторного процесса.
Активация иммунной системы полиоксидонием приводит к тому, что при кровопускании в объеме 2% от массы тела убыль циркулирующих эритроцитов выражена менее значительно за счет поступления клеток из депо, на что указывает уменьшение массы селезенки, а восстановление содержания лейкоцитов наступает раньше за счет активации лейкопоэза. Эритроидная и гранулоцитарная гиперплазия костного мозга в исследуемые сроки при введении животным препарата выражены более значительно. В результате активации эритропоэза образуются более насыщенные гемоглобином клетки. При этом следует отметить, что данный эффект развивается на фоне отмены лимфоцитарной инфильтрации костного мозга. В то же время в отличие от чистой кровопотери клеточность селезенки и тимуса возрастают к 17 часам, при этом гиперплазии тимуса предшествует снижение массы и клеточности органа на 4 часа. При воздействии на Т-звено иммунной системы тималином ускоряется восстановление числа эритроцитов в циркулирующей крови за счет активации эритропоэза и ускоренного поступления клеток в циркуляцию. Они более насыщены гемоглобином, чем при кровопотере у «нелеченных» животных. При этом препарат практически не изменяет интенсивность лейкопоэза. Ранняя лимфоцитарная инфильтрация костного мозга практически отсутствует. В то же время клеточность и селезенки, и тимуса к 17 часу снижены. У тимуса эффект наблюдается уже с 4-х часов. При воздействии на макрофагальное звено тамеритом не отмечается изменений реакции эритроидного ростка, не происходит задержки эритроцитов в костном мозге через 4 часа после кровопотери. Качественные характеристики эритроцитов не отличаются от интактных животных. Существенно не изменяется и лейкоцитарная реакция, а развивающаяся при кровопотере лимфоцитарная инфильтрация костного мозга при использовании препарата сохраняется и на 17 часов. Со стороны клеточности лимфоидных органов изменений не отмечено за исключением ее снижения у тимуса через 17 часов. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что ранняя реакция (до 17 часов) кроветворной ткани на кровопотерю характеризуется расширением плацдарма эритропоэза и сокращением гранулоцитопоэза. При этом в кровь поступают более мелкие и более насыщенные гемоглобином клетки. При стимуляции иммунной системы полиоксидонием расширение плацдарма эритропоэза почти вдвое превышает реакцию у «нелеченных» животных. Кроме того, в такой же степени возрастает и плацдарм гранулоцитопоэза. Стимуляция же Т-клеточного и макрофагального звена не изменяет реакцию. Воздействие на иммунную систему никак не сказывается на качественных характеристиках эритроцитов в этот период (Рис.22, 23). Наши исследования подтверждают данные других авторов о миграции лимфоцитов при кровопотери из тимуса и селезенки в костный мозг и активацией ими эритропоэза [11,102,152]. Функциональное состояние иммунной системы может существенно влиять на этот процесс. Об этом свидетельствует изменение клеточности тимуса и селезенки под влиянием иммунокорректоров у анемизированных крыс.
