Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Тяжелые металлы как экзогенный фактор нарушения развития организмов (обзор литературы) 9
1.1. Тяжелые металлы в окружающей среде 9
1.2. Особенности влияния тяжелых металлов на разных ступенях онтогенеза животных 17
1.2.1. Токсическое действие тяжелых металлов 17
1.2.2. Мутагенный эффект тяжелых металлов 28
1.2.3. Механизмы устойчивости организмов к тяжелым металлам 33
Глава 2. Материал и методы исследования 39
Глава 3 . Влияние мышьяка, кадмия, ртути и свинца на биологические показатели D. melanogaster 43
3.1. Влияние солей As. Cd, Hg и Pb на жизненный цикл дрозофилы 43
3.2. Влияние солей As. Cd, Hg иРЬ на плодовитость дрозофилы 57
3.3. Влияние солей As, Cd, Hg иРЬ на соотношение полов 64
Глава 4. Тератогенный эффект мышьяка, кадмия, ртути и свинца на D. melanogaster 70
4.1. Влияние солей As, Cd, Hg и Pb на жизнеспособность дрозофилы. 70
4.2. Влияние солей As, Cd, Hg и Pb на развитие крылового аппарата дрозофилы 77
4.3. Влияние солей As, Cd, Hg и Pb на щетиночный узор дрозофилы 92
Выводы 122
Практические предложения 125
Список литературы 126
Приложения 157
- Особенности влияния тяжелых металлов на разных ступенях онтогенеза животных
- Мутагенный эффект тяжелых металлов
- Влияние солей As. Cd, Hg иРЬ на плодовитость дрозофилы
- Влияние солей As, Cd, Hg и Pb на развитие крылового аппарата дрозофилы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Научно-технический прогресс привел к резкому росту загрязнения окружающей среды в связи с увеличением объемов промышленных отходов, сбрасываемых в биосферу, что усиливает негативное влияние токсикантов на развитие живых организмов, в том числе и человека. Особое место среди загрязняющих веществ занимают тяжелые металлы (ТМ), основными источниками которых являются карьеры и шахты по добыче полиметаллических руд, предприятия цветной металлургии, химическая промышленность, производство минеральных и использование органических удобрений и пр. Первичными аккумуляторами ТМ выступают растения, через которые по трофическим цепям они передаются животным и человеку.
Особенностью загрязнения окружающей среды ТМ является то, что они не изымаются и их концентрация постепенно возрастает, вследствие чего увеличивается их негативное воздействие на организмы, что вызывает возникновение нарушений в строении и функционировании органов и систем органов (Реутова Н.В., 2008; Свинухова С.В., 2010; Xu Y., Wang Y., Zheng O., Li B. et al., 2008). Установлено, что наиболее чувствительными к действию ТМ являются ранние стадии развития живых существ (Барашнев Ю.И., Бахарев В.А., 2010; Pietrock M., Meinelt N., Marcogliese D.J., 2008; и др.). Тяжелые металлы оказывают мутагенное (Баянова М.Ф., Кулкыбаев З.К., Дюсенбаева Н.К., 2004; Pruski A.M., Dixon D.R., 2002; Bjerreqaard H.E., 2007; и др.) и канцерогенное (Абилев С.К., Тарасов А.В., Тарасов В.А., 2004; Коста М., Хек Дж.Д, 1993; и др.) действия.
При этом все живые организмы обладают определенной устойчивостью к действию тяжелых металлов. Она определяется способностью организмов при поступлении металлов вырабатывать специфические молекулы металлотионеинов (МТ). Благодаря наличию в тканевых белках тиоловых, карбоксильных и аминных групп происходит связывание ТМ и выведение их из организма.
Действие различных доз отдельных металлотоксикантов изучено на многих животных объектах как в природных условиях (Голованова Е.В., 2005; Langdon C.J., Piearce T.G., Feldmann J., Semple K.T. et al., 2003), так и в лабораторных экспериментах (Слободян В.А. 1980; Lemarie A., Morzadec C., Mrino D., Micheau O. et al., 2006). Большинство работ, посвященных влиянию ТМ, касаются водных объектов. Менее всего исследованы представители типа Членистоногие, несмотря на колоссальное разнообразие видов и их важную роль в природе и в жизни человека. Что касается Drosophila melanogaster, являющейся одним из наиболее подходящих объектов для изучения онтогенеза, поскольку она характеризуется коротким циклом развития, высокой плодовитосью, простотой содержания в лабораторных условиях, малым числом хромосом (2n=8) и изученности характера наследования многих признаков (Полуэктова Е.В., Митрофанов В.Г., Бурыченко Г.М., Мяснянкина Е.Н. и др., 1975), то в известной нам литературе нет сведений о действии постепенно возрастающих доз отдельных ТМ и их комбинаций на данный вид. Поэтому нами была предпринята попытка проанализировать действие на развитие дрозофилы ионов четырех элементов (As3+, Cd2+, Hg2+, Pb2+), относящихся к группе приоритетных (Ильин В.Б., 1991) – накапливающихся в окружающей среде высокими темпами – тяжелых металлов.
Цель исследования – изучение действия солей мышьяка, кадмия, ртути и свинца, взятых в различных концентрациях и сочетаниях на развитие D. melanogaster в течение трех поколений.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи.
1. Исследовать влияние мышьяка, кадмия, ртути и свинца на продолжительность цикла развития от яйца до имаго.
2. Определить зависимость плодовитости дрозофилы от сочетания и дозы ТМ в питательной среде.
3. Установить характер расщепления по полу в трех поколениях в зависимости концентрации и сочетания металлов в среде.
4. Изучить изменчивость морфологических признаков, ведущих к падению жизнеспособности особей, подвергшихся влиянию солей тяжелых металлов.
5. Выявить действие ТМ на развитие крылового аппарата дрозофилы.
6. Установить влияние металлов на щетиночный аппарат дрозофилы.
7. Проанализировать характер наследования выделенных терат.
Новизна работы. Впервые проведено изучение токсического действия на D, melanogaster арсенита натрия, нитратов кадмия, ртути и свинца в концентрациях от 1 до 10 ДУ (допустимого уровня содержания ТМ) в разных комбинациях (по одному, два, три и четыре элемента) на протяжении трех поколений.
Установлено, что содержание в питательной среде тяжелых металлов практически не влияет на продолжительность стадии яйцоличинка и, главным образом, удлиняет личиночную и куколочную фазы развития.
Плодовитость дрозофил резко снижается относительно контроля уже при действии 1 ДУ, наблюдается изменение соотношения полов в основном в сторону преобладания особей женского пола. При этом наименьшая степень совпадения теоретически ожидаемого и практически наблюдаемого расщепления по полу зафиксирована в большинстве случаев при высоких дозах ТМ в независимости от комбинации элементов.
Изученные ТМ оказывают и тератогенное действие на объект исследования. Однако бльшая часть этих аномалий оказалась ненаследственной. О мутагенном эффекте использованных металлов свидетельствует обнаружение особей с аномальными крыльями (vestigial, vestigial-strap, vestigial-notched, новый аллель small wing – small wing-3), тораксом (Krppel) и с измененным щетиночным узором (Humeral, polychaetoid, polychaetous, аутосомно-доминантный ген с неполной пенетрантностью, определяющий редукцию задней супраалярной макрохеты).
Теоретическая и практическая значимость. Данные о влиянии тяжелых металлов на онтогенез D. melanogaster существенно расширяют представления об их токсическом и мутагенном действии на организмы. Тяжелые металлы отрицательно сказываются на всех биологических показателях дрозофилы: удлиняют продолжительность развития, снижают плодовитость, вызывают формирование уродств, приводящих к снижению жизнеспособности мушек. Дрозофила является одним из модельных объектов биологии развития, поэтому полученные в эксперименте результаты, могут быть экстраполированы на другие организмы.
Результаты исследований показывают, что дрозофила может быть использована для мониторинга окружающей среды путем сравнения биологических показателей природных популяций и лабораторных линий.
Материал диссертации используется в учебном процессе кафедры общей биологии Ставропольского государственного университета, Ставропольского филиала Московского государственного гуманитарного университета им. М.А. Шолохова, кафедры биологии и химии Карачаево-Черкесского государственного университета им. У.Д. Алиева, кафедры физиологии человека и животных Кабардино-Балкарского государственного университета им. Х.М. Бербекова в качестве дополнений к учебным материалам по дисциплинам биологического цикла.
Основные положения, выносимые на защиту:
мышьяк, кадмий, ртуть и свинец оказывают токсическое действие на биологические показатели Drosophila melanogaster: вызывают удлинение продолжительности цикла развития за счет затягивания, главным образом, стадий личинкакуколка, куколкаимаго, снижение плодовитости и приводят к нарушениям в соотношении полов в сторону численного преобладания особей женского пола;
тяжелые металлы обладают тератогенным действием: вызывают наследственные и ненаследственные аномалии в строении головы, крыльев, торакса, брюшка; некоторые из них обладают летальным или полулетальным эффектом; наиболее часто наблюдаемой аберрацией является количественное изменение макрохет;
тяжелые металлы приводят к мутациям отдельных генов дрозофилы: Krppel – аутосомно-доминантная мутация с неполной пенетрантностью, small wing-3 – X-сцепленная рецессивная мутация, vestigial – аутосомно-рецессивная мутация, polychaetoid и polychaetous – аутосомно-рецессивные мутации, Humeral – аутосомно-доминантная мутация.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены на 50-й, 53-й, 54-й, 55-й и 56-й научных конференциях «Университетская наука – региону» (Ставрополь, 2005, 2008, 2009, 2010, 2011 гг.), на ежегодной международной научно-практической конференции «Проблемы экологической безопасности и сохранение природно-ресурсного потенциала» (Ставрополь, 2007, 2009, 2010, 2011 гг.); на шестой международной научно-практической конференции «Проблемы сохранения и рационального использования биоразнообразия Прикаспия и сопредельных территорий» (Элиста, 2008 г.); на XIV международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2009 г.); на второй Международной заочной научно-практической конференции «Актуальные проблемы науки» (Россия, Тамбов, 27 сентября 2011 г.).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 169 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Список литературы включает 269 источников, в том числе 93 зарубежных. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 10 рисунками.
Публикации. Основные положения диссертации изложены в 15 научных статьях, в том числе в 3 изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Особенности влияния тяжелых металлов на разных ступенях онтогенеза животных
В онтогенезе животных происходит ряд последовательных морфологических, физиологических и биохимических преобразований, и действие экстремальных факторов, в том числе и тяжелых металлов, может вызвать нарушения в нормальном протекании этих процессов. Пот этом наиболее чувствительными к действия ТМ являются ранние стадии развития зародыша (Clubb R.W., Gaufin A.R., Lords J.L., 1975; Valenti T.W., Cherry D.S., Neves R.J., Schmerfeld J., 2005; Pietrock M., Meinelt N., Marcogliese D.J., 2008), a также процесс гаметогенеза у взрослых особей (Пинкина Т.В., 2005; Хатюшин А.Г., 2008; Мусаев Б.С, Мурадова Г.Р., Рабаданова А.И., 2009; Филатов Б.Н., Точилкина А.П., 2010; White D.H., Finley М.Т., Ferrel J.E., 1978; Russel L.K., DeHaven J.I., 1981; Ram, Sathyanesan, 1983; Lock K., Janssen C.R., 2002; Pollock, Machin, 2008). Токсичность ртути в дозах 0,5 и 1,0 мг/л в процессе эмбрионального развития морского ежа проявляется в виде аномалий у плу-теусов на стадии гаструляции, а у ланцетника такие дозы кадмия приводят к нарушению процесса нейруляции (Lee Н.Н., Xu С.Н., 1984). Аномально позднее дробление и его остановку у улитки Ilyanassa obsoleta ртуть вызывает в дозах 10 7 и 10"6, медь - 10" , кадмий - 10"3, свинец - 10-10"2 моль/л (Conrad G.W., 1988).
Изучение влияния различных доз кадмия (0,0, 1,0, 10,0, 50,0 и 100,0 мкМ) в течение 6, 12 и 24 часов на зародышевую линию нематоды Саепог-habditis elegans показало увеличение апоптоза с возрастанием дозы и времени воздействия токсиканта. Однако при 24-часовой экспозиции в концентрации 50,0 мкМ апоптоз клеток переставал возрастать, а при действии 100,0 мкМ этот показатель значительно уменьшался (Р 0,05), что связано со снижением числа клеток зародышевой линии (Wang S., Tang М., Pei В., Xiao X. etal., 2008).
У дрозофилы наиболее чувствительными к действию никеля оказались зародышевая и личиночная фазы, нежели стадия куколки (Бессчетнов И.И., Вардуни Т.В., Бутенко Е.В., 2010).
Слабый летальный эффект на дрозофилу оказывает обработка свежеот-ложенных яиц растворами перманганата калия (Науменко В.А., 1936; Сахаров В.В., 1938), азотнокислого свинца (Пономарев В.П., 1937; 1938) и медного купороса (Магржиковская К.В., 1936). Гибель дрозофил двух диких ин-бредных линий (Canton и Stephenville) зафиксирована при действии сульфата меди и аммонийсульфата железа. С увеличением концентрации воздействия первого соединения со 160 до 960 мкг/мл смертность особей возросла с 30 и 40 до 100 %. А в случае повышения дозы железосодержащего вещества с 660 до 3300 мгк/л она изменилась с 24 и 34 до 45 и 40 % соответственно по линиям(Тштіег J.H., Gardner E.J., 1960). Возрастание смертности дрозофил наблюдалось И.И. Бессчетновым, Т.В. Вардуни и Е.В. Бутенко (2010) при повышении концентрации никеля в питательной среде и при увеличении времени экспозиции родительских особей. Так, максимальная гибель потомков (66,7 %) при трехдневном воздействии никеля на имаго зафиксирована при действии 16 мг %, тогда как при этой же концентрации через 7 дней наблюдался 100 % летальный эффект.
Медь и мышьяк проявляют наибольшую токсичность по отношению к сперме и эмбрионам морского ежа, в то время как чувствительность к кадмию максимальна у личинок и взрослых особей. Токсичность цинка и свинца примерно одинакова на всех стадиях жизненного цикла морского ежа и составляет 1,926-28 мг/л для цинка и 0,6-19 мг/л для свинца (Dinnel Р.А., Link J.M., Stober Q.G., 1989). Также изучена чувствительность различных жизненных стадий развития двух видов рыб - Fundulus heteroclitus и Menidia menidia. Наиболее токсичными ионы кадмия являются для личинок, в то время как яйца и взрослые особи обоих видов рыб были более стойкими к действию металла (Middaugh D.P., Dean J.M., 1977).
Многочисленные отклонения от нормы в развитии эмбрионов утки-кряквы (аномальные формы ног, деформация черепа, изменение формы клюва и т.п.) наблюдали при содержании в яйце ртути в дозе 1 мг/кг сырой массы (Heinz G.H., Hoffman D.J., 2003). Хлорид метилртути в концентрациях 0, 0,7, 2, 3,3, 4,6 и 5,2 мг/кг сухой диеты у американской пустельги Falco sparverius вызывал уменьшение количества яиц в кладке и числа вылупившихся птенцов (Albers R.H., Koterba М.Т., Rossmann R., Link W.A. et al., 2007).
У человека наличие высокого уровня свинца обусловливает повышенное его поступление через фетоплацентарный барьер в организм плода (Зайцева Н.В., Уланова Т.С. и др., 2002). Возможность свободного прохождения солей некоторых ТМ через лактационный барьер выявлена в опытах на мышах (Гуляева О.Г., Дроздова Л.И., 2007; Sugawara N., Ohba Т., Nakai К., Kakita A. et al., 2008) и крысах (Ермошкаева Э.П., Дроздова Л.И., 2007). Проникновение свинца в организм детей через грудное молоко возможно у человека при железодефицитных состояниях (Стадник А.П., Кувшинников В.А., Шенец С.Г., 2008). Метиловая ртуть является тератогеном, обладающим достоверным повреждающим эффектом на эмбрион и плод человека, вызывающим акроцефалию, слепоту, церебральные параличи, нарушение пигментного обмена и др. (Барашнев Ю.Н., Бахарев В.А., 2010).
Помимо изучения влияния металлов на различные стадии развития организмов большое количество работ посвящено исследованию особенностей накопления ТМ в различных органах животных и их физиологические и биохимические реакции в ответ на избыточное содержание металлотоксикантов.
Различные тяжелые металлы в разной степени могут накапливаться в тех или иных органах одних и тех же животных. При изучении чувствительности пиявок к действию солей тяжелых металлов установлено, что их негативное влияние уменьшается в ряду Hg»Cd Cu»Pb Cr»Ni. (Каменев О.Ю., 2008). Эйхенбергер Э. (1998) приводит ряд токсичности металлов для насекомых: Cd Hg Cu»Zn Cr Pb Ni, а В.В. Стрельников и И.В. Хмара (2004) для человека: Hg Cu Zn Ni Pb Cd Cr Sn Fe Mn Al.
Установлена прямая связь между концентрациями металлов в пищевом рационе и уровнем их поступления в организм наземных улиток (Gomot-de Vaufleury A., Pihan F., 2002) и полевок (Мухачева СВ., Безель B.C., 2007). При поедании почвы с повышенным содержанием подвижных форм ТМ происходит снижение количества видов и особей дождевых червей (Голованова Е.В., 2005) и пиявок (Черная Л.И., 2008). Высокий уровень аккумуляции металлов дождевыми червями выявлен и при изучении биоценотических комплексов техногенных территорий г. Стерлитамака (Зейферт Д.В., Рудаков К.М., Славченко B.C., 1990), шести пунктов восточной части штата Теннеси США (Van Hook R.I., 1974), в районах добычи руд (Langdon C.J., Piearce T.G., Mehard А.А., Semple К.Т., 2001) и вдоль автотрасс (Gish CD., Christensen R.E., 1973). Однако реакция дождевых червей на содержание в среде тяжелых металлов не всегда однозначна. Так, в почвах в районе хвостохранилища Нальчикского гидрометаллургического завода наблюдается стабильность численности, биомассы и структуры фауны этой группы животных, что свидетельствует о широких пределах нормы реакции дождевых червей (Рапопорт И.Б., Темботова Ф.А., Улигова Т.С., Сабирова Ю.М., 2004).
Рядом авторов было изучено действие отдельных металлов на жизнеспособность особей различных животных. Так, гибель 50 % пиявок отмечена при инкубации в растворе солей ртути, меди и никеля в концентрациях 0,29±0,1, 9,11±0,32 и более 1000 мг/л соответственно (Каменев О.Ю., 2008). При воздействии метилртути на планарию в концентрациях 0,5, 1 и 2 мг/л наблюдалась 100 % смертность через 5 дней, 1 день и 5 часов соответственно (Best J.B., Morita М., Ragin J., Best J., 1981). Содержание дождевых червей в почве с концентрацией метилртутьхлорида 25 или 125 мг/кг вызывало гибель особей в течение 12 недель. В остальных случаях (1 и 5 мг/кг) выживаемость составила 92 и 79 % соответственно (Beyer W.N., Cromartie Е., Moment G.B,, 1985). Полная гибель дождевых червей наблюдалась при содержании в почве 300 мг меди/кг сухой массы в течение 14 дней (Langdon C.J., Piearce Т.В., Feldmann J., Semple K.T. et al., 2003).
Чувствительными к высокому содержанию некоторых ТМ (Fe, Mn, РЬ, Ni, Cd) оказались моллюски из района свинцово-плавильного завода ПО «Дальполиметалл». В их телах содержание металлов оказалось намного выше фонового значения (Богатов В.В., Богатова Л.В., 2009). Превышение фоновых уровней мышьяка обнаружено в органах и тканях двустворчатого моллюска Дальневосточного Приморья (Ковековдова Л.Т., Иваненко Н.В., Симоконь М.В., Щеглов В.В., 2001). Высокое содержание ртути в мягких тканях моллюсков ведет к падению скорости фильтрации воды за счет дегенерации нервных и эпидермальных клеток и редукции щетинок (Gregory М.А., Marshall D.J., George R. С, Anandraj A. et al., 2002).
Мутагенный эффект тяжелых металлов
Возможность получения мутаций под действием химических агентов у дрозофилы впервые была установлена В.В. Сахаровым (1932; 1933; 1935). В серии экспериментов действия раствора йода на оплодотворенные яйца D, melanogaster им была получена мутация «Notch», а также летальные сцепленные с полом и аутосомные мутации. На появление доминантных летальных мутаций у дрозофилы может влиять и степень загрязненности среды обитания: чем она выше, тем больше частота леталей (Боднарук М.М., 1999; Гарипова Р.Ф., 2009).
В ряде случаев установлены факты мутагенной активности некоторых тяжелых металлов. Это явление изучается как на организменном, так и на клеточном уровнях. Во втором случае удается выяснить молекулярные механизмы взаимодействия ТМ с компонентами клетки. Развитие наследуемых структурных аномалий глаз у дрозофилы зафиксировано при действии сульфата меди (Hadorn Е., Anders G., 1946; Anders G., 1955/56; Edwards J.W., Turner J.H., Gardner E.J., 1960; Gardner E.L., 1966). При добавлении сублетальных доз органических и неорганических соединений ртути, сурьмы, серебра и мышьяка в питательную среду И. А. Рапопорт (1939) наблюдал у дрозофилы массовые появления морфозов типа minute, brown, ski, tumor, black, eyeless, rough, aristapedia, yellow и др. Фенокопии у этого объекта вызывают хлорид ртути и нитрат серебра в дозах 0,00363 и 0,0589 гМ/л соответственно. В первом случае наблюдалось уменьшение размеров тела, а во втором - посветление его окраски (Sang J.H., McDonald J.M., 1954).
Исследование влияния тиоТЭФа (тиофосфамида) и арсената натрия на мышей в течение четырех поколений показало, что по отдельности эти вещества существенно не повышают частоту доминантных летальных мутаций по сравнению с контролем. При совместном их действии, в частности, в комбинации 100 мг мышьяка/л воды с 1 мг тиоТЭФа/кг веса тела, резко возрастает частота доминантных деталей. По мнению авторов, результат действия мышьяка заключается в том, что он «подавляет ферменты, участвующие в репарационной системе, и таким образом вызывает, по-видимому, увеличение частоты мутаций, индуцированных мутагеном» (Шрам Р., 1977, с. 147).
При изучении метафазных хромосом клеток костного мозга крыс, подвергшихся хроническому действию хрома, были обнаружены ацентрические фрагменты, дицентрики, транслокации с частотой 94±0,90, 0,52±0,23 и 0,72±0,27 % соответственно от общего числа аберрантных хромосом. В среднем в этом варианте опыта на долю метафазных перестроек пришлось 12,89±0,36 %. При однократном остром отравлении частота и разнообразие нарушений структуры хромосом возрастала с увеличением сроков действия, но во всех случаях она была ниже, чем при хроническом отравлении. Так, частота аберраций в метафазе через 2 часа после воздействия бихромата калия была равна 5,37±1,27, а через 12 часов - 7,21±1,53 %. В контроле этот показатель составил 1,97±0,5 % (Бигалиев А.Б. Туребаев М.Н., Элемесова М.Ш, 1977).
Хром при совместном поступлении со свинцом в организм мышей с питьевой водой или при внутрибрюшинном инъецировании вызвал повреждения в структуре хромосом в эритробластах костного мозга мышей, проявляющиеся, по мнению авторов, в увеличении эритроцитов с микроядрами (Витвицкий Б.Н., Бахитова Л.М., Соболева Л.С., Шевченко В.А., 1996).
Число микроядер в эритроцитах периферической крови человека является одним из важных показателей генетической нестабильности. Исследование крови жителей городов Караганда и Балхаша показало, что повышение уровня некоторых ТМ в почве ведет к росту темпов мутирования. Частота эритроцитов с микроядрами у людей, проживающих в крупном центре цветной металлургии, г. Балхаше, почти вдвое превышает аналогичные показатели жителей Караганды (16,53±0,27 и 8,75±0,36 % соответственно). У обследованных обнаружены эритроциты и с макроядрами с частотой 6,69±0,15 и 3,47±0,26 % соответственно (Дюсембаева Н.К., Кулкыбаев С.А. и др., 2004). О возникновении мутаций среди жителей г. Балхаша свидетельствует и наличие врожденных патологий развития, тесно связанных (г = 0,87) с загрязнением окружающей среды города (Намазбаева З.И., Дюсембаева Н.К., Му-кашева М.А., Садыков К.И., 2010).
При избыточном содержании в почве кадмия, марганца и цинка в комплексе с повышенной радиационной обстановкой зафиксировано увеличение частоты цитогенетических нарушений в лимфоцитах периферической крови воспитанников школы-интерната г. Таштагола Кемеровской области (Минина В.И., Дружинин В.Г., Глушкова А.Н., Головина Т.А. и др., 2009). Корреляционная зависимость между содержанием мышьяка в природных водах и количеством микроядер в эксфолиативных клетках полости рта установлена у детей и подростков, проживающих в населенных пунктах Лухунского ущелья, городах Амбролаури и Тбилиси, испытывающих на себе влияние метал-лотоксиканта в различной степени. Количество клеток с микроядрами (на 1000 клеток) у обследуемых соответственно составило 22,77±0,8, 4,5±2,2, 2,3±1,32 (Гагошидзе М.В., Антелава М.О., Зедгинидзе А.Г., 2004).
Повышенная частота хромосомных аберраций выявлена в лимфоцитах периферической крови рабочих Усть-Каменегорского титано-магниевого комбината, подвергающихся воздействию пыли металлического титана, Ті02 и ТіСЦ (Баянова М.Ф., Кулкыбаев З.К., Султанбеков З.К., Дюсембаева Н.Л., 2004), и у рудокопов Перуанских Анд (Santa Maria S.R., Arana М, Ramirez О., 2007).
Завышенными по сравнению с контролем оказались частоты хрома-тидных и хромосомных поломок в лимфоцитах плавильщиков в условиях загрязнения среды мышьяком. Однако корреляция между частотой хроматид-ных отклонений и временем воздействия токсиканта была слабой. В экспериментах, которые проводились в хорошо контролируемых условиях, не установлена мутагенная активность свинца. Из-за высокого сродства ртути к сульгидрильным группам в системе веретена деления этот металл вызывает С-митозы, воздействуя таким образом на генетический материал. Кроме того, реагируя с азотистыми основаниями, ртуть уменьшает стабильность двойной спирали ДНК. Что же касается мышьяка и хрома, то для них характерно явно выраженное кластогенное свойство. Тяжелые металлы действуют на систему веретена деления, ингибируя полимеризацию тубулина, вызывая нарушения в расхождении хромосом, что приводит к образованию анеуплоидных клеток, иногда - к амитозу. Эти митотические яды, не являясь истинными мутагенами, вносят свой вклад в возникновение мутаций, как и истинные мутагены (Алан Л., 1993).
Некоторые ТМ (хром и никель), реагируя с молекулой ДНК, повреждают ее химическую структуру (Захаров И.А., 1984). Кроме того, никель способствует сшиванию молекул ДНК и белков, что приводит к нарушениям в процессе репликации ДНК (Коста М., Хек Дж.Д., 1993).
В последние годы проводятся интенсивные исследования по влиянию ксенобиотиков на клетки in vitro. Так, предварительная обработка жаберных клеток Mytilis edulis кадмием повышает генотоксичность пероксида водорода вдвое. В случае одновременного воздействия кадмия с цинком уровень поврежденное ДНК под влиянием пероксида водорода был значительно ниже, чем в случае воздействия кадмия без цинка (Pruski A.M., Dixon D.R., 2002). Инкубация клеток эпителия почки жабы Xenopus в присутствии кадмия в дозе 0,4 мМ препятствовала увеличению клеточной популяции, что обусловлено торможением пресинтетической стадии клеточного цикла за счет повышения доли клеток, находящихся на стадии Gb и снижения количества клеток на стадиях S и G2 (Bjerreqaard Н.Е., 2007). Мышьяк в дозах 1, 5 и 10 мкМоль/л подавляет пролиферацию и вызывает апоптоз клеток линии MKN45 рака желудка человека на стадии G2/M (Shao Q.-S., Ye Z.-Y., Ling Z.-O., Ke J.J., 2005). Мутагенная активность цинка при остром отравлении крыс (10, 20 и 40 мг/кг) проявляется преимущественно в S- и Gi-фазах митотиче-ского цикла, в ходе которых происходит индукция однонитевых разрывов в ДНК, что приводит к появлению повреждений хроматидного типа (Владим-цев Т.М., Успенская Ю.А., Нефедова В.В., Егорова А.В., 2002).
К угнетению пролиферации эндотелиальных клеток микрососудов головного мозга человека, поврежденных механическим воздействием, приводит инкубация этих клеток с метилртутью в концентрации 3 мкМ, что задерживает восстановление поврежденного клеточного монослоя (Hirooka Т., Fu-jiwara Y., Yamamoto С., Yasutake A. et al., 2007).
Влияние солей As. Cd, Hg иРЬ на плодовитость дрозофилы
Одним из серьезных последствий действия на организмы различных экстремальных факторов является снижение репродуктивного потенциала. В известной нам литературе отсутствуют данные о влиянии ТМ на плодовитость D. melanogaster. Однако известно, что к падению плодовитости особей этого вида может привести высокий уровень загрязненности среды обитания (Боднарук М.М., 1999). Выход личинок снижается также при действии раствора йода на оплодотворенные яйца дрозофилы (Замятина Н.Д., Попова О.Т., 1934).
В эксперименте плодовитость дрозофил рассчитывали как среднее число потомков, выведшихся на одну родительскую самку в течение 10 суток после первого вылета (приложение 1). Выяснилось, что содержание в питательной среде допустимого уровня (ДУ) мышьяка, кадмия, ртути и свинца по отдельности приводит к сокращению числа потомков в первом поколении до 25,28, 21,70, 20,53 и 18,78 соответственно, тогда как в опыте без использования ТМ плодовитость составила 32,92 мушки (рис. 2, a-d). С увеличением концентрации каждого из ТМ, как и следовало ожидать, наблюдали дальнейшее снижение плодовитости. Под влиянием ионов мышьяка число особей первого и второго поколений уменьшилось с 25,28 и 23,70 на самку (при 1 ДУ) до 16,01 и 18,42 (при 10 ДУ). В третьем поколении количество потомков снизилось с 19,30 (1 ДУ) до 13,33 (8 ДУ) мушек.
Под влиянием 1 ДУ Cd + в первом поколении на одну самку приходилось 21,70, а во втором - 15,97 мушек, а при концентрации 4 ДУ этот показатель вырос до 29,05 и 18,68. Действие же этого элемента в течение трех поколений привело к более значительному снижению плодовитости: в концентрации 3 ДУ она составила 14,65, в дозе 7ДУ - 8,11, а при 10 ДУ - 7,87 особей. Действие различных доз свинца не вызвало существенных колебаний плодовитости дрозофил в первом и третьем поколениях. Так, количество мушек на одну самку в F, варьировало от 17,27 (10 ДУ) до 22,17 (8 ДУ), а в F3 - от 12,02 (1 ДУ) до 15,91 (2 ДУ). Различия в плодовитости дрозофил зафиксированы при действии свинца в течение двух поколений: от 13,07 при 8 ДУ до 20,14 при 3 ДУ.
Нахождение в среде ионов ртути также вызвало снижение плодовитости относительно контроля, и в дозах 1, 3, 4, 6-9 ДУ на одну самку вылуплялось 19-21 мушек F]. В опытах с использованием 2, 5 и 10 ДУ Hg этот показатель не превышал значения 24. Плодовитость особей первого и второго поколений была несколько ниже. Минимальное количество выведшихся мушек составило 10,02 особи (5 ДУ). Максимальная плодовитость дрозофил второго поколения (18,38) зафиксирована при воздействии 6 ДУ этого токсиканта, а минимальная (10,22) - при 4 ДУ.
Таким образом, содержание в питательной среде одного из ТМ привело к падению плодовитости дрозофил уже при дозе 1 ДУ в первом же поколении. При этом выявлена высокая степень корреляции между дозой содержания мышьяка в питательной среде и числом дрозофил первого и второго поколения из расчета на одну самку (г=-0,86 и -0,74 соответственно), а также между концентрацией кадмия и количеством мушек в F и F3 (г=-0,79 и -0,84). Средняя зависимость между данными показателями зафиксирована при влиянии в трех поколениях мышьяка и свинца (г -0,70). Наибольшее число потомков от одной самки получено в варианте эксперимента с использованием кадмия в концентрациях 3 и 4 ДУ (29,69 и 29,05 соответственно), а минимальная - при использовании кадмия в течение двух поколений, но в дозах 7 и 10 ДУ (8,11 и 7,87 соответственно).
Попарное действие ТМ в различных комбинациях привело к падению плодовитости мушек (рис. 2, e-J). Так, сочетание мышьяка и кадмия в дозе 1 ДУ вызвало уменьшение количества дрозофил первого и второго поколений на одну самку до 20,14 и 17,10 мушек. В третьем же поколении этот показатель составил 25,22 особей. Повышение дозы ТМ повлекло за собой уменьшение числа потомков в Fi (до 9,84 при 5 ДУ) и в F3 (до 7,10 при 4 ДУ), а в F2 этот показатель возрос (до 6,24,78 при ДУ). Более высокие уровни содержания в среде мышьяка и кадмия вызвали увеличение плодовитости дрозофил в F] и F3 (до 21,08 при 9 ДУ и 25,08 при 8 ДУ соответственно) и уменьшение ее вР2(до 14,68 при 10 ДУ).
В варианте опыта с использованием смеси солей мышьяка и ртути число особей Fi на одну самку постепенно уменьшалось с ростом концентрации ТМ от 25,96 (1 ДУ) до 16,18 (10 ДУ). При совместном действии этих ТМ в течение двух поколений наблюдали спад плодовитости до 13,98 (4 ДУ). При действии 1 ДУ As +Hg плодовитость дрозофил второго поколения составила 16,06, тогда как в контроле на одну самку приходилось 31,25 особей. Но при последующем увеличении концентрации этих ТМ произошел рост числа потомков в F3, и при 6 ДУ на одну самку приходилось 23,96 мушки.
В случае присутствия в среде мышьяка со свинцом в дозе 1 ДУ количество мушек на одну самку в первом поколении составило 18,02, во втором -19,72, а в третьем - 15,96 особей. Дальнейшее повышение концентрации металлов привело к росту этого показателя в Fi до 27,12 при 5 ДУ, после чего наблюдали снижение плодовитости до 16,14 при 10 ДУ, а в F2 эти пределы составили от 23,00 при 4 ДУ до 17,85 при 10 ДУ. К некоторому снижению плодовитости привело влияние в трех поколениях As3++Pb2+ в дозах 2-4 ДУ, а концентрация 5 ДУ, как и в Fb вызвала существенное повышение плодовитости до 19,28.
Под влиянием смеси солей кадмия и ртути в невысоких концентрациях наблюдали падение плодовитости во всех трех поколениях. При воздействии 3 ДУ на одну самку в F, приходилось 14,48, в F2 - 9,29, а в F3 - 13,54 особей, тогда как в контроле этот показатель составил 32,92, 30,57 и 31,25 соответственно. При более высоких ДУ зафиксировано увеличение плодовитости до 18,46(вР2при9ДУ), 19,34 и 19,93 (в F2HF3 при 10 ДУ).
Высокая степень обратной зависимости (г -0,70) между плодовитостью дрозофил и дозой токсикантов в питательной среде обнаружена при действии As3++Hg2+, As3++ Pb2+, Cd2++Pb2+ и Hg ++Pb в Fb под влиянием As3++Hg2+ - в F2, а также Hg2++Pb2+- в F3.
Максимальная плодовитость зафиксирована у исходных родительских самок (27,12), посаженных на среду с содержанием мышьяка и свинца в дозе 5ДУ, а минимальная (7,10) - у особей второго поколения под влиянием мышьяка и кадмия в концентрации 4 ДУ.
Совместное нахождение в питательной среде мышьяка, кадмия и ртути (рис. 2, к) в концентрации 1 ДУ снизило плодовитость исходных самок до 20,13, а в дозе 3 ДУ - до 14,40, тогда как в контроле на одну самку приходилось 32,92 мушки. Плодовитость особей первого поколения, подвергшихся влиянию смеси указанных ТМ при 2 ДУ снизилась до 17,10, а при 5 ДУ - до 9,70. В третьем поколении на одну самку при действии 1 ДУ вывелось 16,32, а при 5 ДУ - 11,18 особей, но с повышением концентрации при 8 ДУ этот показатель составил 18,58, а при 10 ДУ - 20,10 особей.
Возрастание совместного содержания в среде мышьяка, кадмия и свинца вызвало снижение плодовитости мух (рис. 2, /). Так, количество особей на одну самку в этом варианте эксперимента снизилось с 21,53 (2 ДУ) до 10,12 (9 ДУ), плодовитость самок первого и второго поколений варьировала в пределах от 18,50 (7 ДУ) и 18,18 (2 ДУ) до 11,40 (10 ДУ) и 11,42 (7 ДУ) соответственно.
В случае одновременного использования солей мышьяка, ртути и свинца (рис. 2, т) в концентрации ІДУ наблюдали уменьшение числа дрозофил в первом и во втором поколениях до 22,90 и 15,66 мушек соответственно. Увеличение концентрации металлов сопровождалось некоторым ростом плодовитости мушек в этих двух вариантах опыта, и при 4 ДУ на одну родительскую самку вылупилось 23,84 и 22,07 особи соответственно. Но в дальнейшем этот показатель упал и при 10 ДУ составил 13,02 и 13,10 соответственно. Плодовитость мушек второго поколения после падения до 15,40 при 2 ДУ возросла до 19,00 при 5 ДУ, а затем уменьшилась до 12,84 при 8 ДУ.
Совместное действие кадмия, ртути и свинца (рис. 2, п) вызвало снижение плодовитости дрозофил уже в малых дозах: при 2 ДУ она составила 16,56, 17,74 и 20,62 особи соответственно по поколениям. В последующем наблюдали уменьшение этого показателя.
Максимальная плодовитость дрозофил (23,84) при использовании сред, содержащих ТМ в сочетаниях по три элемента, зафиксировано у самок под воздействием 4 ДУ As3++Hg2++Pb2+, а минимальная (9,70) - при действии 5ДУ As3++Cd2++Hg2+. Высокая отрицательная корреляция (г -0,70) между плодовитостью и дозой токсикантов в среде установлена при воздействии смесей As2++Hg2++Pb2+ (Fb F2), As3++Cd2++Pb2+ (F,) и Cd2++Hg2++Pb2+ (F,, F3).
Влияние солей As, Cd, Hg и Pb на развитие крылового аппарата дрозофилы
Крылья дрозофилы сочленяются с крыловыми выступами нотума второго грудного сегмента сложной системой аксиллярных пластинок, формирующих множественные шарнирные соединения, обеспечивающие разнообразие степени свободы при движении крыла (Ноздрачев А.Д., Поляков Е.А., Лапицкий В.П., Осипов Б.С. и др., 1999). Развитие крыльев происходит из имагинальных дисков на стадии окукливания путем выворачивания структур крыльев. За несколько часов до вылета через полупрозрачные мембраны куколки хорошо видны сформировавшиеся крылья. Крылья же только что вылупившихся особей короткие нерасправленные (Полуэктова Е.В., Митрофанов В.Г., Бурыченко Г.М., Мяснянкина Е.Н., 1975). Распрямлений крыльев молодых имаго возможно благодаря регулируемому гидростатическим давлением проникновению вдоль костального края крыла гемолимфы. Избыток гемолимфы оттекает в полость тела через медиальные и анальные жилки (Тыщенко В.Г., 1986; Бродский А.К., 1988). Движение гемолимфы обеспечивается работой не только сердца, но и местных пульсирующих органов, которые функционируют автономно (Тыщенко В.Г., 1986). Помимо участия в процессе распрямления крыльев, гемолимфа выполняет трофическую функцию, доставляя питательные вещества ко всем органам (Тыщенко В.Г., 1986; Гилмур Д., 1968), и защитную - от инфекций и поражений паразитами. Последнюю гемолимфа выполняют благодаря специальным белкам плазмы и клеткам-гемоцитам, обладающим способностью к фагоцитозу (Тыщенко В.Г., 1986).
Как установлено в нашем эксперименте, в случае, когда поступление гемолимфы недостаточно, крылья дрозофил могут остаться плохо раскрывшимися или слипшимися. Если же нарушен отток гемолимфы, то ее избыток, накапливаясь, приводит к формированию пузырей на крыльях. Со временем гемолимфа либо оттекает из пузыря, либо стенка последнего лопается, и жидкость вытекает наружу. В обоих случаях крыло оказывается в большей или меньшей степени деформированным.
Наиболее часто встречающейся аномалией при недостаточном поступлении гемолимфы явилось плохое раскрытие у мушек одного или обоих крыльев (рис. 4, а—е): они были сложены вдоль или поперек, скручены или «скомканы», часто направлены в разные стороны, вплоть до 90 к телу. Нередко встречались мушки либо со слипшимися по всей длине или на кончиках, либо с прилипшими к телу и одновременно плохо раскрытыми одним или обоими крыльями. Характер жилкования крыльев у таких особей изучить не удалось.
Результаты скрещиваний однотипных аберрантов и анализа потомства в трех поколениях показали, что подобные и отклонения не являются наследственными. Плодовитость таких особей нормальная. Частоты мушек с плохо раскрытыми и слипшимися крыльями представлены в таблицах 3 и 4. Эти показатели колеблются в широких пределах, и большей частью наличие в среде ионов ТМ значительно повышает количество аномальных особей. Так, в случае с плохо раскрытыми крыльями частота таких особей доходила до 11,79x10"3 в F, (2 ДУ As3++Cd2+), до 10,62x10"3 в F2 (2 ДУ As3++Pb2+) и до 19,33x10"3 в F3 (8 ДУ Hg2+). Исключительно редко (0,20x10"3) особи с плохо раскрытыми крыльями обнаруживались в контроле и только в первом поколении. Не при всех значениях ДУ и вариантах опыта встречаются особи с данной аномалией. При действии на дрозофилу четырех металлов в отдельности в 16 случаях из 120 (13,33±3,10 %) не обнаружено мух с плохо раскрытыми крыльями; при попарных сочетаниях ТМ - в 31 из 180 (17,22±2,81 %); при наличии в среде различных комбинаций по три ТМ - в 37 случаях из 120 (30,33±4,21 %); а при сочетании ионов всех четырех металлов - в 9 из 30 (30,00±8,36 %). Отсюда следует, что при совместном действии трех или четырех ТМ частота вариантов ДУ, при которых встречаются такие тераты, ниже, чем при действии каждого металла в отдельности (р = 0,9500).
Максимальные частоты мушек со слипшимися крыльями в эксперименте составляют: в F] - 19,90x10" при нахождении в среде солей кадмия и свинца в концентрации 8 ДУ; в F2 - 15,00x10" при совместном действии 5 ДУ мышьяка и свинца; в F3 - 17,17хЮ"3 при 7 ДУ мышьяка. В контрольной закладке также были обнаружены дрозофилы со слипшимися крыльями в трех поколениях (0,20x10" , 0,34x10" , 0,59х 10" соответственно).
При действии различных комбинаций по три металла число вариантов опытов, в которых наблюдалось отсутствие мух со слипшимися крыльями, достоверно ниже количества вариантов опытов, где не было обнаружено мух с плохо раскрывшимися крыльями (10,83±2,84 % и 30,83±4,21 % соответственно), в остальных случаях различия по этим показателям несущественны.
Во всех вариантах опыта, за исключением контроля, обнаружены особи с пузырчатыми крыльями, сформировавшимися вследствие нарушения оттока гемолимфы (табл. 5). Чаще всего эти пузыри располагались в дистальной части крыла в районе первой и второй задних и субмаргинальной ячеек, обычно по одному на одном или на обоих крыльях. Размеры их широко варьировали. Иногда вздутие занимало все крыло. У особей с малопузарчатыми крыльями не наблюдали изменений в жилковании. В том случае, когда формировался один большой пузырь, оно было нарушено (рис. 4,f).
Максимальная частота дрозофил с пузырчатыми крыльями установлена во втором поколении при действии ионов свинца в концентрациях 2 и 5 ДУ (0,98 и 0,40 % соответственно). При действии мышьяка больше всего таких особей обнаружено в концентрациях 4 и 8 ДУ (0,46 и 0,37 % соответственно). При совместном действии этих двух металлов частота аномалии низка: в первом поколении встречается только при 3 ДУ (0,09 %), в третьем - при 2, 7 и 9 ДУ (от 0,10 до 0,14 %). Аналогичная картина наблюдалась при совместном действии мышьяка с кадмием, мышьяка с ртутью и кадмия со свинцом, то есть суммирования эффекта данных ТМ при попарном действии не зафиксировано. Обращает на себя внимание низкая частота особей с пузырчатыми крыльями в вариантах опыта с участием ртути.
Ожидалось, что наибольшее отклонение вызовет влияние четырех металлов одновременно. Аберрантные особи обнаружены при 1, 2, 5-8 и 10 ДУ. Однако частоты аномальных мушек оказались не выше, чем в других вариантах эксперимента: максимальное значение (0,29 %) зафиксировано при действии 4 ТМ в течение двух поколений.
Анализ данных эксперимента свидетельствует об отсутствии связи между концентрацией ТМ в среде и частотой особей с пузырчатыми крыльями: даже при десятикратном превышении допустимого уровня содержания металла в большинстве случаев такие особи не обнаружены. Кроме того, не выявлена зависимость частоты аберрантных мух от воздействия одной и той же дозы ТМ в трех поколениях. Это объясняется тем, что если через половые клетки родительских организмов и передаются ТМ следующему поколению, то в очень незначительных количествах.
В литературе описаны как рецессивные, так и доминантные мутации, вызывающие вздутие крыльев (Bridges СВ., Morgan Т.Н., 1919; Lindsley D.L., Grell Е.Н., 1968). Для установления природы аномалии были проведены скрещивания аберрантных особей друг с другом и с диким типом. Анализ потомства проводился в четырех поколениях. Его результаты показали, что большинство выделенных терат не являются мутациями, о чем косвенно свидетельствует довольно высокая частота встречаемости особей с такими крыльями.
Лишь в двух случаях попарного скрещивания особей во втором поколении наряду с нормальными были обнаружены особи обоих полов с пузырями на крыльях. Эти результаты свидетельствуют о том, что обнаруженные в ходе эксперимента аномальные мушки были мутантными по разным ауто-сомно-рецессивным генам.
Помимо аномалий крыльев, вызванных нарушением циркуляции гемолимфы под влиянием солей мышьяка, кадмия, ртути и свинца, были обнаружены дрозофилы с измененными размерами крыльев. Так, в вариантах эксперимента с использованием смесей As +Cd (2, 3 ДУ в F2) и Cd +Hg +Pb (7ДУ в F3) выявлено 12 самцов с укороченными крыльями. При скрещивании особей Fi друг с другом наряду с нормальными по фенотипу мушками были обнаружены самцы с короткими крыльями. В возвратном скрещивании самок Fi с исходными самцами выделены особи как мужского, так и женского пола с короткими крыльями. Данный признак оказался константным. Результаты скрещиваний (табл. 6) свидетельствуют о рецессивной природе и сцепленности полученной мутации с Х-хромосомой.
Наблюдение за общей продолжительностью жизненного цикла и отдельных его стадий показало удлинение сроков развития по сравнению с контролем. Стадия яйцо— личинка в потомстве короткокрылых длилась от 3 до 7 суток, в потомстве, где один родитель дикого типа, - 3-6 дней, в контроле - двое суток. В то время как процесс окукливания мушек дикого типа продолжался четыре дня, первые куколки у мутантов обнаруживались на 5-8 сутки с момента появления первых личинок. В случае, когда один из родителей был взят из дикого типа, окукливание начиналось на 3-7 сутки. Длительность стадии куколки в контроле и в случаях, когда один из родителей был нормальным, составила в среднем 5 суток. Вылет первых имаго в потомстве мутантных особей по сравнению с контролем запаздывал в среднем на двое суток.
Вследствие удлинения отдельных фаз жизненного цикла затягивался и весь процесс развития от яйца до имаго, который в отдельных случаях составлял 19 дней, что превышало общую продолжительность жизненного цикла особей дикого типа на 8 суток. Когда же один из родителей был нормальным, от закладки эксперимента до появления первых имаго проходило 12-15 дней.
