Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Возможности диагностики и лечения заболеваний шейки матки, ассоциированных с вирусом папилломы человека. (Обзор литературы) 12
1.1. Исторические аспекты 12
1.2. Строение вируса папилломы человека 13
1.3. Патогенез папилломавирусной инфекции 15
1.4. Диагностика цервикальнои интраэпителиальнои неоплазии (CIN) 16
1.4.1. Кольпоскопическое исследование 17
1.4.2. Цитологическое исследование 19
1.4.3. Тесты для определения ДНКВПЧ 20
1.4.4. Молекулярные маркеры клеточной пролиферации 24
1.5. Лечение и профилактика интраэпителиальных поражений шейки матки 30
Глава 2. Материал и методы исследования. Клиническая характеристика исследуемых групп 43
2.1. Характеристика исследуемых групп 43
2.2. Методы обследования 44
2.2.1. Общеклиническое обследование 44
2.2.2. Расширенная кольпоскопия 44
2.2.3. Бактериоскопическое и бактериологическое исследования 47
2.2.4 Цитологическое исследование 47
2.2.5. Гистологическое исследования биоптата шейки матки 49
2.2.6. Иммунологические исследования 52
2.2.6.1. Иммуноцитохимическое исследование 52
2.2.6.2. Иммуногистохимическое исследование 54
2.2.6.3. Метод двойной генной ловушки 55
2.3. Методы лечения 57
2.4. Методы статистической обработки 58
Глава 3. Результаты собственных исследований 59
3.1. Данные анамнеза 59
3.2. Результаты специальных методов исследования женщин с ПВИ гениталий 66
3.3. Лечение и проспективное наблюдение ВПЧ-ВР позитивных женщин с LSIL 73
3.3.1. Клинические данные 74
3.3.2. Данные иммуногистохимического и иммуноцитохимического исследований 79
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 83
Выводы 94
Практические рекомендации 96
Список литературы 98
- Диагностика цервикальнои интраэпителиальнои неоплазии (CIN)
- Лечение и профилактика интраэпителиальных поражений шейки матки
- Гистологическое исследования биоптата шейки матки
- Данные иммуногистохимического и иммуноцитохимического исследований
Введение к работе
Актуальность проблемы
Среди заболеваний, передающихся половым путем, особое значение имеет папилломавирусная инфекция (ПВИ) гениталий, возбудителем которой является вирус папилломы человека (ВПЧ). Это связано с высокой частотой распространения инфекции и ее онкогенным потенциалом (Bosch, 2011). В целом, по оценкам ученых, около 85% женщин в течение жизни имеют риск заражения ПВИ (Мошопео J, 2008).
Вероятность трансформации поражений, индуцированных высокоонкогенными типами ВПЧ в CIN (цервикальную интраэпителиальную неоплазию) и рак шейки матки (РШМ), а также отсутствие в практике врача надежных прогностических маркеров обусловливают необходимость дальнейших исследований роли и качества диагностических тестов в скрининговых программах и клинической практике (zur Hausen, 2009). Имеется ряд проблем с внедрением новых классификаций, что отражается на преемственности ведения пациенток с ПВИ, не определена оптимальная прогностическая эффективность молекулярных маркеров, среди которых перспективны СОХ 2 и p16INK4a, имеются противоречия в тактике ведения женщин с плоскоклеточными поражениями шейки матки низкой степени (LSIL).
Применение метода, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью, в практике лабораторного обследования позволит наиболее адекватно определить тактику ведения пациентов, оценить прогноз заболевания и длительность терапии. НСS II (система двойной генной ловушки - Digene-тест) - достаточно валидированный метод выявления высокоонкогенных типов ВПЧ, широко использующийся в мире в исследованиях и скрининговых программах, однако ввиду недостаточной специфичности его применение ограничено.
Известно, что при наличии в тканях высокоонкогенных типов ВПЧ онкогены Е6 и Е7 вируса инактивируют в клетках эпителия
противоопухолевые протеины р53 и pRb (Fujii T., Tsukazaki K., 2006). Протеин p16INK4a - один из ингибиторов циклинзависимых киназ, предотвращающий фосфорилирование рЯЬ (Serrano M., Hannon Gj., 2006) активно изучается в последние годы.
Выявлена взаимосвязь уровня маркера СОХ 2 с воспалительным процессом в шейке матки, что предположительно отражает степень инфицирования ВПЧ высокого риска (ВПЧ-ВР) (Greenberg M.D., 1999). Предлагается использовать СОХ 2 в качестве биомаркера на ранней стадии развития неопластических процессов шейки матки и при выявлении его повышенного уровня своевременно проводить необходимую терапию (Powell M.A., 2003).
Сформировавшиеся в последние годы тенденции в лечении ПВИ недостаточно эффективны. В экспериментах показано, что специфическое соединение индол-3-карбинол, содержащееся в крестоцветных, способно предупреждать или останавливать процессы канцерогенеза за счет индукции апоптоза. Однако убедительные данные о его эффективности в комплексной терапии отсутствуют (Киселёв В.И. и др., 2007; Аполихина И.А., 2008; Rahman K.M., et al 2008).
Терапия иммунопрепаратами малоэффективна, что связывают с уровнем онкобелка Е7, который нейтрализует их противовирусную и противоопухолевую активность за счёт способности избирательно блокировать большинство генов, индуцируемых интерфероном (Nees M, et al, 2008). Поскольку экспериментально доказана способность индол-3- карбинола избирательно ингибировать синтез Е7 в эпителиальных клетках, инфицированных ВПЧ (Киселёв В.И. и соавт., 2003), включение его в комплекс терапии может повысить ее эффективность.
Имеется ряд работ о положительных результатах комплексного
применения в схемах лечения отечественного иммуномодулятора
Полиоксидония, в основе механизма которого лежит прямое воздействие на
фагоцитирующие клетки и естественные киллеры, а также стимуляция
антителообразования (Перламутров Ю.Н., 2010; Пинегин Б.В., 2008), что делает обоснованным исследование эффективности совместного применения и-3-к и Полиоксидония.
Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности изучения проблемы вирус-индуцированных заболеваний шейки матки, необходимости разработки более эффективных методов диагностики и комплексной терапии, направленных на ускорение процессов регенерации эпителия шейки матки и профилактики РШМ.
Цель исследования
Совершенствование тактики ведения женщин с ВПЧ- ассоциированными поражениями гениталий низкой степени тяжести за счёт оценки эффективности метода HCS II, прогностической значимости маркеров пролиферации СОХ 2 и p16INK4a, а также изучения терапевтической эффективности иммуномодулятора Полиоксидоний и фармакологического средства индол-3-карбинол.
Основные задачи исследования
1. Определить структуру ВПЧ-ассоциированных заболеваний среди ВПЧ- инфицированных женщин и выявить корреляции с наличием высокоонкогенных типов ВПЧ на основании метода HCS II.
Оценить значимость кольпоскопических, цитологических и гистологических признаков, а также маркеров СОХ 2 и p16INK4a при ВПЧ- ассоциированной патологии шейки матки в соответствии с классификацией Бетесда.
Изучить возможность регрессии цервикальных ВПЧ-ассоциированных поражений низкой степени тяжести шейки матки в течение 1 года наблюдения без терапии и на фоне лечения фармакологическим средством на основе индол-3-карбинола и иммуномодулятором Полиоксидоний.
Изучить влияние индол-3-карбинола и Полиоксидония на процессы индукции апоптоза путем оценки уровня экспрессии молекулярных маркеров p16INK4a и СОХ 2.
Разработать алгоритм ведения ВПЧ-ВР позитивных женщин с LSIL.
Научная новизна
В результате проведённых исследований показана прогностическая значимость маркеров пролиферации СОХ 2 и p16INK4a в прогрессии LSIL и определена эффективность их применения в качестве триажа ВПЧ- ассоциированных поражений. Определена клиническая значимость ВПЧ- теста с вирусной нагрузкой (HCS II) в оптимизации тактики ведения пациентов с ПВИ, а также в качестве скринингового метода.
На основании клинического, молекулярно-биологического, кольпоскопического, цитологического, гистологического,
иммуноцитохимического и иммуногистохимического методов исследования оценена эффективность применения иммуномодулятора Полиоксидоний и фармакологического средства индол-3-карбинол у женщин с LSIL; разработана терапевтическая схема их применения.
Практическая значимость
В результате проведенной работы определены группы риска по выявлению плоскоклеточных интраэпителиальных поражений низкой степени и наиболее специфичные для LSIL кольпоскопические и морфологические признаки в соответствии с классификацией Бетесда. Повышена эффективность диагностики патологии ШМ за счет внедрения ВПЧ-теста с определением уровня вирусной нагрузки (HCS II) и исследования экспрессии маркеров пролиферации p16INK4a и СОХ 2. Разработан алгоритм ведения ВПЧ-ВР позитивных женщин с применением иммуномодулятора Полиоксидоний и фармакологического средства индол- 3-карбинол.
Основные положения, выносимые на защиту
Сходные кольпоскопические и цитологические характеристики понятий «плоская кондилома» и CIN I [ацетобелый эпителий (АБЭ), атипические сосуды, койлоцитоз и дискариоз легкой степени] обусловливают целесообразность объединения их в группу интраэпителиальных неоплазий низкой степени (LSIL). У ВПЧ-ВР позитивных женщин с высокой вирусной нагрузкой (по данным HCS II) морфологические признаки LSIL выявляются в 59% случаев, HSIL - в 3,7%, и только у 39,3% женщин клинические проявления не обнаруживаются (латентная форма), что позволяет считать ВПЧ-тест важным скрининговым тестом.
Высокий уровень экспрессии онкомаркера p16INK4a у обследуемых женщин в начале исследования коррелирует с высокой частотой прогрессирования LSIL в HSIL при наблюдении через 1 год. В соответствии с международными подходами данный маркер может быть рекомендован в практику в качестве триажа. Повышенный уровень СОХ 2 коррелирует с наличием признаков воспалительного процесса по результатам цитологического исследования.
Комбинированный способ терапии с использованием иммуномодулятора Полиоксидоний и фармакологического средства на основе индол-3- карбинола приводит к регрессу LSIL в 56,2% случаев, что статистически значимо по сравнению с группой контроля (28%). Данная комбинация может быть рекомендована в качестве компонента тактического ведения женщин с LSIL, позволяющего снизить количество деструктивных методов лечения, а также сохранить репродуктивную функцию женщин.
Внедрение результатов работы в практику
Результаты исследования и основные рекомендации используются в работе научно-поликлинического отделения ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России. Результаты исследования включены в материалы курсов по тематическому усовершенствованию врачей, а также в педагогический процесс для врачей интернов и ординаторов на кафедре акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии ФППОВ Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.
По результатам работы опубликовано пять печатных работ.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на 25-й ежегодной конференции по папилломавирусу в Мальмо (Швеция, 2009), посредством постерной презентации на конкурсе молодых ученых, посвященном памяти В.И. Кулакова и обсуждены на апробационной комиссии Первого МГМУ им И.М. Сеченова 13 ноября 2010 г.
Структура и объем диссертации
Диагностика цервикальнои интраэпителиальнои неоплазии (CIN)
Впервые предположение о возможном участии ВПЧ в патогенезе РШМ высказал Harald Zur Hauzen в 1974 - 1976 гг. [24,110]. Обширные эпидемиологические наблюдения, проведенные в 22 регионах мира, подтвердили, что ВПЧ высокого онкогенного риска является первым и наиболее значимым фактором возникновения РШМ. Ведущая роль в канцерогенном процессе принадлежит вирусным белкам Е1, Е2, Е6 и Е7 [20]. Инициирующим фактором выступают мутации в различных участках гена Е1, который в норме отвечает за эписомальный статус ДНК ВПЧ. В результате его повреждения происходит интеграция генома ВПЧ в хромосомы клетки хозяина. Процесс встраивания вирусного генома сопровождается иннактивацией еще одного «раннего» гена — Е2. В результате потери функциональной активности гена Е2 увеличивается экспрессия генов Е6 и Е7, которые непосредственно запускают процессы опухолевой трансформации. Онкогенные свойства Е6 и Е7 обусловлены их способностью образовывать комплексы с негативными регуляторами клеточного роста - белками р53 (для Е6) и pRb (для Е7). Р 53 и Р Rb отвечают в норме за дифференцировку и рост клеток, которые в результате мутации или повреждения превращаются в онкогены, вызывающие бесконтрольную пролиферацию. Белки Е6 и Е7, взаимодействуя с белками р53 и pRb, вызывают их деградацию. Это приводит к предотвращению апоптоза, подавлению выработки интерферона, удлинению продолжительности жизни клеток за счет активации теломеразы, усилению клеточной пролиферации, нарушению защитных регуляторных механизмов, обеспечивающих репарацию ДНК, что способствует дестабилизации генома, индуцирует хромосомные мутации и абберации генов хозяина и является эндогенным фактором опухолевой прогрессии [24, 40]. Об активной экспрессии вирусного онкогена Е7 свидетельствует выраженная гиперэкспрессия ингибитора циклинзависимой киназы pl6INK4a — биомаркера, который регулярно наблюдается в злокачественных поражениях, вызванных ВПЧ [68].
Использование биомаркеров пролиферации может помочь снизить частоту ложноположительных и ложноотрицательных результатов традиционных методов диагностики РШМ [60].
Длительное время интеграция вирусной ДНК рассматривалась как необходимое условие прогрессии цервикальной дисплазии в РШМ. Однако эписомальная вирусная ДНК также выявляется в значительном проценте случаев РШМ (до 40%) [24]. Ряд авторов [86] продемонстрировали связь между ВПЧ-инфицированием и повышенным образованием в клетках генитального тракта 16-альфа-гидроксиэстрона, который является фактором риска канцерогенеза в ряде эстрогензависимых тканей.
В некоторых странах, в том числе и в развивающихся, выявлена зависимость заболеваемости РШМ от уровня образования и дохода [94, 62]. Кроме различий в уровне социально-экономического развития, на заболеваемость РШМ влияют и иные факторы, например модели сексуального поведения и эффективность местных скрининговых программ [54]. Некоторые из факторов риска РШМ хорошо известны, другие, а именно ВПЧ и различия в распространенности тех или иных типов, недостаточно исследованы и требуют дальнейшего изучения. 1.4. Диагностика цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN)
В настоящее время диагностика папилломавирусных поражений шейки матки проводится с использованием скрининговых и специализированных диагностических методов, что позволяет идентифицировать ВПЧ у женщин с визуально не измененной шейкой матки.
Современный алгоритм диагностики включает в себя расширенную кольпоскопию, цитологическое исследование шейки матки, гистологическое исследование прицельно взятых биоптатов с выявлением характерных морфологических маркеров, проведение молекулярно-биологических методов исследования (выявление и типирование вируса методом ПЦР, ДНК-гибридизация in situ, обратный блоттинг, дот-слот-гибридизация, Hybrid Capture-метод на основе гибридизации в растворе) [2]. 1.4.1. Кольпоскопическое исследование
Для диагностики эпителиальных изменений шейки матки в 1925 г. Н. Hinselman предложил использовать кольпоскопию. Среди методик кольпоскопии различают: - простую кольпоскопию: осмотр шейки матки при стандартном увеличении без использования медикаментозных средств; - расширенную кольпоскопию, которая проводится с использованием эпителиальных и сосудистых тестов. Чаще всего используются пробы с 3%-м раствором уксусной кислоты и 2%-м раствором Люголя (проба Шиллера). Уксусная кислота (3% -й раствор) растворяет цервикальную слизь; за счет кратковременного отека эпителия происходит изменение цвета цилиндрического эпителия: он бледнеет из-за малой толщины и близости сосудов. Многослойный плоский эпителий (МПЭ), именно ввиду его многослойности, практически не изменяет цвета. Атипически измененный МПЭ бледнеет, однако варикозно расширенные дистальные отделы атипических сосудов не спазмируются, поэтому атипические сосуды четко видны на пробе с 3%-м раствором уксусной кислоты [12].
Проба Шиллера основана на способности зрелых клеток МПЭ накапливать гликоген, который при взаимодействии с 2%-м раствором Люголя приобретает темно-коричневую окраску. Цилиндрический эпителий (ЦЭ), метапластический эпителий на зоне трансформации за счет своей однослойности и отсутствия в клетках гликогена окрашиваются в красновато-желтый цвет. В измененных участках МПЭ, когда слой зрелых поверхностных клеток замещается клетками, не накапливающими гликоген базального и парабазального слоев, а также метапластически измененными клетками промежуточного слоя (пара- и гиперкератоз), при замещении всего МПЭ клетками ороговевающего эпителия (лейкоплакия) имеет место отсутствие окрашивания МПЭ в темно-коричневый цвет [5, 31].
Для проведения скрининговых программ наряду с цитологическим исследованием предлагается метод расширенной кольпоскопии, однако, при этом высок риск гипердиагностики и, следовательно, проведение необоснованного агрессивного лечения [81].
Кольпоскопические признаки нормальной зоны трансформации хорошо известны. При метапластическом процессе кольпоскопистом определяются тонкие белые участки вокруг железистой ткани. Созревание метаплазированного участка происходит довольно быстро, что позволяет легко провести его кольпоскопическую идентификацию. Метапластическая ткань прогрессивно теряет белую реакцию при обработке шейки матки уксусной кислотой и становится йодпозитивной при обработке раствором Люголя. В некоторых случаях созревание метаплазированного участка не такое быстрое, как это описано выше. В этом случае большие участки и даже вся метапластическая ткань остаются незрелыми достаточно долго, что представляет затруднения для цитолога или кольпоскописта [88].
Лечение и профилактика интраэпителиальных поражений шейки матки
Целесообразность всестороннего изучения ВПЧ-инфекции в аспекте возможностей профилактики и лечения РШМ впервые была рассмотрена на конференции, организованной Международным агентством по исследованию рака (IARC) 12-14 декабря 1994 г. Сформировавшиеся в последние годы тенденции в лечении ПВИ недостаточно эффективны, порой агрессивны, нередко приводят к отдаленным осложнениям.
Ввиду недостаточной эффективности консервативной монотерапии в широкой практике предпочтение отдается хирургическим методам лечения. До сих пор в некоторых регионах России широко используются диатермокоагуляция, диатермоконизация. Частота рецидивов ПВИ после лечения достигает, по данным различных источников, от 37 до 55% [13]. Из-за высокой травматичности следует считать диатермокоагуляцию и диатермоконизацию мало приемлемыми для лечения ПВИ шейки матки, особенно у женщин раннего репродуктивного возраста, не реализовавших свою генеративную функцию [13].
Широкое распространение на практике получила криотерапия. В России используется метод криодеструкции с помощью гинекологического малогабаритного азотного криоаппликатора жидким азотом (—196 С). Однако незначительная глубина воздействия, невозможность локального удаления патологического очага без повреждения окружающих тканей, невозможность обработки сводов влагалища при распространенных ВПЧ-ассоциированных поражениях, высокая частота рецидивов заболевания (до 20%) не позволяют признать достаточно высокую эффективность метода при лечении ПВИ, хотя по данным литературы показатели излеченности колеблются от 63 до 90% [46].
В настоящее время при лечении ВПЧ-ассоциированных поражений шейки матки широкое применение нашла С02-лазерная вапоризация, посредством которой производится радикальное и щадящее удаление пораженных тканей. Деструкция тканей лазерным излучением сопровождается минимальным некрозом тканей с последующим быстрым заживлением ран, что сокращает длительность лечения и уменьшает вероятность рецидивов по сравнению с электрохирургией и криодеструкцией шейки матки. С02-лазерная вапоризация имеет значительное преимущество перед другими методами, так как позволяет производить деструкцию измененных участков эпителия под контролем кольпоскопа, контролируя глубину и площадь проводимой операции [10]. Несмотря на признание в настоящее время С02-лазерной вапоризации эффективным методом лечения ВПЧ, она, по сути своей, является лечением симптоматическим, поскольку не воздействует на этиологический фактор и на звенья патогенеза заболевания.
Под профилактикой онкологического процесса понимают использование синтетических или натуральных фармакологических агентов, способных замедлить скорость развития опухолевого процесса, обратить его или полностью подавить [106]. При этом если раньше данное понятие означало воздействие лекарственных препаратов на ранние этапы развития опухоли, то в настоящее время, по мнению ряда авторов, оно включает в себя предотвращение, супрессию и (или) регрессию как ранних, так и поздних (метастатических) стадий канцерогенеза [79].
Предполагается, что препараты, назначаемые с целью профилактики, должны ингибировать диспластические и гиперпластические процессы в тканях-мишенях и препятствовать, а в идеале — полностью предотвращать их переход в рак. Кроме того, такие препараты, как правило, предполагают очень длительные курсы приема. А это возлагает определенные требования на сами профилактические средства и в первую очередь на отсутствие у них токсичности. В связи с этим все больший интерес специалистов начинают привлекать препараты на основе веществ природного происхождения. К настоящему моменту известна довольно обширная (около 40) группа природных соединений, блокирующих развитие гипер- и неопластических процессов в эпителиальных тканях, высокая эффективность которых доказана в экспериментальных и клинических исследованиях. Показано, что такие вещества, будучи нетоксичными, а, следовательно, безопасными для здоровых органов и тканей, обладают множественной противоопухолевой активностью, т.е. воздействуют одновременно на несколько ключевых звеньев процесса канцерогенеза. Одним из таких соединений является индол-3-карбинол. Основное действие данного вещества обусловлено его способностью блокировать молекулярные механизмы, приводящие к патологической пролиферации, опухолевому неоангиогенезу и повышению инвазивной активности трансформируемых клеток [3]. К настоящему моменту идентифицировано большое число биологически активных молекулярных мишеней, ингибируемых инд ол-3-карбинолом и опосредующих все основные патогенетические звенья злокачественного роста. При этом важно, что все описанные выше противоопухолевые активности индол-3-карбинола проявляются независимо от гормонального статуса клеток-мишеней [44]. Необходимо отметить, что подходы к лечению диспластических процессов шейки матки стали меняться с появлением вирусной концепции цервикального канцерогенеза. В результате, основное внимание врачей начала привлекать этиопатогенетическая терапия, проводимая по двум направлениям: 1) воздействие на этиологический фактор — ВПЧ и 2) блокирование ключевых механизмов канцерогенеза [74].
Однако, несмотря на значительный прогресс, достигнутый в данной области, приходится признать, что лекарственных средств, напрямую воздействующих на вирус папилломы человека, до сих не существует. Чаще всего для лечения ПВИ используются препараты интерферона (ИФН) или его индукторов. При этом в большинстве случаев даже длительная ИФН-терапия не приводит к стойкому клиническому эффекту. Как отмечалось выше, невосприимчивость к действию интерферона ВПЧ-инфицированньгх цервикальных клеток объясняется повышенным уровнем экспрессии ими онкобелка Е7, инактивирующего интерферонзависимую защитную систему посредством ингибирования активности опухоль-супрессорного транскрипционного регуляторного фактора IRF-1. Данный фактор отвечает за транскрипцию генов, кодирующих синтез противовирусных белков [91].
Гистологическое исследования биоптата шейки матки
Иммуноцитохимические реакции проводились на цитологических мазках, помещенных на стекла, обработанные BIO-FIX спреем. От каждой пациентки материал из эндо- и экзоцервикса распределялся на четыре стекла. По одному препарату из эндо- и экзоцервикса от каждого случая окрашивали по методу Папаниколау, остальные шесть обрабатывались по методу иммуноцитохимии (ИЦХ). Стекла обрабатывались в двух 95%-х спиртах по 5 минут, а затем подвергались инкубации в цитратном буфере (рН 6,0) на водяной бане Bio-Optika при температуре 90 С в течение 10 минут. Далее стекла остывали 20 минут при комнатной температуре. Остывшие стекла помещали во влажные камеры (для предотвращения высыхания срезов) и инкубировали 15 минут с 3%-м раствором Н202. После обработки перекисью стекла ополаскивали в фосфатном буфере (рН 7,0 — 7,6). Далее стекла инкубировали с 1%-м раствором альбумина во влажных камерах в течение 30 минут. Каждое стекло предварительно делилось жирным маркером на 2 части. По окончании инкубации излишки альбумина аккуратно стряхивали со стекол и раскапывали первичные антитела. В качестве первичных антител использовались pl6iNK4a (CinteCj ready to use)j cox 2 (Neomarkers, 1:200). Срезы инкубировали с первичными антителами от 30 минут до 1 часа, в зависимости от времени воздействия, предусмотренного в спецификации к антителам от фирмы-производителя. Далее срезы отмывали в фосфатном буфере (рН 7,0 - 7,6) от первичных антител, не связавшихся с эпитопами, и обрабатывали вторичными антителами. Срезы инкубировали со вторичными антителами во влажных камерах в течение 1 часа, затем ополаскивали в фосфатном буфере (рН 7,0 — 7,6). Для метки вторичных антител использовался авидин-биотиновый комплекс (UltraV HRP polymer KIT Lab Vision). Для визуализации места связывания антитела с антигеном использовали метку — фермент, пероксидазу хрена, в присутствии субстрата (перекиси водорода) и колориметрического реактива с 3,3 диаминобензидином (DAB substrate+chromogen Lab Vision). В результате образовывался нерастворимый в органических растворителях конечный продукт реакции, который визуализировался в виде коричневого окрашивания структур клеток. Далее стекла ополаскивали в дистиллированной воде и подкрашивали ядра гематоксилином. Затем стекла проводили по батарее из дистиллированной воды, 70%-го и 80%-го спирта, двух 95%-х спиртов, двух абсолютных спиртов и трех ксилолов. После чего срезы заключали в синтетическую среду, используя покровные стекла. 2.2.6.2. Иммуногистохимическое исследование Иммуногистохимические реакции проводились на депарафинированных срезах толщиной 4 мк, расположенных на стеклах, покрытых APES-слоем (Janice А., 1983). Неокрашенные срезы от каждого случая обрабатывались с помощью стандартного микроволнового метода иммуногистохимии. Демаскировка антигенов для ИГХ проводилась в микроволновой печи. Стекла погружались в цитратный буфер (рН 6,0) и нагревались в микроволновой печи в течение 15 минут при мощности 600 Вт. Далее стекла остывали 20 минут при комнатной температуре. Остывшие стекла помещали во влажные камеры (для предотвращения высыхания срезов) и инкубировали 15 минут с 3%-м раствором LLCb. После обработки перекисью стекла ополаскивали в фосфатном буфере (рН 7,0 — 7,6). Далее стекла инкубировали с 1%-м раствором альбумина во влажных камерах в течение 30 минут. По окончании инкубации излишки альбумина аккуратно стряхивали со стекол и раскапывали первичные антитела. В качестве первичных антител использовались антитела к ріб1 10 (Cintec, ready to use), COX 2 (Neomarkers, 1:200). Срезы инкубировали с первичными антителами от 30 минут до 1 часа, в зависимости от времени воздействия, предусмотренного в спецификации к антителу от фирмы-производителя. Далее срезы отмывали в фосфатном буфере (рН 7,0 — 7,6) от первичных антител, не связавшихся с эпитопами, и обрабатывали вторичными антителами. Срезы инкубировали со вторичными антителами во влажных камерах в течение 1 часа, затем ополаскивали в фосфатном буфере (рН 7,0 — 7,6). Для метки вторичных антител использовался авидин-биотиновый комплекс (UltraV HRP polymer Kit Lab Vision). В качестве вторичных антител для р 1бШК4а использовался kit Cintec. Для визуализации места связывания антитела с антигеном использовали метку — фермент, пероксидазу хрена, в присутствии субстрата (перекиси водорода) и колориметрического реактива с 3,3-диаминобензидином (DAB substrate + chromogen Lab Vision). В результате образовывался нерастворимый в органических растворителях конечный продукт реакции, который визуализировался в виде коричневого окрашивания структур клеток. Далее стекла ополаскивали в дистиллированной воде и подкрашивали ядра гематоксилином. Затем стекла проводили по батарее из дистиллированной воды, 70%-го спирта, 80%-го спирта, двух 95% спиртов, двух абсолютных спиртов и трех ксилолов. После чего срезы заключали в синтетическую среду, используя покровные стекла.
Для иммуногистохимических реакций ставили положительные и отрицательные контроли. В качестве отрицательных контролей брали образцы исследуемых срезов, которые подвергались стандартной процедуре иммуногистохимии, но без добавления первичных антител. Положительные контроли для каждого антитела выбирали в соответствии со спецификациями от фирмы-производителя.
Проводилась полуколичественная и количественная оценка результатов реакций. Результаты иммуногистохимической реакции для СОХ 2 и pl6INK4a оценивались полуколичественным методом по количеству позитивно окрашенных клеток по следующей системе: + до 20% окрашенных клеток; + от 20 до 40%; ++ от 40 до 60%, +++ более 60% окрашенных клеток. - количественный анализ; - компьютерную интерпретацию результатов, что исключает субъективизм в оценке; - воспроизводимость и достоверность результатов; - полный цикл исследований в течение одного рабочего дня; - высокую специфичность. Система двойной генной ловушки использует РНК-ДНК гибридизацию в растворе с последующей «хвостовой» иммунологической реакцией между гибридом РНК пробы — ДНК мишени и специфическими антителами к этому гибриду. Тест обязан своей высокой специфичностью нескольким независимым источникам.
Данные иммуногистохимического и иммуноцитохимического исследований
Рак шейки матки является одним из наиболее распространенных злокачественных заболеваний среди женщин. Развитие РШМ не является стремительным процессом: по данным ВОЗ, переход от момента инфицирования и легкой дисплазии в рак in situ в среднем занимает от 3 до 8 лет, еще 10 — 15 лет проходит до развития микроинвазивного рака. Этиологическая роль в развитии злокачественного поражения шейки матки принадлежит ВПЧ, что связано с легкой передачей ПВИ при половом контакте и возможностью длительной персистенции вируса при отсутствии соответствующей симптоматики. Следовательно, проблема диагностики, лечения и прогноза папилломавирусной инфекции очень актуальна. В связи с этим цель нашего исследования — совершенствование тактики ведения женщин с поражениями нижних отделов гениталий, ассоциированными с вирусом папилломы человека за счёт изучения терапевтической эффективности иммуномодулятора (Полиоксидоний) и фармакологического средства (индол-3-карбинол), а также оценка прогностической значимости маркеров пролиферации СОХ 2 и pl6INK4a. Согласно международным стандартам ведения женщин с LSIL, мы предприняли попытку проспективного наблюдения за пациентками с различными формам ПВИ без лечения и с применением различных консервативных методов терапии.
Было обследовано 563 женщины в возрасте от 18 до 67 лет, обратившихся в научно-поликлиническое отделение НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова с 2008 по 2010 г., у которых в анамнезе за последний год была выявлена патология шейки матки или методом ПЦР обнаружены различные типы ВПЧ. Всем пациенткам было проведено комплексное обследование, включающее кольпоскопический и цитологический методы исследования. Результаты трактовались в соответствии с новой классификационной системой Бетесда. Также было проведено определение степени вирусной нагрузки высокоонкогенными типами ВПЧ при помощи HCS П. По показаниям проводилась биопсия шейки матки с дальнейшим гистологическим исследованием и определение уровня маркеров СОХ 2 и pl6INK4a. Из обратившихся женщин у 225 (40%) была выявлена высокая степень вирусной нагрузки высокоонкогенными типами ВПЧ (ВПЧ-ВР позитивные), из них у 122 (54,2%) - в сочетании с LSIL по данным цитологического либо гистологического исследования. Последние составили опытную (97 женщин) и контрольную (25 женщин) группы для изучения эффективности различных методов диагностики и лечения. Статистически значимых различий по основным критериям между группами выявлено не было.
При оценке возрастного распределения ПВИ самая высокая частота инфицированности была нами отмечена в возрасте до 30 лет — 67,2%. Эти результаты согласуются с данными литературы о том, что пик заболевания приходится на расцвет половой и репродуктивной функции женщины [100].
Одним из факторов, способствующих инфицированию эпителия шейки матки ВПЧ, является наличие в анамнезе инфекций передаваемых половым путем. При анализе наших данных обращает на себя внимание высокая частота заболеваний, передаваемых половым путем, и воспалительных заболеваний органов малого таза у женщин с LSIL. Так, 82 (67,2%) пациентки имели в анамнезе одно или несколько инфекционных заболеваний, таких как кандидоз, бактериальный вагиноз, хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, трихомониаз, что согласуется с данными других авторов [101].
На момент обследования все наблюдаемые нами женщины вели половую жизнь. В связи с необходимостью оценки различных социальных аспектов поведения больных ПВИ, учитывая половой путь передачи этого заболевания, был проведен анализ особенностей полового поведения у изучаемой группы женщин. При анализе результатов выявлено, что начали половую жизнь до 18 лет 68 (55,7%) женщин из 122, включенных в исследование.
С целью оценки сексуальной активности была проанализирована интенсивность половой жизни. Среднее количество половых партнеров ВПЧ-ВР позитивных женщин составило 3,1±0,6. Заслуживает внимание тот факт, что 77 (70 %) женщин имели более одного полового партнера или случайные контакты. Анализ индивидуальных половых предпочтений показал, что орогенитальные контакты в анамнезе занимали ведущее место и встречались у 75 (68,2%) пациенток. В практике анального секса признались 13 (11,8%) женщин. Все пациентки были опрошены на предмет проявления папилломавирусной инфекции в анамнезе у их партнеров либо наличия проявлений в момент обследования. Наличие в прошлом или настоящем каких-либо образований на половых органах или эпизоде лечения подтвердили 18 (16,4%) женщин. Полученные результаты не противоречат данным других авторов [82].
Помимо изучения клинико-социальных особенностей, мы провели сравнительную оценку различных диагностических методов выявления ВПЧ. Для определения наиболее эффективного диагностического подхода нами были применены следующие методы: кольпоскопический, цитологический, метод двойной генной ловушки — Digene Hybrid Capture System II, гистологический, иммуноцитохимический и иммуногистохимический. Кольпоскопия представляется за рубежом дорогостоящим методом исследования, показания к ней рядом авторов четко определяются. В нашей стране традиционно кольпоскопию во многих клиниках производят сразу после общего осмотра, перед бимануальным исследованием, поскольку она позволяет выявить участки атипического эпителия, оценить характер экзофитных ВПЧ-индуцированных поражений, определить целесообразность биопсии или возможность ограничиться только цитологическим мазком.
