Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные подходы к преодолению бесплодия у пациентов программы эко с неэффективными попытками в анамнезе (обзор литературы) 13
1.1. Современная структура бесплодия . 13
1.2. Принципы и основы программ ВРТ 13
1.2.1. История разработки метода ЭКО . 13
1.2.2. Общая характеристика программы ЭКО . 14
1.2.3. Осложнения в программе ЭКО . 18
1.2.4. Мужской фактор бесплодия и метод ИКСИ 19
1.3. Стимуляция суперовуляции в программе ЭКО . 21
1.3.1. Оогенез в спонтанном цикле . 21
1.3.2. Принципы стимуляции фолликулогенеза 22
1.3.3. Протоколы стимуляции суперовуляции в программе ЭКО 24
1.3.4. Применение агонистов ГнРГ («длинный» протокол) 25
1.3.5. Применение антагонистов ГнРГ («короткий» протокол) 26
1.3.6. Новые подходы к стимуляции овуляции . 26
1.4. Особенности преодоления бесплодия у супружеских пар с неудачными попытками ЭКО в анамнезе 28
1.4.1. Основные причины повторных неудач имплантации 28
1.4.2. Эмбриологические аспекты преодоления повторных неудач имплантации . 31
1.5. Преимплантационная генетическая диагностика 35
1.5.1. История развития ПД 35
1.5.2. Принципы FISH метода . 36
1.5.3. Применение ПД для преодоления ПНИ 37
1.6. Общая характеристика хромосомных болезней 43
1.6.1. Трисомии аутосом 44
1.6.1.1. Синдром Дауна 47
1.6.1.2. Синдром Эдвардса . 48
1.6.1.3. Синдром Патау 49
1.6.2. Анеуплоидии гоносом . 49
1.6.2.1. Синдром полисомии хромосомы Х 51
1.6.2.2. Синдром Кляйнфельтера 52
1.6.2.3. Синдром моносомии хромосомы Х 53
1.7. Перинатальные исходы после ПД . 55
1.8. Перспективы развития ПД . 60
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования . 63
2.1. Материалы исследования . 63
2.2. Методы исследования . 65
2.2.1. Предварительное обследование супружеской пары . 65
2.2.2. Общеклинические методы обследования 66
2.2.3. Гормональное обследование . 67
2.2.4. Ультразвуковое исследование органов малого таза . 67
2.2.5. Исследование кариотипа по лимфоцитам периферической крови 68
2.2.6. Спермиологический анализ 6
2.2.7. Исследование антигенов системы HLA . 69
2.2.8 Медико-генетическое обследование . 70
2.2.9. Преимплантационная генетическая диагностика . 71
2.3. Этапы программы ЭКО 73
2.3.1. Стимуляция суперовуляции по «длинному» протоколу 74
2.3.2.Трансвагинальная пункция яичников . 74
2.3.3.Оплодотворение ооцитов и культивирование эмбрионов in vitro 74
2.3.4. Преимплантационная диагностика эмбрионов . 74
2.3.5. Перенос эмбрионов в полость матки . 75
2.3.6. Посттрансферный период . 74
2.3.7. Диагностика беременности . 75
2.4. Статистическая обработка результатов исследования . 75
ГЛАВА 3. Результаты собственного исследования 77
3.1. Характеристика клинико-анамнестических данных пациенток, включенных в исследование . 77
3.1.1. Росто-весовые показатели пациенток 77
3.1.2. Возраст пациенток и их супругов . 79
3.1.3. Менструальная функция пациенток . 80
3.1.4. Длительность бесплодия пациенток 82
3.1.5. Тип бесплодия пациенток . 84
3.1.6. Репродуктивный анамнез пациенток . 85
3.1.7. Гинекологические заболевания в анамнезе . 85
3.1.8. Перенесенные операции на органах малого таза 86
3.1.9. Неэффективные циклы ЭКО в анамнезе . 88
3.2. Клинико-лабораторное обследование пациенток 90
3.2.1. Функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно- яичниковой системы 90
3.2.2. Характеристика циклов стимуляции в исследуемых группах... 91
3.3. Данные ПД эмбрионов у пациенток основной группы с 2-мя и более неэффективными попытками ЭКО в анамнезе и I группы сравнения с первой попыткой ЭКО . 100
3.3.1. Результаты исследования эмбрионов FISH методом . 100
3.3.2. Характеристика хромосомной патологии эмбрионов 105
3.4. Результаты программы ЭКО после проведения ПД у пациенток основной группы с 2-мя и более неэффективными попытками ЭКО в анамнезе и пациенток групп сравнения 112
3.4.1. Исходы программы ЭКО у женщин моложе 35 лет . 118
3.4.2. Исходы программы ЭКО у женщин старше 35 лет 120
3.5. Обсуждение полученных результатов 123
ГЛАВА 4. Заключение 138
Выводы 145
Практические рекомендации 146
Алгоритм проведения ПД эмбрионов пациенток программы ЭКО 147
Список условных сокращений 148
Список литературы . 150
- Особенности преодоления бесплодия у супружеских пар с неудачными попытками ЭКО в анамнезе
- Предварительное обследование супружеской пары
- Характеристика клинико-анамнестических данных пациенток, включенных в исследование
- Данные ПД эмбрионов у пациенток основной группы с 2-мя и более неэффективными попытками ЭКО в анамнезе и I группы сравнения с первой попыткой ЭКО
Введение к работе
Актуальность проблемы
Несмотря на высокую эффективность программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), женщины с повторными неудачами имплантации составляют около 30,0% от числа пациентов, проходящих лечение с использованием данных методов (И. А. Судома, Ю. В. Маслий, 2007). Перенос морфологически качественного эмбриона при наличии эндометрия, структурно соответствующего фазе менструального цикла, не всегда приводит к имплантации, а наступившая беременность в ряде случаев прекращает развиваться на ранних сроках.
Некоторые авторы отмечают, что процент эмбрионов, не имплантировавшихся в полости матки после их переноса, достигает 85% (D. Wells, 2013). Исследования кариотипа абортусов, прервавшихся до 6 недель беременностей, наступивших после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), позволили выявить, что высокая частота прерывания связана с наличием хромосомной патологии у эмбрионов (D. K. Edmonds, 1982; A. J. Wilcox, 1988). Наиболее часто встречаются анеуплоидии хромосом X, Y, 13, 18 и 21. Эмбрионы с трисомией по этим аутосомам могут быть жизнеспособными, а беременность закончится рождением детей с хромосомными болезнями.
Применение преимплантационной диагностики (ПД) с использованием молекулярно-цитогенетического метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) может способствовать повышению эффективности программы ЭКО. Принцип метода основан на специфической гибридизации определенных участков хромосом с флуоресцентно-мечеными зондами. Наличие или отсутствие хромосом определяют по флуоресценции зондов, что позволяет отобрать эмбрионы без патологии по исследуемым хромосомам для дальнейшего переноса их в полость матки и исключить перенос эмбриона с генетической патологией (N. S. Macklon, 2002).
До сих пор остается нерешенным вопрос о целесообразности проведения ПД
эмбрионов определенным категориям пациентов. В частности, были получены
противоречивые данные при применении данного метода у эмбрионов пациенток позднего
репродуктивного возраста (L. Gianaroli, 1999; S. Munne, 1999; S. Mastenbroek, 2007). В связи с этим представляет интерес выявление категорий пациентов, которым может быть рекомендовано проведение диагностики.
Цель исследования: определение роли преимплантационной диагностики в оптимизации исходов программы ЭКО у женщин с неэффективными попытками в анамнезе.
Задачи исследования:
-
Изучить клинико-анамнестические данные и особенности проведения предыдущих попыток ЭКО женщин, включенных в исследование;
-
Провести генетическое исследование полученных в программе ЭКО эмбрионов FISH-методом (хромосомы X, Y, 13, 18, 21) в основной группе и группе сравнения I;
-
Оценить частоту выявления хромосомной патологии эмбрионов у женщин до 35 лет и позднего репродуктивного возраста;
-
Провести сравнительную оценку эффективности программы ЭКО, особенности течения ранних сроков беременности и частоту ранних репродуктивных потерь у женщин с переносом эмбрионов после ПД и без нее;
-
На основании результатов исследования оценить значимость ПД в повышении эффективности программы ЭКО и ПЭ;
-
Разработать алгоритм применения ПД у эмбрионов пациенток программы ЭКО.
Научная новизна
Проведенный в исследовании корреляционный анализ позволил выявить зависимость частоты хромосомной патологии эмбрионов от количества полученных в результате стимуляции ооцитов (коэффициент корреляции 0,436, p<0,01). Кроме того, была выявлена зависимость между возрастом супруга и частотой хромосомной патологии эмбрионов (коэффициент корреляции 0,397, p<0,01). Было показано, что даже у пациенток моложе 35 лет с первым циклом ЭКО частота хромосомной патологии эмбрионов увеличивается при получении более 8 ооцитов и возрасте супруга старше 38 лет.
Полученные данные позволили сформулировать показания к проведению ПД эмбрионов женщин молодого возраста.
Проведена сравнительная оценка результативности программы ЭКО у женщин моложе и старше 35 лет с неэффективными попытками в анамнезе после проведения эмбрионам ПД и без нее. Разработан персонифицированный подход к ведению пациенток в программе ЭКО в зависимости от возраста женщин и их супругов, количества полученных в результате стимуляции ооцитов и числа попыток ЭКО в анамнезе.
Практическая значимость
В результате исследования разработан алгоритм проведения ПД эмбрионов супружеских пар программы ЭКО, уточнены показания к проведению диагностики у пациенток моложе и старше 35 лет.
Проведен анализ частоты и структуры хромосомной патологии эмбрионов, полученных в программе ЭКО, в зависимости от возраста женщин и количества попыток в анамнезе. Выявлена зависимость частоты хромосомной патологии эмбрионов от возраста мужчин.
Внедрение персонифицированного подхода к применению ПД эмбрионов у пациенток программы ЭКО позволило улучшить исходы программ ВРТ.
Положения, выносимые на защиту:
-
Частота выявления хромосомной патологии эмбрионов находится в прямой зависимости от количества полученных в результате стимуляции зрелых ооцитов и возраста супруга, что позволяет рекомендовать проведение ПД не только эмбрионам женщин позднего репродуктивного возраста с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе, но и пациенткам моложе 35 лет при получении более 8 ооцитов и возрасте супруга старше 38 лет.
-
При исследовании 5-ти хромосом у эмбрионов пациенток программы ЭКО частота патологии составляет 31,2% – 50,6%. С увеличением возраста супругов и количества неэффективных циклов ЭКО в анамнезе возрастает частота анеуплоидий у эмбрионов, в том числе по нескольким хромосомам, выявляемых при проведении ПД.
-
Применение ПД снижает риск рождения больного ребенка путем исключения
переноса эмбриона с патологией по исследуемым хромосомам, что является социально
значимым, поскольку эмбрионы с патологией, имеющие потенциал к имплантации и развитию беременности, составляют около 40,0%.
4. Проведение ПД способствует повышению эффективности программы ЭКО у
женщин старше 35 лет с безуспешными попытками в анамнезе, увеличивая частоту наступления беременности и родов за счет снижения репродуктивных потерь.
Личный вклад автора Автор участвовала в выборе направления исследования, разработке цели и задач. Проводила обследование пациенток и сбор их анамнеза. Самостоятельно набирала материал для литературного обзора. Принимала непосредственное участие во всех этапах лечения методом ЭКО, в анализе результатов исследования ядер бластомеров эмбрионов молекулярно-цитогенетическим методом. Автором лично выполнены обобщение, анализ и статистическая обработка полученных в исследовании результатов, их интерпретация и формулирование выводов и практических рекомендаций.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 – «акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пункту 4 паспорта акушерства и гинекологии.
Апробация работы
Материалы исследования доложены и обсуждены на заседании межклинической конференции отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия (20 июня 2013 года) и апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. акад. В.И.Кулакова» Минздрава России (8 ноября 2013 года).
Внедрение результатов работы в практическое здравоохранение
Результаты проведенного исследования внедрены в практику работы отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ «НЦАГиП имени академика В.И.Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых 7 – статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ.
Структура и объем диссертации
Работа изложена на 170 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержит 26 таблиц и 44 рисунка. Список литературы включает 194 источника, из них 29 отечественных и 165 зарубежных авторов.
Особенности преодоления бесплодия у супружеских пар с неудачными попытками ЭКО в анамнезе
Следствием постоянного усовершенствования клинических и
эмбриологических аспектов методики ЭКО является стабильный рост эффективности методов ВРТ. Так, в 2001 г. из 235 тысяч циклов ВРТ, проведенных в Европе, лишь 29% завершились наступлением беременности [39]. В США с 1986 по 2003 год частота наступления беременности возросла с 8% до 34,4%. К 2004 г. в среднем эффективность метода в различных клиниках мира составляла 25-45% [20]. По данным отчета РАРЧ за 2010 г. частота наступления беременности составила 37,8% из расчета на перенос эмбрионов [13].
Частота беременностей, наступающих после 1-го цикла ЭКО и ПЭ, может достигать 60% [121]. Но, несмотря на развитие методов ВРТ, частота имплантации все еще остается низкой, поскольку даже перенос морфологически качественного эмбриона в эндометрий, структурно соответствующий фазе менструального цикла, не всегда приводит к наступлению беременности, а наступившая беременность в ряде случаев прекращает развитие на ранних сроках [78].
Повторные неудачи имплантации (ПНИ) после переноса морфологически «качественных» эмбрионов — одна из наиболее важных проблем репродуктологии. Супружеские пары с неоднократными неудачными попытками ЭКО составляют около 30% от всех пациентов, включенных в программу ВРТ [21]. ПНИ — отсутствие беременности после 3-х циклов ЭКО или суммарного переноса 10 и более «качественных» эмбрионов [120]. Причинами этого могут быть врожденные пороки развития матки, дефекты эндометрия, обусловленные хирургическими вмешательствами, снижение его рецептивности, недостаточно хорошее качество эмбрионов по морфологическим критериям, генетические, гормональные, метаболические, гемостазиологические (наследственные тромбофилии) и иммунологические нарушения. Было отмечено, что у пациенток с неэффективными попытками ЭКО чаще выявляются мутации генов тромбофилии, патология щитовидной железы и нарушения метаболизма (инсулинорезистентность, метаболический синдром, ожирение), особенности хромосомного набора [117, 182]. После 3-х неэффективных циклов, в которых был произведен перенос эмбрионов «хорошего качества», целесообразно проводить более глубокое обследование как самой супружеской пары, так и их эмбрионов.
Повторные неудачи имплантации могут быть связаны с недиагностированной патологией эндометрия. У 18-27% женщин с нормальной гистероскопической картиной до ЭКО, при повторном гистероскопическом исследовании, проводимом после несостоявшейся имплантации, выявляют различную патологию эндометрия, в частности, гиперплазию и полипы эндометрия, эндометрит, внутриматочные синехии и др. [71]. Имеются противоречивые данные о влиянии на повторные неудачи имплантации миомы матки с интрамуральным расположением узлов без деформации полости и диаметром миоматозных узлов 4 см [81, 113, 178].
Некоторые авторы считают, что так называемый «тонкий» эндометрий не оказывает значительного влияния на частоту наступления беременности, особенно при переносе эмбрионов хорошего качества [116, 161]. Утверждение о том, что минимальная толщина эндометрия для наступления клинической беременности должна составлять 4 мм, до сих пор остается спорным, что необходимо учитывать при повторных неудачах имплантации. В некоторых случаях ПНИ связаны с нарушением местной регуляции нормальной экспрессии или активности различных цитокинов. В частности, было отмечено, что повышение количества эндометриальных NK клеток, нарушение регуляции интерлейкинов 12, 15 и 18, высокий уровень интерлейкина 1-бета и низкий уровень гамма-интереферона и интерлейкина 10 приводит к несостоятельности имплантации [34, 170]. Так же одной из причин может быть отсутствие в эндометрии при имплантации специфического интегрина альфаV бета3 [86, 165]. К повторным неудачам имплантации приводят также повышенный уровень ароматазы p450 мРНК, изменения в выраженности пиноподий и повышенный уровень матриксных металлопротеиназ [34, 59, 105].
Иммуногенетика беременности в настоящее время изучена недостаточно.
HLA-гистосовместимость фето-плацентарной системы влияет на исход беременности, однако, механизм, обеспечивающий защиту аллогенного эмбриона от иммунологической реакции отторжения, до конца не ясен [4]. Данные экспериментальных и клинических исследований позволяют предполагать, что идентичные HLA-антигены у супругов влияют на течение гестационного периода, вызывая снижение фертильности и повышение вероятности повторных самопроизвольных выкидышей. Наиболее сильная корреляция между идентичностью антигенов HLA родителей и рецидивирующими выкидышами выявлена при наличии у родителей 3-х и более совпадений по антигенам.
В ряде исследований показано, что идентичность супругов по антигенам HLA является одной из причин снижения фертильности [10]. При наличии у супругов идентичных антигенов HLA отмечается высокий риск появления гомозиготного потомства, что может являться причиной врожденной патологии. Так, при оценке взаимосвязи гомозиготности и дефектов развития нервной трубки у плода, была выявлена высокая частота идентичности гаплотипов HLA у родителей [148].
Исследование связи антигенов HLA I и II классов с различными нарушениями репродукции выявило положительную взаимосвязь, например, антигена В41 у пациенток с привычным невынашиванием беременности, антигенов В18 и В27 – с бесплодием и неразвивающейся беременностью у женщин славянского происхождения [9].
С момента появления ВРТ перенос эмбриона в полость матки производился на стадии 2-8 бластомеров (2-3 день), что при естественной беременности соответствует моменту его нахождения в маточной трубе. Перенос эмбриона на стадии бластоцисты является более физиологичным, поскольку в организме человека эмбрион попадает в эндометрий спустя 5-6 дней после оплодотворения, именно на стадии морулы-бластоцисты, когда уже произошла активация генома эмбриона.
Исследования показали, что при переносе бластоцисты в полость матки частота имплантации и рождения живых детей значительно выше, чем при переносе эмбриона на 2-3-й день развития [45, 83]. Поэтому полагают, что парам с повторными неудачами имплантации целесообразно проводить перенос эмбриона в полость матки на стадии бластоцисты.
Считают, что непосредственно перенос эмбриона является основным моментом цикла ЭКО, особенно при повторных неудачах имплантации. Анализ рандомизированных исследований выявил, что частота наступления беременности значительно выше при переносе эмбриона под контролем УЗИ, при котором эмбрион помещается в среднюю часть полости матки [172]. В одной работе было показано, что применение фибринового клея вдвое повышает частоту наступления беременности, однако этот метод не получил широкого распространения [90]. Предположительно перенос большего количества эмбрионов повышает эффективность у женщин с повторными безуспешными попытками ЭКО, однако, до сих пор нет опубликованных данных о сравнительных исследованиях.
Еще одним фактором, препятствующим имплантации, является нарушение разрыва наружной оболочки эмбриона (zona pellucida) вследствие ее утолщения и уплотнения [69, 190]. Для облегчения выхода эмбриона из оболочки были разработаны различные виды вспомогательного хэтчинга: механический (рассечение оболочки острой микропипеткой), химический (с применением соляной кислоты) и с использованием лазера. Было показано, что применение хэтчинга при неудачных попытках ЭКО в анамнезе значительно повышает частоту имплантации и наступления беременности [38, 55, 169].
Наличие у эмбриона хромосомной патологии также может являться причиной срыва имплантации. Исследования выявили, что у пациентов с повторными неудачами имплантации частота развития эмбрионов с хромосомной патологией выше по сравнению с группой контроля и превышает 50% даже при наличии хороших морфологических характеристик [49, 112, 117, 194]. Применение преимплантационной генетической диагностики с исследованием 3-8 хромосом позволяет провести отбор эмбрионов для переноса без патологии по исследуемым хромосомам и повысить уровень имплантации у данной категории пациентов [112, 114, 118, 156].
Предварительное обследование супружеской пары
Предварительное обследование супружеской пары, согласно приказу Минздрава РФ от 26 февраля 2003 г. № 67 «О применении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в терапии женского и мужского бесплодия», проводили в амбулаторных условиях ФГБУ «НЦ АГиП им. академика В.И.Кулакова» и/или по месту жительства и включало общеклинические и специальные методы:
1. Общее и специальное гинекологическое обследование;
2. Ультразвуковое исследование органов малого таза;
3. Определение группы крови и резус-фактора;
4. Клинический анализ крови;
5. Биохимический анализ крови;
6. Гемостазиограмма;
7. Анализ крови на сифилис, ВИЧ, гепатиты В и С;
8. Исследование флоры из уретры и цервикального канала, степень чистоты влагалища;
9. Цитологическое исследование мазков шейки матки и кольпоскопия;
10. Инфекционное обследование (хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, вирус простого герпеса, цитомегалия, токсоплазмоз, краснуха);
11. Анализы крови на ФСГ, ЛГ, Е2, Прл, Т, кортизол, П, ТТГ, СТГ, Т4, Т3;
12. Заключение терапевта о состоянии здоровья и возможности вынашивания беременности;
13. Заключение других специалистов по показаниям;
14. Спермограмма мужа.
В соответствии с критериями включения и исключения всем супружеским парам проводили:
1. Определение кариотипа;
2. Исследование антигенов системы HLA I и II классов;
3. Медико-генетическое консультирование.
Сбор анамнеза включал сведения о наследственности, перенесенных инфекционных и соматических заболеваниях. При оценке менструального цикла обращали внимание на возраст менархе, регулярность и продолжительность цикла, объем и длительность менструации, дисменорею. Также учитывали количество, осложнения и исходы предыдущих беременностей. Индекс массы тела рассчитывали по формуле: ИМТ = масса тела/рост (кг/м2). Оценивали оперативные вмешательства на органах малого таза в анамнезе, с предоставлением выписки, содержащей сведения об объеме операции, течении послеоперационного периода и результатах гистологического исследования.
Во время гинекологического исследования обращали внимание на степень развития и особенности строения наружных половых органов, характер оволосения, состояние шейки матки. При бимануальном исследовании оценивали форму и размер матки, ее подвижность и смещение, выявляли болезненность при пальпации. Определяли наличие образований в области придатков матки и выраженность спаечного процесса. Для осмотра шейки матки использовали расширенную кольпоскопию. Исследовали мазки на онкоцитологию.
Сбор анамнеза мужа пациентки включал возраст, сведения о наследственности и перенесенных соматических, венерических, психических и воспалительных заболеваниях. Также учитывали наличие профессиональных и других вредностей. Проводили исследование спермограммы.
Гормональное обследование проводили в лаборатории эндокринологии ФГБУ «НЦ АГиП им. академика В.И.Кулакова» (руководитель лаборатории –д.б.н. Иванец Т.Ю.). Показатели концентрации гормонов в сыворотке крови в I и II фазах менструального цикла представлены в таблице 3.
Исследование органов малого таза проводили при опорожненном мочевом пузыре трансвагинальным датчиком с частотой 7,5 МГц с обязательным использованием одноразового презерватива на аппарате «Brulle Kierre» «Sonoline Sienna» (Siemens, Германия). Определяли размеры матки, толщину и структуру эндометрия на 3-5 день менструального цикла (МЦ), а также в период «окна имплантации», количество антральных фолликулов и наличие объемных образований в яичниках.
При стимуляции суперовуляции по «длинному» протоколу УЗ-исследование выполняли на 20-21 день МЦ перед началом десенситизации гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы, на 3-5 день МЦ перед введением гонадотропинов и через 5 дней от начала их введения. Последующий УЗ-мониторинг проводили ежедневно или через день до назначения овуляторной дозы ХГ.
Для определения кариотипа обоим супругам, включенным в программу ЭКО, проводили цитогенетическое исследование лимфоцитов периферической крови, культивируемых в условиях in vitro, на препаратах метафазных хромосом в соответствии со стандартной процедурой [111]. Материал для анализа забирали одноразовыми шприцами, обработанными гепарином в концентрации 100 ЕД/мл, посредством пункции локтевой вены.
У мужчин, включенных в исследование, определяли режим половой жизни перед забором эякулята для спермиологического анализа, который выполняли дважды по методу, рекомендованному ВОЗ (2010 г.).
Оценивали такие показатели, как количество эякулята, его цвет и pH, вязкость и время разжижения, количество сперматозоидов в 1 мл и их общее количество в эякуляте, морфологические характеристики сперматозоидов и характер их подвижности, а также наличие незрелых половых клеток и количество лейкоцитов. В зависимости от результатов спермиологического анализа пациентов распределяли по группам, согласно рекомендациям ВОЗ. Так, нормозооспермией является образец эякулята объемом не менее 1,5 мл, в котором концентрация сперматозоидов не менее 15 млн в 1 мл эякулята, общее количество сперматозоидов не менее 39 млн и общая подвижность не менее 40%, при этом сперматозоиды с прогрессивным движением составляют не менее 32%; жизнеспособность сперматозоидов не менее 58%, а содержание сперматозоидов с нормальной морфологией – не менее 4%
Характеристика клинико-анамнестических данных пациенток, включенных в исследование
Все обследованные пациентки имели женский тип телосложения, правильно развитые вторичные половые признаки. Характеристика роста и веса женщин, включенных в исследование, представлены в таблице 5.
Как видно из представленных данных, средний рост женщин в 3-х группах составил 166,9±5,9 см, при этом статистически значимых различий между Рисунок 13 - Распределение обследованных пациенток по росту. группами выявлено не было (p=0,116), (рис. 13). Средний вес составил 66,3±9,2 кг, при этом показатели не различались между группами (p=0,438), (рис. 14). Индекс массы тела (ИМТ) был в пределах нормы (среднее значение 22,5±1,4) у 86 женщин (61,4%); снижение массы тела (ИМТ — 18,9±1,1) было выявлено у 9 женщин (6,4%), избыточная масса тела (ИМТ — 27,2±2,5) — у 45 женщин (32,2%), при этом статистически значимых различий между группами отмечено не было (p=0,868).
Для определения возрастного распределения в исследуемых группах пациенток мы произвели расчет средних величин данных показателей. Возрастная характеристика супружеских пар представлена в таблице 6. Средний возраст обследованных мужчин составил 37,3±6,1, при этом не было отмечено статистически достоверных различий между группами (p=0,96).
Средний возраст обследованных пациенток в 3-х группах исследования составил 35,2±5,7, при этом статистически значимых различий между данными показателями в группах не выявлено (р=0,99). Доля пациенток моложе 35 лет составила 52,8% , старше 35 лет — 47,2% (рис. 15).
Согласно данным, представленным на рис. 15, медианы в трех группах оказались равны (35 лет). С учетом графического изображения возраста пациенток, ориентировочного равенства среднего арифметического и медианы данных переменных, а также симметричности относительно средних значений минимальных и максимальных значений, распределение данных переменных можно считать близким к нормальному.
Характеристика менструальной функции пациенток, включенных в исследование, представлена в таблице 7 и на рис. 16.
Анализ параметров менструальной функции пациенток, включенных в исследование, показал, что на момент обследования у всех женщин (100%) был регулярный менструальный цикл. Средний возраст менархе в 3-х группах исследования составил 13,2±1,3 лет, при этом статистически значимых различий между группами выявлено не было (p=0,508). Раннее менархе отмечено у 9,3% женщин, позднее менархе — у 14,3%. Длительность менструального цикла варьировала от 21 до 34 дней, составив в среднем 28,3±2,6 дней, при этом статистически значимых отличий в группах отмечено не было (p=0,768). Продолжительность менструального кровотечения составила в среднем 4,7±1,2 дня, варьируя от 3 до 8 дней.
У пациенток, включенных в исследование, длительность бесплодия составила в среднем 5,8±4,2 (от 1 до 18 лет), при этом статистически значимых различий между группами выявлено не было (p=0,126). Данные о длительности бесплодия у пациенток, включенных в исследование, представлены в таблице 8 и на рис. 17.
Данные ПД эмбрионов у пациенток основной группы с 2-мя и более неэффективными попытками ЭКО в анамнезе и I группы сравнения с первой попыткой ЭКО
Учитывая сходные параметры фолликуло-, оогенеза и раннего эмбриогенеза у женщин основной группы и I группы сравнения с ПД, мы посчитали важным уделить особое внимание хромосомной структуре эмбрионов. Поэтому на втором этапе работы проводили исследование эмбрионов на анеуплоидии хромосом X, Y, 13, 18 и 21 FISH методом.
Преимплантационную диагностику эмбрионов проводили у 45 женщин основной группы с 2-мя и более неэффективными попытками ЭКО (24 моложе 35 лет и 21 старше 35 лет) и 46 пациенток I группы сравнения (24 моложе 35 лет и 22 старше 35 лет) с первой попыткой ЭКО.
Пригодными для биопсии бластомеров оказались 163 эмбриона у женщин основной группы и 175 эмбрионов — I группы сравнения. Как уже говорилось в главе «Материалы и методы исследования», оценку качества эмбрионов проводили на 3-й день культивирования. Эмбрионами «хорошего» качества, биопсия бластомеров которых не приводит к последующей остановке их развития, являются эмбрионы, имеющие бластомеры одинакового размера с признаками компактизации и не содержащие вакуолей в цитоплазме. Результаты ПД эмбрионов представлены в таблице 18.
Полученные нами данные показали, что частота патологии эмбрионов по исследуемым хромосомам варьировала от 31,2% до 50,6% в зависимости от возраста пациенток и количества циклов ЭКО в анамнезе. Было отмечено, что количество эмбрионов с хромосомной патологией оказалось выше у пациенток старше 35 лет по сравнению с более молодыми (50,6% и 33,3% соответственно в основной группе; 42,9% и 31,2% соответственно в группе сравнения). При этом у пациенток с 2-мя и более неэффективными циклами ЭКО в анамнезе частота патологии эмбрионов была незначительно выше, чем у пациенток с первым циклом ЭКО (на 2,1% у пациенток моложе 35 лет и 7,7% у пациенток позднего репродуктивного возраста). Диагностика эмбрионов на патологию по исследуемым хромосомам выявила, что во всех подгруппах превалировали нежизнеспособные эмбрионы, перенос и дальнейшая имплантация которых привели бы к прерыванию или остановке развития беременности. Доля данных эмбрионов варьировала от 55,6% до 60,0%.
Распределение эмбрионов пациенток по данным ПД в двух группах исследования в зависимости от возраста представлено на рис. 29 и 30.
Статистический анализ показал, что различия по частоте патологии эмбрионов в основной группе у женщин моложе 35 лет и старшего репродуктивного возраста оказались статистически значимыми (p=0,025), при этом частота патологии по исследуемым хромосомам у эмбрионов женщин старше 35 лет оказалась почти в 1,5 раза выше.
Нами был проведен корреляционный анализ частоты анеуплоидии эмбрионов в зависимости от количества полученных зрелых ооцитов. Было выявлено, что частота хромосомной патологии эмбрионов находится в прямой зависимости от количества полученных ооцитов (коэффициент корреляции 0,436, p 0,01) и возрастает при получении более 8 ооцитов (рис. 31 и 32).
Известно, что с увеличением возраста мужчины показатели спермограммы ухудшаются, что не может не оказывать негативного влияния на исходы программы ЭКО. Мы проанализировали влияние возраста мужчин с нормальными показателями спермограммы на частоту хромосомной патологии эмбрионов. Было отмечено, что частота патологии находится в прямой зависимости от возраста (коэффициент корреляции 0,397, p 0,01) и увеличивается после 33 лет, превышая 50,0% после 38 лет (рис. 33).Таким образом, полученные нами данные позволяют говорить о целесообразности применения более «мягких» схем стимуляции у пациенток молодого возраста с высоким овариальным резервом для снижения вероятности хромосомной патологии эмбрионов, а также рекомендовать проведение ПД эмбрионам женщин моложе 35 лет при получении более 8 ооцитов и возрасте супруга старше 38 лет.
Для выявления структуры хромосомной патологии мы провели анализ полученных данных по каждой хромосоме и их комбинациям. При этом все эмбрионы с патологией по исследуемым хромосомам (110) в обеих группах были поделены на нежизнеспособных и жизнеспособных.
Структура хромосомной патологии исследованных нежизнеспособных эмбрионов представлена в таблице 20.
Как видно из представленных данных, основную часть в хромосомной патологии нежизнеспособных эмбрионов, имплантация которых привела бы к прерыванию или остановке развития беременности, составила патология аутосом – 60,3% (47 из 78). При этом на долю патологии одной аутосомы без трисомий пришлось 44,7% (21 из 47), патология двух аутосом была отмечена в 38,3% (18 из 47), патология трех аутосом составила 17,0% (8 из 47). Патология хромосомы 13 была отмечена в 38,1% (8 из 21), хромосомы 18 – в 33,3% (7 из 21), хромосомы 21 – в 28,6% (6 из 21). Одновременное наличие патологии хромосом 13 и 21 наблюдали в 50,0% (9 из 18), хромосом 13 и 18 – в 33,3% (6 из 18), хромосом 18 и 21 было отмечено в 16,7% (3 из 18). Значительную часть составила сочетанная патология аутосом и гоносом – 33,3% (26 из 78). В равной степени были выявлены гаплоидия и полиплоидия, на чью долю пришлось по 2,6% (по 2 из 78). Патология гоносом составила 1,2% (1 из 78). Графическое изображение полученных данных представлено на рис. 34-36.
