Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. ПАТОГЕНЕТРІЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИСТИННОЙ ПУЗЫРЧАТКИ. 11
Общая характеристика пузырчатки 11
Роль аутоантител в патогенезе пузырчатки 12
І.З.Мишени аутоантител при пузырчатке 13
Структура молекулы ДСГЗ 15
Гомология между ДСГЗ и другими членами семейства кадгеринов... 16
Механизмы возникновения пузырчатки 17
Механизмы действия аутоантител при пузырчатке 19
Участие системы комплимента в процессе акантолиза 20
Клонирование гена dsg3 22
Определение патогенных эпитопов ДСГЗ 22
Изучение Т-клеточного ответа на ДСГЗ 25
Гетерогенность антительного ответа при ВП 26
1.13 Связь между МНС гаплотипом и предрасположенностью к
заболеванию ВП 29
Возможное участие аутоантигенов, не относящихся к десмоглеинам в патогенезе ВП 31
Методы лечения пузырчатки 33
Анти-ДСП и ДСГЗ антитела у больных разными формами пемфигуса 40
Роль апоптоза в акантолизе 41
Модели пузырчатки на животных 42
Диагностика пузырчатки 43
Роль цитокинов в развитии акантолиза при пемфигусе 45
1.21. Перспективные направления исследований 47
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 49
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 75
5
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЖОВ НА ОСНОВЕ
ДЕСМОГЛЕИНА 3 ЧЕЛОВЕКА 75
Клонирование фрагментов гена dsg3 75
Получение рекомбинантных белков Д1-2 и Д1-5 78
ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ПАТОГЕННОСТИ АНТИТЕЛ К БЕЛКАМ Д1-2 И
Д1-5 В МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ IN VITRO 79
4.1. Получение кроличьих антител на рекомбинантные белки Д1-2 и
Д1-5 79
Анализ патогенности IgG различной специфичности 80
Оценка специфичности протективного действия антител к Д1-5, выделенных аффинной хроматографией 85
Оценка протективного действия антиидиотипических антител из сыворотки здоровых доноров 88
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ АКТИВАЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ В ПАТОГЕНЕЗЕ
ПУЗЫРЧАТКИ В МОДЕЛИ НА ЖИВОТНЫХ IN VIVO 90
Наличие антител к ДСГЗ не приводит к формированию заболевания у мышей 90
Изучение роли активации эндотелия в патогенезе пузырчатки на мышах in vivo 93
Изучение роли активации эндотелия в патогенезе пузырчатки на кроликах in vivo 98
ОБСУЖДЕНИЕ 99
ВЫВОДЫ 106
БЛАГОДАРНОСТИ 107
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ: 108
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Вульгарная пузырчатка или pemphigus vulgaris - достаточно редкое, но тяжелое аутоиммунное заболевание, при котором наблюдается формирование пузырей в эпидермисе и на слизистых оболочках. В зависимости от распознаваемых аутоантигенов и их локализации в эпидермисе и других тканях заболевание имеет различные клинические проявления, поэтому выделяют несколько форм пузырчатки. Наиболее распространены и лучше других изучены две формы пузырчатки: вульгарная пузырчатка (ВП) и листовидная пузырчатка (ЛП) (Lever, 1965). Частота встречаемости ВП составляет 0,1-0,5 на 100000 населения. Среди еврейской популяции частота встречаемости пузырчатки значительно выше. В некоторых областях Бразилии эндемичная форма листовидной пузырчатки Fogo solvagem (FS) выявляется у 3,4% населения (Ahmed et al., 1990).
Аутоантигенами при пузырчатке являются белки десмосом: десмоглеины (ДСГ). Связывание аутоантител с белками-мишенями приводит к нарушению межклеточной адгезии (акантолизу). В результате на коже и на слизистых образуются многочисленные эрозийные бляшки или пузыри, вследствие чего данное заболевание получило название пузырчатки. Заболевание осложняется тем, что образующиеся пузыри часто инфицируются и это служит причиной сопутствующих инфекций. В настоящее время основным способом лечения пузырчатки является применение кортикостероидных препаратов, которые обладают множеством побочных эффектов. До появления кортикостероидных препаратов пузырчатка часто заканчивалась летальным исходом.
Показано, что доминирующим классом аутоантител при пузырчатке являются антитела IgG класса, преимущественно IgG4 субкласса; реже аутоантитела классов IgA и IgM. Причина, почему именно антитела IgG4
7 субкласса являются наиболее патогенными, остается неизвестной. Как правило, титр аутоантител в сыворотке больных пемфигусом коррелирует с тяжестью заболевания.
При наиболее распространенной форме пузырчатки - вульгарной (ВП), аутоантитела направлены к десмоглеину З (ДСГЗ) почти у 100% больных и к десмоглеину 1 (ДСП) - примерно у 50%) больных (Stanley JR, 1984). При листовидной пузырчатке (ЛП) - у всех больных выявляют антитела к ДСП и редко - к ДСГЗ (Amagai М, 1999). Характер повреждения кожи - акантолиз, различается при этих формах: при ВП наблюдается формирование пузырей в супрабазальном слое кожи и, в основном, на слизистых оболочках. При ЛП пузыри формируются в поверхностных слоях эпидермиса кожи, что вызывает отслаивание ороговевающих слоев, откуда и возникло название - листовидная пузырчатка. При ЛП слизистые оболочки не повреждаются. Показано, что присоединение акантолитического процесса на коже при ВП связано с появлением антител к ДСП (Fitzpatrick et al., 1980).
Мишенью аутоантител при вульгарной пузырчатке является поверхностный гликопротеин с молекулярной массой 130 кД. Это трансмембранный белок, который локализуется на поверхности кератиноцитов в области десмосом. В настоящее время ген десмоглеина 3 клонирован и полностью охарактеризован. Определена аминокислотная последовательность белка десмоглеина 3 (ДСГЗ). Получены рекомбинантные белки, содержащие различные участки молекулы десмоглеина 3 в различных экспрессионных системах: бактериальной, дрожжевой и бакуловирусной.
Группой Amagai М. на основе рекомбинантного десмоглеина 3, полученного в бакуловирусной экспрессионной системе, создана тест-система для диагностики пемфигуса.
В ряде работ показано, что основными иммунопатогенными участками молекулы десмоглеина 3 являются дистальные домены молекулы: ЕС1-ЕС2.
В последнее время накапливаются данные, свидетельствующие о том, что развитие пемфигуса может быть связано с выработкой аутоантител не только к десмоглеину 3, но и к целому ряду других адгезионных и неадгезионных молекул: десмоколлинам, плакоглобину, коллагену, аннексинам, ацетилхолино-вому рецептору.
Хотя достоверно показана роль аутоантител в развитии пемфигуса, истинная этиологическая причина, по-прежнему, остается неясной. Показано, что определенную роль в развитии данного заболевания играют наследственные факторы, поскольку частота встречаемости пемфигуса коррелирует с частотой некоторых аллелей главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) II класса. Кроме того, известны случаи, когда развитие пузырчатки было спровоцировано приемом лекарственных препаратов, вакцинацией, укусами насекомых, инфекциями. Эти факты указывают на роль активации врожденной системы иммунитета и активации эндотелия в патогенезе пузырчатки.
Данная работа посвящена изучению роли активации эндотелия в патогенезе пузырчатки, а также изучению перспективности создания вакцин для лечения пузырчатки на основе индукции конкурирующих IgGl к непатогенным участкам молекулы десмоглеина 3. Кроме того, нами была разработана модель пузырчатки на конвенционных мышах и на кроликах, что позволяет изучать эффективность различных препаратов и методов лечения пузырчатки на этих моделях. Актуальность представленной работы заключается в том, что она содержит новые фундаментальные данные, касающиеся роли активации эндотелиального барьера в патогенезе пемфигуса; кроме того, она важна в прикладном аспекте, поскольку полученные данные о протективном действии антител к непатогенным доменам десмоглеина 3 могли бы лечь в основу создания новых вакцин против пемфигуса.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Целью данной работы является изучение патогенности аутоантител к разным доменам десмоглеина 3 в модели пузырчатки на животных.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
В рамках данной работы нами были поставлены следующие задачи:
Клонировать и экспрессировать участки гена десмоглеина 3, кодирующие внеклеточную часть молекулы и ее первые два домена, в E.coli.
Получить и охарактеризовать рекомбинантные белки Д1-5 и Д1-2, соответствующие внеклеточной части молекулы десмоглеина 3 и ее первым двум доменам, соответственно.
Разработать модель пузырчатки in vivo на мышах и кроликах.
Оценить патогенность аутоантител к Д1-2 и Д1-5 in vitro и in vivo.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые в России было осуществлено клонирование генных фрагментов десмоглеина 3, кодирующих внеклеточную часть молекулы и ее первые два домена.
В экспрессионной системе E.coli были получены рекомбинантные белки Д1-2 и Д1-5, содержащие первые два и все пять внеклеточных доменов молекулы десмоглеина 3.
Были получены кроличьи антитела к рекомбинантным белкам Д1-2 и Д1-5 и исследована их акантолитическая способность при инкубации с эксплантатами кожи неонатальных мышей.
Впервые было показано, что в патогенезе пузырчатки одну из ведущих ролей играет активация клеток эндотелия, что обеспечивает доступ аутоантител в эпидермис.
Впервые была разработана модель пузырчатки in vivo на конвенционных мышах, а также на кроликах.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ
Нами продемонстрировано антиакантолизное, протективное действие антител, направленных к непатогенным доменам молекулы ДСГЗ. Протективное действие антител к доменам 3-5 молекулы ДСГЗ может лечь в основу создания вакцины на основе соответствующего рекомбинантного белка.
Впервые разработана модель пузырчатки in vivo на конвенционных мышах, а также на кроликах, что позволит проводить тестирование новых фармакологических препаратов для лечения пузырчатки.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Отдела иммунологии ИБХ РАН, на пятой международной иммунологической летней школе им Дж.Хэмфри (Пущино, 2000), на VIII всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2001), на XXII Конгрессе Европейской Академии аллергологии и клинической иммунологии (Париж, 2003).
ПУБЛИКАЦИИ
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ: в «Вестнике дерматологии и венерологии», в материалах российских и зарубежных научно-практических конференций и съездов, из них 5 - в центральной печати.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы. Работа изложена на 121 странице машинописного текста, содержит 16 рисунков, 9 таблиц. Список литературы включает 143 источника, из которых 138 иностранные.
