Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
Роль тромбофилии в повторных неудачах имплантации в программах ЭКО (обзор литературы) 11
1.1. Возможные причины неудач имплантации в программах ВРТ 11
1.2. Роль состояния эндометрия в имплантации эмбриона 13
1.3. Система гемостаза в программах ЭКО: наследственные и приобретенные
факторы риска развития тромбофилии: 20
1.3.1 .Наследственные факторы риска развития тромбофилии 22
1.3.2.Антифосфолипидный синдром 27
1.4. Применение низкомолекулярных гепаринов в программах ЭКО 29
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 39
2.1. Материалы исследования 39
2.2. Методы исследования 42
2.3. Протокол стимуляции суперовуляции 50
2.4.Статистический анализ 53
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований 54
3.1. Клиническая характеристика пациенток исследуемых групп 54
3.2. Результаты комплексного клинико-лабораторного обследования: 65
3.2.1. Результаты обследования на наследственный полиморфизм генов предрасположенности к тромбофилии 67
3.2.2. Результаты обследования на антифосфолипидный синдром 72
3.3.Характеристика циклов ЭКО в исследуемых группах 74
3.4.0ценка параметров гемостазиограммы в программе ЭКО у пациенток исследуемых групп 76
3.5.Оценка эффективности программ ЭКО у пациенток исследуемых групп 81
3.6. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика эндометрия у пациенток исследуемых групп 82
3.7. Результаты обследования на наследственный полиморфизм генов фолатного обмена 99
ГЛАВА IV Обсуждение полученных результатов 101
Выводы 119
Практические рекомендации 121
Список литературы
- Роль состояния эндометрия в имплантации эмбриона
- Протокол стимуляции суперовуляции
- Результаты обследования на наследственный полиморфизм генов предрасположенности к тромбофилии
- Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика эндометрия у пациенток исследуемых групп
Введение к работе
Актуальность проблемы
В последние годы предметом активного обсуждения исследователей становится проблема повышения результативности циклов ЭКО. Несмотря на более чем 30-летнюю историю существования метода, эффективность программ ЭКО за последние годы значительно не меняется [Отчет РАРЧ, 2010]. Высказываются предположения, что в 2/3 случаев неудачи ЭКО связаны с нарушением рецептивности эндометрия и имплантации [Achache H.,2006; Ledee-Bataille N., 2002]. Среди факторов, снижающих рецептивность эндометрия, на первое место выносят хронический эндометрит, сочетанную гинекологическую патологию (аденомиоз, миома матки), соматические заболевания (в том числе аутоиммунные), тромбофилии [Margalioth E.,2006; Оганкович Е.В.,2009]. Вероятнее всего, разная патология реализуется через различные механизмы нарушения рецептивности эндометрия. Предполагают сходство механизмов, лежащих в основе повторных имплантационных потерь, с привычным невынашиванием беременности на раннем сроке [Hassan M.A.M. et al., 2005]. При этом, по мнению большинства авторов, от 30 до 60% случаев привычного невынашивания беременности связано с гиперкоагуляцией и тромбообразованием [Макацария А.Д., 2003; Greer I.A.,2003; Сидельникова В.М.,2010].
Взаимосвязь между тромбофилическими состояниями и неудачными исходами ВРТ активно обсуждается в литературе, но возможные механизмы влияния тромбофилии на исходы программ ВРТ до сих пор не ясны [Nelson S.M., 2008]. На фоне стимуляции суперовуляции происходит изменение коагуляционных параметров свертывающей системы крови [Mara M., 2004; Иванец Т.Ю., 2004]. Обсуждается возможная причинно-следственная связь гиперкоагуляции и гипофибринолиза с повторными имплантационными потерями в программах ЭКО [Nelson S.M., 2008; Angeles Martinez-Zamora M., 2011].
Имеются данные о наличии наследственной предрасположенности к гиперкоагуляции и тромбообразованию. В настоящее время к наиболее изученному наследственному полиморфизму генов предрасположенности к тромбофилии относятся: мутация FV Лейдена, мутация протромбина, полиморфизм генов PAI-1, фибриногена, тромбоцитарных гликопротеинов ITGA2, ITGB3; наиболее изученной приобретенной формой тромбофилии является антифосфолипидный синдром [Момот А.П., 2006; Сидельникова В.М.,2010]. Данные литературы относительно целесообразности обследования на наследственные и приобретенные факторы риска развития тромбофилии пациенток с повторными неэффективными программами ЭКО неоднозначны [Nelson S.M., 2008]. Требуют детального анализа исследования по изучению возможных механизмов влияния лабораторных маркеров риска развития тромбофилии на реализацию репродуктивной функции в программах ВРТ.
В настоящее время одной из методик, направленных на повышение эффективности ЭКО, является применение антикоагулянтной терапии [Urman B.;2009]. При этом высказываются мнения о возможном положительном эффекте схем профилактической прегравидарной терапии антикоагулянтами не только на систему гемостаза, но и на белки, участвующие в формировании рецептивности эндометрия и адекватной имплантации [Nelson S.M.,2008]. Однако схемы и длительность применения этой терапии детально не исследованы.
Таким образом, изучение особенностей реализации программы ЭКО у пациенток с наследственными и приобретенными факторами риска развития тромбофилии, уточнение схем и длительности профилактической антикоагулянтной терапии является актуальным и современным.
Цель исследования: Изучить влияние наследственного полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии и антифосфолипидного синдрома на особенности реализации программы ЭКО у пациенток с бесплодием.
Задачи исследования:
1.Оценить клинико-анамнестические данные, частоту и структуру наследственного полиморфизма генов предрасположенности к
тромбофилии и антифосфолипидного синдрома у пациенток с 2-мя и более неудачными попытками ЭКО в анамнезе.
2.Оценить влияние полиморфизма гена PAI-1 675 5G/4G на морфологическое состояние эндометрия и экспрессию "классических" маркеров рецептивности эндометрия (пиноподии, стероидные рецепторы, LIF) в период "окна имплантации" у пациенток с неудачами ЭКО в анамнезе.
-
Оценить влияние полиморфизма гена PAI-1 675 5G/4G на экспрессию остеопонтина, VEGF и белка PAI-1 в эндометрии в период "окна имплантации" у пациенток с неудачами ЭКО в анамнезе.
-
Провести сравнительную оценку показателей гемостазиограммы в процессе реализации программы ЭКО у пациенток с высокой и низкой частотой полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии.
-
Провести сравнительную оценку фолликуло-, оогенеза, раннего эмбриогенеза у пациенток с высокой и низкой частотой полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии.
6.Оценить влияние профилактической схемы антикоагулянтной терапии на исходы программ ЭКО. Разработать алгоритм предварительного обследования пациенток программы ЭКО на наследственные и приобретенные факторы риска развития тромбофилии, подготовки их к реализации программы и проведению этапов ЭКО.
Научная новизна
В результате выполнения данной работы установлено, что у пациенток с повторными неэффективными попытками ЭКО повышена экспрессия белка PAI-1 в поверхностном эпителии эндометрия в период "окна имплантации", что дает новую информацию о механизмах, лежащих в основе нарушения имплантации. Определены маркеры рецептивности эндометрия, на экспрессию которых оказывает влияние наследственный полиморфизм гена PAI-1 675 5G/4G. Выявлена прямая корреляционная зависимость между 4G аллелем PAI-1 и уровнем белка PAI-1 в эндометрии.
Практическая значимость
В результате проведенной работы выявлено влияние полиморфизма гена PAI-1 675 5G/4G на рецептивность эндометрия. Полученные нами данные указывают на целесообразность обследования пациенток программы ЭКО на наследственный полиморфизм генов предрасположенности к тромбофилии.
Установлено, что у пациенток с высокой частотой полиморфизма генов системы гемостаза отмечается более частое и выраженное повышение Д-димера ко дню переноса эмбрионов в полость матки, что указывает на высокий риск активации внутрисосудистого свертывания крови и тромботических осложнений у пациенток данной группы.
В данной работе продемонстрировано повышение эффективности программы ЭКО до 40% на фоне профилактической антикоагулянтной терапии по сравнению с 22,2% в стандартном протоколе ЭКО у пациенток с неудачными попытками ЭКО в анамнезе и высокой частотой полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии.
Положения, выносимые на защиту
-
-
Пациентки с 2-мя и более неэффективными попытками ЭКО в анамнезе характеризуются высокой частотой наследственного полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии в различных сочетаниях (89,9%), из которых наиболее часто встречается гомо- и гетерозиготный полиморфизм гена PAI-1 (4G/4G, 5G/4G) - 30,5% и 47,2%.
-
Более частое и выраженное повышение Д-димера в лютеиновую фазу цикла ЭКО у пациенток с высокой частотой полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии свидетельствует о повышенном риске
активации внутрисосудистого свертывания крови, что является основанием для профилактического использования низкомолекулярных гепаринов.
-
-
Для женщин с неудачными попытками ЭКО в анамнезе в эндометрии в период "окна имплантации" характерно снижение экспрессии LIF, VEGF, остеопонтина и высокий уровень белка PAI-1 по сравнению с группой здоровых фертильных женщин. Присутствие 4G аллеля PAI-1 сопровождается более высокой экспрессией белка PAI-1 в эндометрии.
-
Терапия малыми дозами антикоагулянтов в лютеиновую фазу цикла ЭКО у пациенток с неудачными попытками ЭКО в анамнезе и высокой частотой полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии является профилактикой активации внутрисосудистого свертывания крови и позволяет повысить результативность программы ЭКО до 40%.
Апробация материалов диссертации
Основные положения диссертации и результаты работы доложены на IV Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010), 20th World Congress on Fertility and Sterility (Munich, 2010). Работа обсуждена на межклинической конференции сотрудников отделения 1 гинекологии ФГУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России 18.03.2011 г. и заседании апробационной комиссии ФГУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России 29.03.2011 г.
Внедрение результатов исследования в практику
Применение профилактической антикоагулянтной терапии в лютеиновую фазу цикла ЭКО у пациенток группы риска развития тромбофилии внедрено в практику работы отделения 1 гинекологии ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в т.ч. 3 в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
Роль состояния эндометрия в имплантации эмбриона
Имплантация эмбриона в полость матки - сложный многоступенчатый процесс с вовлечением большого числа клеточных и гуморальных факторов, каскадом разнообразных межмолекулярных и межклеточных взаимодействий, успешность которых зависит от двух компонентов — состояния эндометрия и качества эмбриона. [6,24,45,66]. На протяжении каждого цикла под влиянием эстрогенов и прогестерона в эндометрии происходят изменения, необходимые для создания состояния рецептивно сти эндометрия к имплантирующейся бластоцисте [44,52,55]. Эти изменения зависят не только от гормонов, локальных ауто- и паракринных факторов, но и от сигналов со стороны эмбриона, что способствует синхронизации развития эмбриона и эндометрия [51].
Короткий период времени, в течение которого в эндометрии происходят анатомические и молекулярные изменения, необходимые для нидации. эмбриона обозначается как "окно имплантации"[6,55,66]. Оно соответствует 21-24 дню регулярного 28-дневного менструального цикла, что совпадает по времени с 6-7 днем после овуляции. "Окно имплантации" тесно связано с понятием рецептивности эндометрия, включающим в себя комплекс структурно-функциональных характеристик эндометрия с четкими временными и пространственными константами, определяющими способность эндометрия к имплантации [21].
Принято считать, что примерно две трети неудач имплантации происходят по причине нарушения восприимчивости матки или нарушения взаимодействия эмбриона и эндометрия. И только одна треть неудач ЭКО связана с непосредственным дефектом эмбрионов [24,55,92]. Предполагают, что рецептивность матки более часто нарушается в программах ЭКО по сравнению с естественным циклом [59,77]. Так, в стимулированных циклах было выявлено снижение количества рецепторов стероидных гормонов в эндометрии: В исследовании на мышах было показано, что только низкие дозы эстрогенов формируют рецептивное состояние эндометрия, в то время, как высокие делают эндометрий рефрактерным к имплантации [90].
Основная часть информации об этапах имплантации и факторах, вовлеченных в формирование рецептивности эндометрия, получена в исследованиях эндометрия в естественном цикле, в работах на культурах клеток и наблюдениях за животными.
Выделяют три основных этапа имплантации: аппозицию, адгезию и инвазию. В течение стадии аппозиции клетки эмбриона ориентируются относительно эндометрия. Вторым этапом является адгезия бластоцисты, в основе которой лежит фиксация эмбриона на поверхности эндометрия и установление функциональных связей. Третий этап - инвазия клеток трофобласта между эпителиальными клетками эндометрия и прорастание в строму [6,52,66].
Большинство маркеров "окна имплантации" экспрессируется под прямым или опосредованным влиянием стероидных гормонов - эстрадиолаш прогестерона, действие которых на эндометрий осуществляется путем связывания со специфическими ядерными рецепторами [6]. Количественное определение рецепторов эстрогенов и прогестерона и их соотношения между собой в настоящее время используется как один из методов оценки состояния "окна имплантации" [6].
К наиболее изученным маркерам имплантационного окна относят пиноподии, факторы роста, молекулы клеточной адгезии и цитокины [52,66].
В начале секреторной фазы цикла под влиянием прогестерона микроворсинки на апикальной поверхности эпителия соединяются и образуют структуры, называемые пиноподиями. В настоящее время одним из этапов оценки соответствия эндометрия "окну имплантации" является определение количества пиноподии в поверхностном эпителии [б]. Именно на поверхности пиноподий выявлена экспрессия молекул, необходимых для аппозиции и адгезии бластоцисты: лейкемия-ингибирующий фактор (LTF), а5 рЗ интегрин, остеопонтин,-гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF) [23,55,115].
Среди интегринов в период "окна имплантации" наиболее важное значение имеют - а5рз, аїрі, а4рі интегрины [52]. В качестве посредника для интегрин-опосредованной адгезии и миграции клеток в период имплантации описана роль остеопонтина. Данный гликопротеин межклеточного матрикса связывается с a5-P3 интегрином клеточной мембраны и способствует передаче сигнала [31]. И остеопонтин, и а5рЗ интегрин локализованы в поверхностном и железистом эпителии в среднюю и позднюю секреторную фазу цикла [52]. Выявлено прямое стимулирующее влияние прогестерона на синтез остеопонтина и опосредованное на экспрессию а5рЗ интегрина путем действия на паракринные стромальные факторы (EGF, HB-EGF) [52].
Также в циклической регенерации эндометрия и имплантации участвуют и цитокины - гликопротеины, имеющие разнонаправленные функции и осуществляющие свое действие через специфические рецепторы. Наиболее изучена роль в имплантации для представителей семейства интерлейкина-6 (лейкемия-ингибирующий фактор (LIF), JL-6, EL-11) и ростовых факторов (гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF), колониестимулирующий фактор роста (CSGF)) [52,115,122].
LIF представляет собой гликопротеин с массой 40-50 kDa, его экспрессия наблюдается во многих эмбриональных и зрелых тканях, но наиболее высока в матке в секреторную фазу цикла [23, 82]. В 1992 году Стюарт и коллеги продемонстрировали абсолютную необходимость LIF для имплантации: самки мышей с мутацией LIF -/- были бесплодны из-за нарушения имплантации [116]. При этом имплантация останавливалась на стадии аппозиции, нарушалась децидуализация в матке, а попытки искусственно вызвать децидуализацию к успеху не приводили [44,58, 107]. В эндометрии фертильных женщин мРНК LIF определяется в период с 18 по 28 день цикла, а в среднюю секреторную фазу цикла, соответствующую "окну имплантации", мРНК LIF-рецептора выявляется в - поверхностном и железистом эпителии [23,119]. Выявлена корреляция между уровнем LIF, LIF- рецептора и формированием пиноподий [23]. У пациенток с бесплодием неясного генеза, повторными неудачами ЭКО и привычным невынашиванием беременности выявлен дисбаланс уровня LIF в эндометрии в период "окна имплантации" по сравнению с группой фертильных женщин [88,99].
Протокол стимуляции суперовуляции
Определение уровня гомоцистеина в плазме крови проводилось в-лаборатории клинической иммунологии ФГУ "НЦАГиП им. академика В.И.Кулакова" Минздравсоцразвития России (руководитель - академик РАМН, д.м.н., профессор Г.Т.Сухих) методом жидкостной хроматографии с использованием наборов фирмы Abbot и поляризационного флуоресцентного иммуноанализатора ПМх ABBOTT (USA).
Международная норма гомоцистеина 5-15 мкмоль/л. Определение полиморфизма генов фолатного обмена Определение генетического полиморфизма генов фолатного обмена проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Realtime PCR) с использованием диагностических наборов компании «ДНК-Технологии» (Россия) в лаборатории молекулярно-генетических исследований ФГУ «НЦ АГ и П им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России (руководитель — д.б.н. Трофимов Д.Ю.). Исследовали полиморфизм: С677Т в гене MTHFR; А1298С в гене MTHFR; A2756G в гене MTR; A66G в гене MTRR. Определение полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии
Определение генетического полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Realime PCR) с использованием диагностических наборов компании «ДНК-Технологии» (Россия) в лаборатории молекулярно-генетических исследований ФГУ «НЦ АГ и П им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России (руководитель — д.б.н. Трофимов Д.Ю.). Исследовали полиморфизм: G455A в гене фибриногена; G20210A в гене протромбина; G1691A в гене V фактора; 675 5G/4G в гене PAI-1; С807Т в гене ITGA2; Т1565С в гене ITGB3. УЗИ органов малого таза
Исследование выполняли на аппарате "Sonoline Sienna"(Siemens, Германия) с использованием трансвагинального датчика с частотой 6,5 МГц, измерения проводились при опорожненном мочевом пузыре с использованием одноразового презерватива. Всем пациенткам проводили трансвагинальное ультразвуковое исследование матки и яичников с определением количества антральных фолликулов, отсутствия объемных образований в малом тазу, структуры и толщины эндометрия на 3-5 день цикла и в день выполнения пайпель-биопсии эндометрия, а также в течение исследуемого цикла для определения дня овуляции. УЗ-мониторинг стимуляции суперовуляции осуществляли на 2-3 день МЦ, на 6 день стимуляции суперовуляции, далее ежедневно до введения овуляторной дозы хорионического гонадотропина. Гистологическое исследование
Биопсию эндометрия проводили под ультразвуковым контролем из области дна матки на 6-7 день после овуляции с помощью аспирационной кюретки Pipelle de Cornier ("Laboratoire C.C.D", Франция), в цикле, предшествующем протоколу ЭКО. Материалы биоптатов фиксировали в 10%-м нейтральном формалине в течение 24 часов. После обработки образцов по стандартной общепринятой методике их заключали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм готовили на роторных микротомах и окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование гистологических препаратов проводилось в световом микроскопе при увеличении от х50 до х400. Гистологические заключения формулировали в лаборатории патоморфологии ФГУ "НЦ АГ и П им. академика В.И.Кулакова" Минздравсоцразвития России (руководитель — д.м.н., проф. Е.А.Коган) в соответствии с современными стандартами, изложенными в общепринятых фундаментальных руководствах (Кондриков 2008; Mazur 2005). Также проводилась оценка процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий в световом микроскопе при увеличении х400 в 5 ПОЛЯХ зрения. Для проведения иммуногистохимического исследования контрольную группу составил эндометрий 11 здоровых фертильных женщин.
Иммуногистохимическое исследование Иммуногистохимические реакции (ИГХ) проводили в лаборатории патоморфологии ФГУ "НЦАГ и П им. академика В.И.Кулакова" Минздравсоцразвития России (руководитель - д.м.н., проф. Е.А.Коган) на депарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм. Для визуализации реакций применяли универсальный пероксидазный набор LSAB+kit ("DAKO", США). Эстрогеновые рецепторы и прогестероновые рецепторы: использовали мышиные моноклональные антитела к эстрогеновым рецепторам а (клон 1D5 "DAKO", США; разведение 1:35) и прогестероновым рецепторам (клон 636 "DAKO", СШФ; разведение 1:50). Анализ результатов для ЭР и ПР проводили с учетом количества окрашенных клеток и интенсивности окраски в поверхностном эпителии, железах и строме эндометрия, используя метод гистологического счета Н score по формуле:Н8=1а + lb + Зс Где а - % слабо окрашенных клеток, b - % умеренно окрашенных клеток, с % слабо окрашенных клеток. 1,2,3 — интенсивность окрашивания, выраженная в баллах. Степень выраженности экспрессии ЭР и ПР расценивали: 0-10 % отсутствие экспрессии, 11-100 % — слабая экспрессия, 101-200 % — умеренная экспрессия, 201-300 % — выраженная экспрессия. Ингибитор активатора плазминогена 1 типа (PAI-1): использовали первичные антитела к PAJ-1(H-135, Santa Gruz Biotechnology, USA, a rabbit polyclonal antibody, разведение 1:200). Сосудистый эндотелиалъный фактор роста (VEGF): использовали первичные антитела к VEGF (Cerm, Epitomics, USA, a rabbit monoclonal antibody, clon Ш: EP1176Y, разведение 1:100). Лейкемия-ингибирующий фактор (LIF): использовали первичные антитела к LIF (R@D Systems, USA, clone: 9824, mouse anti-human-antibody). Остеопонтин: использовали первичные антитела к остеопонтину (NeoMarKens для Lab Vision Corporation, USA, разведение 1:100, epitope specific rabbit antibody).
Результаты обследования на наследственный полиморфизм генов предрасположенности к тромбофилии
Среднее количество фолликулов в la, lb и II группах составило 11±1,2; 12,2±1,1; 11,7±1,1 соответственно, и достоверно не отличалось между группами, как и количество полученных ооцитов (р 0,05). Анализируя параметры оогенеза, мы также не выявили статистически значимых различий между исследуемыми группами (таблица 16). Доля зрелых ооцитов (определяется как соотношение среднего количества зрелых ооцитов к среднему количеству ооцитов) составила 85%, 82,8% и 79,8% в la, lb и П группе соответственно. Общее количество полученных и перенесенных эмбрионов также статистически значимо не различалось между группами.
Таким образом, статистически значимых различий между группами пациенток в отношении параметров фолликулогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза выявлено не было. Учитывая сходные параметры фолликулогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза у пациенток с высоким и низким риском развития тромбофилии, мы посчитали важным уделить внимание сравнению параметров гемостазиограммы между группами пациенток в стандартном длинном протоколе ЭКО.
Принимая во внимание данные литературы [7,17] о влиянии гормональной стимуляции на активацию внутрисосудистого свертывания крови мы провели сравнительную оценку параметров свертывающей и фибринолитической системы крови до начала стимуляции и в динамике: на фоне протокола ЭКО у пациенток 1а группы и II группы. У 98,6% пациенток I группы и 100% пациенток II группы показатели гемостазиограммы до начала протокола ЭКО соответствовали изокоагуляции. Только у 1 пациентки I группы (1,4%, 1/71) до начала протокола ЭКО была зафиксирована гиперфибриногенемия (500 мг/дл при норме до 400 мг/дл). Пациентка была носителем гомозиготного полиморфизма гена фибриногена. Данная пациентка вошла в группу lb (протокол ЭКО + антикоагулянты).
Результаты изучения параметров гемостазиограммы показали, что несмотря на отсутствие нарушений в состоянии свертывания крови у всех пациенток до начала протокола ЭКО в группе 1а (пациентки с высокой частотой полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии) отмечается достоверно более высокий исходный уровень Д-димера - 0,31±0,1 мкг/мл по сравнению с пациентками II группы - 0,26±0,12 мкг/мл (р 0,05).
У пациенток обеих групп ко дню переноса эмбрионов в полость матки наблюдалась активация внутрисосудистого свертывания крови. Средние показатели гемостазиограммы оставались в пределах нормы, но при этом наблюдалось достоверное повышение уровня тромбоцитов, ПТИ, фибриногена и снижение MHO, АПТВ, ТВ и антитромбина III (р 0,05 внутри каждой группы между показателями гемостазиограммы на 21-22 день цикла до начала протокола и в день переноса эмбрионов в полость матки).
При сравнении средних показателей гемостазиограммы в день переноса эмбрионов между 1а группой и П группой достоверные отличия были выявлены в уровне фибриногена и Д-димера. В 1а группе уровень фибриногена в день переноса составил 395,1±68,7 мг/дл; во II группе -335,2±32,5 мг/дл (р 0,05); уровень Д-димера - 1,67±1,1 мкг/мл и 0,97±0,6 мкг/мл соответственно (р 0,05) (рис. 4-5).
Динамика уровня фибриногена в программе ЭКО у пациенток 1а группы и II группы: содержание фибриногена существенно повышается в период стимуляции в обеих группах по сравнению с исходным, начиная с 7-9 дня цикла (р 0,01 по критерию Уилкоксона); различия между группами на момент ПЭ статистически высоко достоверны (р 0,01 по критерию Стьюдента).
Динамика уровня Д-димера в программе ЭКО у пациенток 1а группы и II группы: Содержание Д-димера существенно повышается в период стимуляции в обеих группах по сравнению с исходным, начиная с 7-9 дня (р 0,01 по критерию Уилкоксона); различия между группами на момент ПЭ статистически значимы (р 0,01 по критерию Манна-Уитни). При сходных параметрах стимуляции овуляции, фолликуло- и оогенеза повышение Д-димера в 1а группе было не только более выраженным, но и отмечалось чаще, чем среди пациенток II группы. Повышение Д-димера выше 0,5 мкг/мл ко дню переноса эмбрионов было отмечено у 47,2% (17/36) пациенток 1а группы и у 29,7% (11/37) пациенток II группы. Таким образом, относительный риск повышения Д-димера в лютеиновую фазу стимулированного цикла у пациенток с высокой частотой полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии в 2,1 раза выше по сравнению с пациентками с отсутствием или минимальным носительством полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии.
Достоверных отличий между группами в изменении активности плазменных факторов свертывания крови и антикоагулянтного звена отмечено не было.
Учитывая влияние количества ооцитов и развитие гиперстимуляции яичников на показатели свертывающей системы крови [7,17] мы провели корреляционный анализ методом подсчета коэффициента корреляции Пирсона между количеством ооцитов и изменением Д-димера на день переноса.
Во II группе (с низким риском развития тромбофилии) корреляция между количеством ооцитов и повышением Д-димера была более выраженной (1=0,75, р 0,05), в группе 1а (с высоким риском развития тромбофилии) - отмечалась умеренная корреляция (1=0,61, р 0,05). Пациентки со средней и тяжелой степенью гиперстимуляции яичников были исключены из исследования. Таким образом, при исходно нормальных показателях гемостазиограммы у пациенток с высокой частотой носительства наследственного полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии (I группа) ко дню переноса эмбрионов в полость матки в 2,1 раза чаще и более выражено наблюдается повышение маркеров тромбинемии (Д-димер) по сравнению с пациентками с минимальным носительством наследственного полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии (II группа). Данное наблюдение, а также информация в литературе о положительном влиянии антикоагулянтов на имплантацию эмбрионов послужило поводом для назначения нами пациенткам с высокой частотой полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии (lb подгруппа) профилактической антикоагулянтной терапии в лютеиновую фазу стимулированного цикла [97,120].
Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика эндометрия у пациенток исследуемых групп
Реже встречался гетеро — и гомозиготный полиморфизм генов тромбоцитарного гликопротеина ITGA2: 12,9% и 26,8% соответственно; фибриногена: 21,2% и 9,2% соответственно; тромбоцитарного гликопротеина ITGB3: 5,5% и 12,9% соответственно. Наиболее редко были отмечены гетерозиготная мутация Лейдена и протромбина: 3,7% и 3,7% соответственно. Гомозиготных носителей мутации Лейдена и протромбина в группе исследуемых пациенток не было.
Следует отметить, что на сегодняшний день нет крупных исследований о распространенности полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии в популяции. Данные литературы зачастую основаны на небольших выборках и имеют отличия в зависимости от расовой принадлежности. Несмотря на это, частота наследственного полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии у пациенток с повторными неэффективными попытками ЭКО по результатам нашего исследования оказалась сопоставима с частотой встречаемости в популяции по данным литературы. Так, по данным Панченко и соавт. соотношение полиморфизма гена РАІ-1 в популяции: 4G/4G:5G/4G:5G/5G - 0,25:0,5:0,25 [15]. По нашим данным у пациенток с повторными неудачами программ ЭКО соотношение 4G/4G:5G/4G:5G/5G полиморфизма PAI-1 составило 0,28:0,48:0,24. Распространенность гетерозиготных носителей мутации FV Лейдена по данным литературы в европейской популяции составляет 2-4% [5,8,13], гетерозиготной мутации протромбина 3-5% [8,12,22]. По результатам нашего исследования у пациенток с повторными неэффективными попытками ЭКО гетерозиготная мутация FV Лейдена встречалась в 3,7% случаев, гетерозиготная мутация протромбина - в 3,7% случаев. Таким образом, в нашей работе мы не нашли превалирования мутации FV Лейдена, протромбина или полиморфизма гена PAI-1 среди пациенток с бесплодием и повторными неудачами программ ЭКО по сравнению с популяционными данными, приведенными в литературе.
Антитела к фосфолипидам и их кофакторам среди исследуемых пациенток были определены у 22,2% (24/108). При этом у большинства пациенток (18,5%, 20/108) наблюдалось транзиторное повышение антител, вероятнее всего, обусловленное инфекционными факторами. И только в 3,4% (4/108) случаев повышение антител к фосфолипидам и их кофакторами было неоднократно подтверждено в динамике и сочеталось с клиническими признаками антифосфолипидного синдрома (наличие в анамнезе 3 и более выкидышей). Наиболее часто наблюдалось повышение антител к кардиолипину, р2-гликопротеину, аннексину. Тест на волчаночный антикоагулянт был отрицательным у всех пациенток.
Для того, чтобы оценить влияние лабораторных маркеров риска развития тромбофилии на особенности реализации программы ЭКО мы посчитали необходимым разделить пациенток на две группы: I группа (71 пациентка) - с высокой частотой встречаемости полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии и II группа (37 пациенток) - с их отсутствием или минимальным носительством. В I группу были включены пациентки с наличием гетеро- или гомозиготной мутации Лейдена -единичной или в сочетании с полиморфизмом других генов; наличием гетеро- или гомозиготной мутации протромбина - единичной или в сочетании с полиморфизмом других генов; наличием трех и более гетерозигот по генам PAI-1, ITGA2, ITGB3, фибриногену; наличием двух и более гомозигот по генам PAI-1, ITGA2, ITGB3, фибриногену; наличие положительных антител к ФЛ, подтвержденных в динамике с интервалом 6 недель. У пациенток II группы допускалось наличие наличием 2 и менее гетерозигот или 1 гомозиготы по генам PAI-1, ITGA2, ITGB3, фибриногену (см. главу II - Материалы и Методы).
Комплексная оценка клинических и лабораторных данных у пациенток исследуемых групп позволила нам: - оценить характер и структуру репродуктивных нарушений у пациенток с 2 и более повторными неудачами программы ЭКО в зависимости от носительства полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии и антифосфолипидных антител; -провести морфологическую оценку состояния эндометрия; -провести иммуногистохимическое исследование маркеров рецептивности, ангиогенеза и тканевых ремодуляторов эндометрия; -проанализировать динамику параметров гемостазиограммы в программе ЭКО и провести сравнение параметров гемостазиограммы у пациенток с высокой частотой полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии и низкой частотой или отсутствием полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии; -оценить фолликулогенез, оогенез, ранний эмбриогенез и эффективность реализации программы ЭКО у пациенток исследуемых групп; -оценить влияние профилактической антикоагулянтной терапии на эффективность программы ЭКО у пациенток с высокой частотой полиморфизма генов предрасположенности к тромбофилии. По данным литературы наследственный полиморфизм генов предрасположенности к тромбофилии и антифосфолипидный синдром считаются одним из этиологических факторов тромботических заболеваний, в акушерстве - в 40-60% случаев - причиной невынашивания беременности, фетоплацентарной недостаточности, нефропатии, внутриутробной гибели плода [3,22]. При изучении наследственного анамнеза у родственников пациенток I группы (с высоким риском развития тромбофилии) осложнения акушерского анамнеза (невынашивание беременности, внутриутробная гибель плода, нефропатия) были выявлены в 2,9 раза чаще по сравнению с родственниками пациенток II группы.
Похожие диссертации на ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОГРАММЫ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ У ПАЦИЕНТОК С РИСКОМ РАЗВИТИЯ ТРОМБОФИЛИИ
-
-
