Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ВРТ и молекулярный профиль гамет (обзор литературы) 13
1.1 Перспективы неинвазивной диагностики состояния ооцита и эмбриона 13
1.1.1 Роль морфологической оценки ооцита в программе ЭКО и ПЭ... 16
1.1.2 Оценка эмбриона по морфологическим параметрам 18
1.1.3 Влияние интрафолликулярного окружения на качество ооцита... 22
1.1.4 Роль ооцита в процессе фолликулогенеза 26
1.1.5 Роль гранулезных и кумулгосных клеток в оогенезе 28
1.1.6 Исследование генной экспрессии в гранулезных и кумулюсных клетках 33
1.1.7 Роль цитокинов в процессах фолликуло- и оогенеза 36
1.2 Спермальные мРНК как потенциальные биомаркеры исхода программ ВРТ 44
1.2.1 Семейство интегральных мембранных протеинов 48
1.3 Клинические аспекты селективного переноса одного эмбриона с позиции акушерства, перинатологии, эмбриологии 50
1.3.1 Клинико-социальная значимость многоплодия 53
Глава 2. Материал и методы исследования 63
2.1 Материал исследования 63
2.2 Методы исследования 69
2.3Молекулярно-генетические исследования в день трансвагинальной пункции яичников 83
2.4 Оценка эффективности программы ЭКО и ПЭ 85
2.5 Статистический анализ результатов исследования 86
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 90
3.1 Клинико-анамнестическая характеристика пациенток 90
3.2 Сравнительная оценка циклов стимуляции суперовуляции у обследованных женщин 99
3.3 Сравнительный анализ эффективности ЭКО и ПЭ 112
3.4 Отдаленные результаты проведения ЭКО и ПЭ 116
3.5 Сравнительный анализ результатов молекулярно-генетического исследования фолликулярной жидкости 11'
3.6 Сравнительная характеристика спермальных факторов 134
3.7 Прогнозирование наступления беременности по молекулярно-генетическим характеристикам фолликулярной жидкости и спермы... 143
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 152
Выводы 159
Практические рекомендации 161
Список литературы 162
- Оценка эмбриона по морфологическим параметрам
- Материал исследования
- Клинико-анамнестическая характеристика пациенток
- Сравнительная характеристика спермальных факторов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Улучшение репродуктивного здоровья является стратегической задачей здравоохранения России (Г.Т.Сухих, Л.В.Адамян, 2012). В настоящее время модернизируются подходы к диагностике и лечению бесплодных супружеских пар, стремительно развивается изучение молекулярно-генетических процессов, лежащих в основе реализации процесса репродукции человека. Совершенствование метода экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО и ПЭ), развитие его новых направлений способствуют повышению эффективности лечения бесплодия (Н.Е.Русанова, 2010, M.Brandes, 2010).
Применение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) привело к увеличению доли многоплодных беременностей (J.M.R.Gerris, 2002, A.Pinborg, 2005, C.M.Magli, 2008). Учитывая данные об осложнениях, связанных с многоплодием, отмечается тенденция к снижению количества переносимых эмбрионов в циклах ЭКО (В.И.Краснопольский, 2009, Т.А.Назаренко, 2010, U.B.Wennerholm, 2009). Согласно данным мониторинга за ВРТ европейского общества по репродукции человека и эмбриологии (EIM ESHRE), во многих странах внедряется стратегия селективного переноса одного эмбриона (elective single embryo transfer, eSET) (T.Coetsier, M.Dhont, 1998, J.de Mouzon, 2010, A.Maheshwari et al, 2011).
Одним из ведущих факторов успешного проведения лечения бесплодия методом ЭКО и ПЭ является выбор эмбриона с высоким имплантационным потенциалом (О.Л.Тишкевич, 2007). По мнению L.Scott, 2003, качество эмбриона определяется состоянием гамет. В процессе фолликулогенеза происходит взаимодействие ооцита с окружающими клетками через ряд регуляторных молекул - цитокинов, факторов роста, про- и антиапоптотических факторов, ферментов (М.В.Яманова, 2004, К.Е.Серебренникова, 2010, F.Cillo, 2007, P.Feuerstein, 2007, O.Guzeloglu-Kayisli et al., 2009). Изменение биоактивности сателлитных клеток влияет на качество ооцита и дальнейшее развитие эмбриона (T.Adriaenssens, 2010, Z.Huang, D.Wells, 2010).
Процессы раннего эмбрионального развития прежде рассматривались исключительно с позиции перехода от ооцита к эмбриону (oocyte-to-embryo transition), а сперматозоиду отводилась роль доставки дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) (Y.J.Menezo, 2006, J.-P.Dadoune, 2009). Позднее были получены данные о функциональной значимости спер-мальных матричных рибонуклеиновых кислот (мРНК) для раннего эмбриогенеза (B.R.Emery, D.T.Carrell, 2006, M.Depa-Martynow et al., 2007, T.C.Douglas, 2010). Существуют данные о том, что нарушение функции протаминов, осуществляющих организацию спермального хроматина и обеспечивающих взаимодействие материнского и отцовского геномов, влияет на раннее развитие эмбриона (D.Miller et al., 2010). Немаловажным для программ ЭКО и ПЭ является пенетрационная способность сперматозоида, зависимая от спермальных белков семейства фертилинов, или ADAM (a disintegrin and metalloprotease domain) (SA.Krawetz et al, 2007).
Принимая во внимание то, что разработка и внедрение персонифицированных и не-инвазивных методов диагностики при лечении бесплодия является актуальным, необходимо определить и научно обосновать значение молекулярно-генетических методов для
совокупной с морфометрическими данными комплексной оценки гамет, формирующих эмбрион, изучить эффективность и целесообразность селективного переноса одного эмбриона в программе ЭКО.
Таким образом, целью настоящего исследования явилась оптимизация программы экстракорпорального оплодотворения с учетом морфологических и молекулярно-генетических характеристик гамет при селективном переносе эмбрионов.
Задачи исследования
-
Провести сравнение клинико-анамнестических данных у исследуемых групп больных.
-
Провести сравнительную характеристику циклов стимуляции при селективном переносе одного эмбриона, переносе единственного эмбриона и переносе двух эмбрионов по параметрам фолликулогенеза, стероидогенеза и раннего эмбриогенеза.
-
Проанализировать эффективность реализации программы ЭКО и ПЭ у пациенток с селективным переносом одного эмбриона, переносом единственного эмбриона и переносом двух эмбрионов по частоте имплантации, наступления беременности, многоплодных беременностей и самопроизвольных выкидышей.
-
На основании определения профиля экспрессии мРНК генов факторов роста, про- и антиапоптотических факторов, ферментов, молекул HLA-G в клетках фолликулярной жидкости и протаминов и фертилина-Р в сперме разработать математические модели прогнозирования исходов ЭКО и ПЭ.
-
Разработать практические рекомендации (алгоритм) по стратегии переноса эмбрионов в полость матки на основании комплексной оценки качества гамет и эмбрионов при применении молекулярно-генетических методов исследования фолликулярной жидкости и спермы.
Научная новизна
На основании проведенного исследования определена эффективность лечения бесплодия при использовании селективного переноса одного эмбриона в сравнении с переносом единственного эмбриона и переносом двух эмбрионов. Представлена и научно обоснована целесообразность применения селективного переноса одного эмбриона женщинам до 35 лет с нормальным овариальным резервом, наличием не более 2-х неудачных циклов ЭКО и ПЭ в анамнезе при фертильной или субфертильной сперме супруга. Показатели имплантации, наступления беременности у этих пациенток сравнимы с аналогичными при переносе двух эмбрионов при общем снижении частоты многоплодной беременности в 10 раз по сравнению с переносом двух эмбрионов.
Впервые определены роль и место молекулярно-генетических методов исследования при проведении комплексной оценки качества гамет в программе ЭКО и ПЭ. На основании изучения уровня экспрессии мРНК факторов роста, про- и антиапоптотических, ферментов, молекул HLA-G в клетках фолликулярной жидкости, протаминов и фертилина-Р в сперме выявлена их значимость в исходах ЭКО и ПЭ.
Практическая значимость
В результате проведенной работы на основании комплексной оценки качества гамет и эмбрионов при применении молекулярно-генетических методов исследования фолликулярной жидкости и спермы в программах ВРТ разработан алгоритм стратегии переноса эмбрионов в полость матки.
На основании данных молекулярно-генетического исследования фолликулярной жидкости, спермы в день трансвагинальной пункции яичников предложены способы прогнозирования наступления или отсутствия беременности в результате проведения программы ЭКО и ПЭ.
Положения, выносимые на защиту:
-
Эффективность реализации программы ЭКО при селективном переносе одного эмбриона в полость матки сравнима с таковой при переносе двух эмбрионов у пациенток в возрасте до 35 лет с трубно-перитонеальным и/или мужским фактором бесплодия, имеющих нормальный овариальный резерв, не более двух неэффективных циклов ЭКО и ПЭ в анамнезе, фертильную и/или субфертильную сперму супруга.
-
Наибольшую значимость для прогнозирования исхода ЭКО и ПЭ имеет комплексное определение уровня экспрессии мРНК факторов роста AREG, EREG, IGF-1, IGFBP-4, антиапоптотического фактора BIRC-5 в клетках фолликулярной жидкости, ADAM-2, соотношения уровня экспрессии мРНК PRM-2:PRM-1 в сперме в день ТВП. Неблагоприятный прогноз программ ВРТ ассоциирован с уменьшением экспрессии мРНК генов ADAM-2, PRM-1 иРРМ-2.
-
Для индивидуального определения стратегии переноса эмбрионов в полость матки при проведении программы ЭКО и ПЭ необходима комплексная оценка гамет по морфометрическим и молекулярно-генетическим характеристикам в сочетании с данными о морфологических характеристиках эмбриона. «Благоприятный» прогноз позволяет произвести селективный перенос одного эмбриона, «неблагоприятный» - двух.
-
Исследование молекулярно-генетических характеристик гамет по профилю экспрессии мРНК факторов роста, про- и антиапоптотических факторов, ферментов, молекул HLA-G, экспрессируемых клетками фолликулярной жидкости, спермальных факторов позволяет на основании разработанных математических моделей с диагностической эффективностью более 80% осуществить прогнозирование наступления беременности в программе ЭКО и ПЭ.
Личный вклад автора Автором проводилось обследование, лечение методом ЭКО и ПЭ пациентов, вошедших в исследование, выполнялся забор биологического материала, осуществлялось участие в постановке проб на лабораторном этапе, обобщение, систематизация, статистический анализ и публикация полученных результатов.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01-«акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют обла-
сти исследования специальности, конкретно пунктам 4 и 5 паспорта акушерства и гинекологии.
Апробация работы
Основные положения диссертации и результаты работы доложены на IV международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2011), V Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Геленджик, 2011), XXI Международной конференции Российской ассоциации репродукции человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Санкт-Петербург, 2011), Российско-швейцарском Медицинском форуме (Москва, 2011), цикле семинаров повышения квалификации врачей «Репродуктивная медицина» (Москва, 2012), научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее ВРТ (памяти профессора Б.В.Леонова)» (Москва, 2013), The 4th International IVI Congress «Reproductive medicine and beyond» (Valencia, Spain, 2011), The 14th World Congress on Human Reproduction (Melbourne, Australia, 2011), The 1st Biomarker Meeting in Reproductive medicine: emergence of a new field «The Ovary, Gametes, Embryo and Endometrium» (Valencia, Spain, 2012).
Апробация диссертации проведена на межклинической конференции 22 ноября 2012 г. и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России 03 декабря 2012 г., протокол № 17.
Внедрение результатов работы в практику
Результаты исследования внедрены в клиническую практику отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.
Материалы работы используются для практических занятий и лекций со слушателями семинаров Центра, аспирантами и клиническими ординаторами.
По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в т.ч. 4 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных ВАК России.
Структура и объем диссертации
Оценка эмбриона по морфологическим параметрам
В настоящее время в клинической практике производится оценка качества эмбрионов по морфологическим характеристикам на основании системы динамического наблюдения (sequential embryo selection SES), схематически представленной на рисунке 1 [58, 62, 86, 94, 102, 118, 270].
Представляет интерес морфологическая оценка качества эмбрионов на основании кумулятивного эмбрионального счета (cumulative embryo score, CES), разработанного Steer C.V. и соавт. в 1992г. и модифицированного в 2007г. группой ученых под руководством Holte J. путем добавления к CES интегративного морфологического описания дробящихся эмбрионов [86, 270]. Данная классификация оценивает совокупность скорости дробления эмбрионов, симметричности бластомеров, степени цитоплазматической фрагментации, мультинуклеарности бластомеров и присваивает эмбриону баллы по каждому критерию.
Для оценки эмбриона 1-ых суток дробления используются методики определения структуры «halo», морфологии пронуклеусов, предшественников ядрышек (nucleolar precursor bodies, NPB), [241, 266].
Исследования внутрицитоплазматического движения показали появление полупрозрачной зоны у перикортикальной мембраны («halo» - сияние). Этот динамический процесс, описанный как волнообразная активность, или цитоплазматическое волнение, происходящее в течение перисингамической стадии, свидетельствует о полноценности эмбриона на стадии зиготы [241].
Мужской и женский пронуклеусы появляются по периферии ооцита и вращаются относительно центра 16-18 часов после оплодотворения. Пронуклеусы должны иметь одинаковый размер. При различии в размерах пронуклеусов высока вероятность анеуплоидии [266]. Для NPB предложена методика оценки следующих параметров: числа, позиции, расположения, размера. Равное расположение относительно оси перекрытия пронуклеусов, оптимальное количество (5-7), размер NPB - коррелируют с возможностью развития эмбриона до стадии бластоцисты [67, 241, 291].
В течение периода развития ооцита, со стадии примордиального до Mil, нуклеоли активно синтезируют протеины и распределяют его по определенным зонам ядра до включения собственного генома эмбриона. Нуклеоли являются центрами продукции мРНК [189]. Ростовые факторы и регуляторные белки также продуцируются в нуклеолях. Эти участки ядра являются нуклеолярными организационными регионами (nucleolar organization regions, NOR) ядра. Гетерохроматин пяти хромосом 13, 14, 15, 21, 22 сцеплен с NOR. Именно с этими хромосомами связана наибольшая частота анеуплоидий, что подчеркивает важность строгой компартментализации ядра, определяющей качество ооцита и эмбриона [177, 196]. Нуклеоли состоят из 3 функциональных компонент:
- плотного фибриллярного комплекса DFC (dense fibrillic complex), который важен для процесса транскрипции;
- фибриллярного комплекса FC (fibrillic component), который участвует в инактивации транскрипционных факторов;
- гранулярно-цитоплазматического комплекса GC (granular-cytoplasmatic component) [189].
Визуализация данных структур свидетельствует о функционировании NPB (т.к. они и являются собственно FC регионами) и указывает на присутствие гетерохроматина 13, 14, 15, 21, 22 хромосом в веретене деления. Когда хроматин конденсируется в митотическое веретено, что происходит к моменту пенетрации сперматозоида, появляются NPB. Появление одного пронуклеуса может означать быструю или, наоборот, отложенную конденсацию хроматина в ядре, что связано с аномалиями развития, а именно анеуплоидиями [93, 189, 247, с.21,266, 275].
Работами многих авторов показано, что именно первые сутки дробления определяют качество эмбриона [93, 189]. Оптимальным является время вступления в первое митотическое деление через 23-24 часа после инсеминации ооцитов, однако, оно может варьировать в сторону увеличения до четырех часов, что, не является плохим прогностическим признаком [93]. После проникновения сперматозоида формируется пронуклеусы, оплодотворение завершается первым митотическим делением и формированием двухклеточного эмбриона.
Расположение веретена деления влияет на дальнейшее дробление. Если веретено поляризовано, то это может приводить к формированию эмбриона с неравными по размеру бластомерами. Аномальный цитокинез может приводить к патологической бластуляции, выражающейся в различиях размеров клеток во внутренней клеточной массе (inner cell mass, ICM) более чем на 30%, дефектам дальнейшего развития [58, 247, 253, 282]. На четырехклеточной стадии один из четырех бластомеров продолжает свое развитие в клетки, продуцирующие хорионический гонадотропин (ХГ), что является сигналом для эндометрия и подготовки к имплантации [247, с.22]. Достижение эмбрионом стадии 4-х бластомеров происходит через короткую трехклеточную стадию. Длительная задержка на стадии трех, четырех бластомеров является неблагоприятным прогностическим признаком [58]. Важным для развития эмбриона является наличие ядра в каждом бластомере. Отсутствие ядра может свидетельствовать о том, что бластомер находится в переходной стадии. Через 42-44 часа после оплодотворения все бластомеры должны иметь ядра. Фрагментация ядер бластомеров коррелирует с низким качеством эмбриона и неблагоприятным исходом ЭКО и ПЭ [58, 241, 266]. Увеличение количества ядер происходит при аномальном кариокинезе или вследствие аномальной сегрегации хромосом, более 70% мультинуклеарных эмбрионов являются анеуплоидными [241].
По достижении четырехклеточной стадии бластомеры уменьшаются в 2 раза и до стадии 8-ми бластомеров не увеличиваются в размерах. Оценка эмбриона происходит на 3-й сутки дробления (64-66 часов после инсеминации ооцитов) в течение перехода от шести к восьми бластомерам, что может происходить очень быстро. На этой стадии исследуют число бластомеров (в норме 6-8), фрагментацию (в норме отсутствует или менее 10%), размер и соотношение бластомеров, количество ядер в бластомерах [93, 179].
На 5-е сутки дробления (113-116 часов после инсеминации ооцитов) происходит формирование бластоцисты. Работами многих авторов показана связь морфологии бластоцисты с исходом программ ВРТ [247, 291]. Эмбрион, развивающийся аномально на 1-3-е сутки дробления, может формировать нормальную по морфологии бластоцисту [82]. Признаками бластоцисты хорошего качества являются неповрежденные клетки, отсутствие гранулярных включений, хороший контакт между клетками, четкие контуры у 80% клеток, оптимальное соотношение бластоцели и клеточной массы. Наиболее используемой в настоящее время является классификация бластоцист по Gardner D.K. и Schoolcraft W.B. (1999г.) (приведена в главе «Материал и методы») [139].
Таким образом, предварительный анализ литературных данных показал, что морфологическая оценка играет основную роль в определении качества ооцитов и эмбрионов в процессе динамического наблюдения in vitro. Несмотря на это, субъективная оценка должна дополняться данными, характеризующими гаметы и эмбрион с морфофункциональной позиции. Применение современных методов позволяет неинвазивно и комплексно подходить к выбору эмбриона лучшего качества в программе ЭКО и ПЭ, принимая во внимание исходный статус гамет и клинико-анамнестические данные супружеских пар с бесплодием.
Материал исследования
В соответствии с целью исследования и поставленными для ее решения задачами в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия (руководитель - доктор медицинских наук Е.А.Калинина) ФГБУ «НЦ АГиП им. академика В.И.Кулакова» Министерства Здравоохранения Российской Федерации (МЗ РФ) (директор - академик РАМН, заслуженный деятель наук, профессор Г.Т. Сухих) было обследовано 150 супружеских пар, обратившихся для проведения программы ЭКО и ПЭ.
Критериями включения супружеских пар в исследование являлись:
Трубно-перитонеальный и/или мужской фактор бесплодия;
Возраст пациенток до 35 лет;
Наличие матки, анатомически и функционально способной к вынашиванию беременности;
Отсутствие патологии эндометрия по данным ультразвукового исследования (УЗИ);
Наличие яичников, доступных для аспирации фолликулов;
Нормальный или высокий овариальный резерв;
Наличие двухфазного регулярного менструального цикла;
Отсутствие противопоказаний к стимуляции суперовуляции;
Отсутствие соматических заболеваний, при которых противопоказаны вынашивание беременности и роды;
Отсутствие подострой или острой форм сексуально-трансмиссивных заболеваний и инфекций, входящих в TORCH-комплекс: токсоплазмы (Toxoplasma gondii), краснухи (Rubella virus), цитомегаловируса (Cytomegalovirus), вируса простого герпеса (Herpes simplex virus), хламидийной (Chlamydia trachomatis), ypea- и микоплазменной инфекции;
He более двух неэффективных попыток ЭКО/ИКСИ в анамнезе;
Фертильная или субфертильная сперма супруга;
Наличие не менее одного эмбриона, пригодного для переноса в полость матки;
Информированное письменное согласие пациентки на участие в исследовании.
Критериями исключения супружеских пар из исследования являлись:
Пациентки с противопоказаниями для проведения программы ЭКО и ПЭ, вынашивания беременности;
Миома матки больших размеров;
Наружный генитальный эндометриоз II и более стадии распространения;
Низкий овариальный резерв;
Синдром поликистозных яичников;
Оплодотворение с использованием криоконсервированной спермы или полученной хирургическими методами, такими, как TESA/PESA;
Выраженная олигоастенотератозооспермия (по нормативам ВОЗ, 2010г.);
Наличие изменений кариотипа супругов, требующих проведения преимплантационной генетической диагностики.
Всем пациентам были полностью изложены аспекты проводимого лечения, необходимого обследования, проведена беседа об эффективности реализации программы ЭКО и ПЭ при переносе 1 и 2 эмбрионов в зависимости от возраста, на основании данных литературы и опыта работы отделения. Получено информированное согласие от всех пациенток, принимавших участие в исследовании.
Процедура ЭКО состояла из следующих этапов: - отбор и обследование супружеских пар;
- стимуляция суперовуляции;
- трансвагинальная пункция фолликулов яичников с целью получения ооцитов;
- оплодотворение ооцитов с помощью стандартного ЭКО или ИКСИ;
- культивирование эмбрионов in vitro;
- перенос эмбрионов в полость матки;
- поддержка посттрансферного периода;
- диагностика беременности ранних сроков.
Данные этапы дополнялись проведением исследования образцов фолликулярной жидкости, аспирированных отдельно от каждого фолликула, исследованием образцов спермы, полученной в день трансвагинальной ТВП и используемой для оплодотворения, индивидуальным культивированием эмбрионов.
Всем пациенткам проводилось ЭКО со стимуляцией суперовуляции с применением препаратов рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (рФСГ), агонистов или антагонистов гонадотропин-рилизинг гормона. Подбор схемы стимуляции осуществлялся индивидуально, с учетом возраста, анамнеза женщины, предшествующих оперативных вмешательств на органах малого таза, её овариального резерва, уровня гонадотропных гормонов [27, 38].
Для объективного сравнения клинического этапа проведения программы ЭКО и ПЭ и исключения влияния на результат схем стимуляции в настоящем исследовании применялись три варианта стимуляции суперовуляции среди обследованных групп:
Протокол с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона (антГнРГ);
«Короткий» протокол с агонистами гонадотропин-рилизинг гормона (аГнРГ);
«Длинный» протокол с предварительной десенситизацией гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы с использованием препаратов аГнРГ.
В день проведения трансвагинальной пункции яичников и используемой для оплодотворения у супружеских пар с возможностью выбора эмбриона для переноса. Выделены две группы супружеских пар успешного (I группа) и неуспешного исхода (II группа), последняя, в свою очередь, была разделена на три подгруппы. К I группе, составившей группу контроля, были отнесены пациенты с благополучным результатом лечения бесплодия, который привел к рождению здорового ребенка (п=24). Среди исследуемых пациентов неуспешного завершения ЭКО и ПЭ была выделена Па группа пациентов, у которых в результате применения ВРТ наступила беременность, но закончилась самопроизвольным прерыванием беременности ранних сроков (до 11 недель) (п=13). Группу lib составили пациенты с биохимической беременностью, не подтвержденной далее ультразвуковыми данными, при которой на 14 день после переноса эмбрионов уровень Р-субъединицы хорионического гонадотропина ф-ХГ) составлял не менее 30 мМЕ/мл, т.н. «преэмбрионические потери» (п=24). К Не группе были отнесены женщины с отрицательным результатом, у которых уровень Р-ХГ составлял менее 20 мМЕ/мл (п=43) (рисунок 6).Изучение молекулярно-генетического профиля экспрессии мРНК ряда генов в образцах фолликулярной жидкости и спермы проводилось в лаборатории молекулярно-генетических методов (руководитель лаборатории молекулярно-генетических методов д.б.н. Трофимов Д.Ю).
С целью определения влияния экспрессии мРНК генов, указанных в таблице 2, в клетках ФЖ на качество ооцитов и частоту наступления беременности, а также для поиска связи между уровнем мРНК этих генов и исходом ВРТ, было собрано и подготовлено для исследования 587 образцов фолликулярной жидкости.
Клинико-анамнестическая характеристика пациенток
В соответствии с поставленными целью и задачами в исследование были включены 150 пациенток с трубно-перитонеальным и/или мужским фактором бесплодия в возрасте от 22 до 35 лет, с нормальным овариальным резервом, наличием не более двух неэффективных циклов ВРТ в анамнезе, фертильной или субфертильной спермой супруга, обратившихся для проведения программы ЭКО и ПЭ в отделение вспомогательных технологий в лечении бесплодия.
Было проведено 155 циклов стимуляции суперовуляции, в зависимости от количества перенесенных эмбрионов и возможности выбора эмбрионов пациентки были разделены на три группы: eSET, cSET, DET.
Возраст обследованных женщин варьировал от 22 до 35 лет и составлял в среднем 29,9 ± 0,3 лет (таблица 4).
Как представлено в таблице 5, возраст супругов пациенток варьировал от 25 до 50 лет и составлял в среднем 33,0 ± 0,5 года.
Распределение по возрасту в исследуемых группах женщин и мужчин не различалось при оценке с применением одномерного дисперсионного анализа ANOVA (р=0,761 и р=0,887, соответственно). Проверка по тесту Дункана на равенство дисперсий по возрасту женщин и мужчин также не выявила значимых различий (р=0,446 и р=0,610, соответственно).
При анализе соматического статуса у всех обследованных пациенток выявлено правильное телосложение, правильное развитие вторичных половых признаков. Данные о параметрах телосложения пациенток представлены в таблице 6.
Средний рост пациенток, включенных в исследование, составил 165,2 ± 4,6 см, средний вес - 62,1 ± 6,4 кг. У 92,3 % женщин ИМТ соответствовал норме от 18 до 25 кг/м" (среднее значение 22,3 ± 2,3 кг/м ), избыток массы тела (ИМТ 27,3 ± 1,0) отмечался у 12 (7,7 %), недостатка массы тела отмечено не было ни у одной пациентки. Статистических различий по весу, росту, индексу массы тела, рассчитанных по методу одномерного дисперсионного анализа ANOVA (р 0,05) с анализом по тесту Дункана, между группами не было обнаружено (р=0,168, р=0,476, р=0,545, соответственно). В ходе исследования у всех пациенток были детально проанализированы наследственность, перенесенные и имеющиеся заболевания, становление менструальной функции, акушерский и гинекологический анамнез. Данные о соматическом статусе женщин представлены в таблице 7.
Как видно из представленных данных статистически значимых различий по частоте встречаемости соматических заболеваний между пациентками исследуемых групп выявлено не было.
Причинами обращения за медицинской помощью по восстановлению фертильности с применением ВРТ у отобранных для исследования пациенток являлось наличие трубно-перитонеального и/или мужского факторов бесплодия. Бесплодие эндокринного генеза (обусловленного отсутствием овуляции), связанное с маточным или цервикальным факторами, идиопатического, иммунологического и других форм не входило в исследование в связи с наличием потенциально возможных причин, оказывающих значительное влияние на гаметы и раннее эмбриональное развитие. Включение в исследование мужского фактора было обусловлено двумя причинами: во-первых, наличием отклонений спермограммы от нормы в день проведения ТВП у некоторых супружеских пар с фертильной и субфертильной спермой на этапе предварительного обследования, что требовало проведения ИКСИ, а во-вторых - наличием невыраженных изменений спермограммы у пациентов с диагностированным мужским фактором бесплодия, проходивших перед проведением ЭКО лечение у андролога. На рисунке 12 показано распределение причин бесплодия среди обследованных групп.
Таким образом, в исследование были включены супружеские пары, где в 85% случаев имелся трубно-перитонеальный фактор бесплодия (у 127 пациенток). Межгрупповых различий по распределению причин бесплодия выявлено не было. Расчет хи-квадрата Пирсона показал отсутствие значимых различий как по трубно-перитонеальному фактору (р=0,990), так и по мужскому (р=0,196) и сочетанному (р=0, 618) факторам бесплодия.
Данные о перенесенных гинекологических заболеваниях и их частоте представлены в таблице 8.
Как видно из представленных данных по структуре гинекологической заболеваемости, у половины (54,6%) пациенток имелись хронические воспалительные заболевания органов малого таза в анамнезе, среди которых преобладал хронический сальпингоофорит (46,0%), у 51 (34,0%) ранее были выявлены ИГШП. Оперативные вмешательства на органах малого таза перенесли 82 (54,6%) женщины, в т.ч. повторные операции отмечены в 10% случаев. Наиболее частыми хирургическими вмешательствами являлись лечебно-диагностическая лапароскопия (24,7%) и гистероскопия (27,3%), при этом хронический эндометрит ранее был диагностирован в 12 (8,0%) случаях. Миома матки малых размеров, НГЭ I стадии распространения, оперативные вмешательства на шейке матки имелись у 10% обследованных пациенток. Межгрупповые различия по оцениваемым параметрам не были статистически значимыми (р 0,05).
При выяснении становления и характера менструальной функции выявлено, что возраст менархе составил 12,6±0,2 лет. Продолжительность менструального цикла колебалась от 22 до 35 дней, средняя продолжительность составила 27,0±0,3 дней. Анализ характера менструальной функции показал, что на момент обследования все женщины (100 %) имели регулярный менструальный цикл. Своевременное менархе выявлено у 133 (88,7 %) женщин, раннее менархе у 16 (10,6%). Средняя длительность менструаций составила 4,9 ± 0,9 дней, варьируя от 3 до 7 дней. Дисменорея выявлена у каждой седьмой пациентки.
Данные о менструальной функции обследованных пациенток представлены в таблице 9
Сравнительная характеристика спермальных факторов
После получения ооцитов и оценки качества, производилась их преинкубация для последующего оплодотворения. Осуществлялась подготовка спермы к оплодотворению. У супругов пациенток в день проведения ТВП сперма была фертильной и субфертильной по критериям ВОЗ, 2010г. Варианты выявленных в день ТВП изменений параметров эякулята представлены в таблице 26. Значимость различий установлена по хи-квадрат.
Среди обследованных групп изменения спермограммы в день ТВП встречались с одинаковой частотой наряду с нормальными параметрами эякулята (р=0,328). Согласно полученным данным, среди нарушений, выявленных в результате проведения спермиологического исследования эякулята в день ТВП, превалирующая доля принадлежала олиго- и астенозооспермии в исследуемых группах. При сравнении показателей спермограммы между группами статистически значимых различий по большинству параметров в образцах спермы, полученных в день ТВП и использованных для оплодотворения ооцитов, выявлено не было.
Наличие отклонений спермограммы от нормы в день ТВП потребовало выбора в качестве метода оплодотворения ИКСИ у половины супружеских пар. Выявление морфологических отклонений от нормы в спермограмме в день ТВП побудило нас к поиску дополнительных молекулярно-генетических критериев параметров спермы, которые отвечали бы требованиям неинвазивности и высокой прогностической значимости в определении исхода. С этой целью проведена оценка зависимости уровня экспрессии мРНК генов протаминов и фертилина-р от исхода программы ЭКО и ПЭ у 79 супружеских пар.
В зависимости от результатов лечения бесплодия методом ЭКО и ПЭ были выделены две группы: с успешным (I группа, п=13) и неуспешным исходом программы ЭКО и ПЭ (II группа, п=66). Во II группе были выделены три подгруппы. Па группа: 10 пар с самопроизвольным прерыванием беременности до 11 недель, ПЬ группа: 19 пар с биохимической беременностью, Пс группа: 37 пар с отрицательным исходом ЭКО и ПЭ.
В результате проведенного исследования было показано, что при неуспешном исходе программы ЭКО и ПЭ определялось достоверное снижение в нативной сперме уровня экспрессии мРНК фертилина-Р (ADAM-2) в группе ПЬ в 5 (Ме=0,2, р=0,002), в группе Пс в 2,5 раза (Ме=0,4, р=0,012) относительно контрольной группы. Результаты представлены на рисунке 19 и таблице 27.
При анализе параметра соотношения уровня экспрессии мРНК протаминов PRM-2: PRM-1 выявлено отклонение данного соотношения от 1 в сторону увеличения в группах с неуспешным исходом программы ЭКО и ПЭ.
Важным в программе ЭКО является пенетрационная способность сперматозоидов. Учитывая данные британских исследователей о том, что у человека ген фертилина-а не активен и является псевдогеном, предметом нашего изучения явилась экспрессия мРНК фертилина-Р [180].
При анализе различий по уровню экспрессии мРНК фертилина-р между I и II группами, при наступлении беременности выявлена статистически значимая в 2,9 раз более высокая экспрессия мРНК ADAM-2 (р=0,003).
ADAM-2, или фертилин-Р, играет ключевую роль в слиянии гамет. Трипептид FEE (фенилаланин-глутамин-глутамин) в оолемме ооцита является комплексом распознавания фертилина-Р [180]. Полагают, что фертилиноподобные молекулы проявляют функциональную активность во взаимодействии с оолеммой [91]. Подобные данные были получены и группой ученых под руководством Zhang J., которые демонстрировали проявление функции фертилина-р как специфичного для спермы антигена, который потенциально может стать ключевой точкой создания иммуноконтрацептивной вакцины [302].
Имеются данные о негативном влиянии пониженного уровня мРНК протаминов и фертилина-Р, изменения соотношения PRM-2: PRM-1 на исход программ ВРТ [64, 198, 199]. Однако в нашем исследовании не выявлено столь существенного снижения количества мРНК протаминов и фертилина-Р в сперме при неудачах программы ЭКО. По-видимому, это связано с тем, что успешный исход ЭКО и ПЭ определяется не только изученными факторами, но и другими параметрами, такими как физиологический статус женщины, качество ооцита и переносимых эмбрионов, состояние эндометрия, течение беременности, наличие сопутствующей патологии и др.
Обращает на себя внимание и то, что низкий уровень экспрессии мРНК исследуемых генов ассоциирован с нарушением имплантации (биохимическая беременность) на ранних стадиях развития или отсутствием беременности (группы lib и Не). Это соответствует современным представлениям о роли спермальных мРНК в обеспечении основных функций сперматозоида и их участии в процессе раннего эмбриогенеза (еще до активации собственного генома) на преимплантационных и имплантационных стадиях развития. Неблагоприятный прогноз программ ВРТ ассоциирован с уменьшением экспрессии мРНК генов ADAM- 2, PRM-1 и PRM-2, изменением соотношения PRM-2: PRM-1.
Важным представлялось и то, как распределялась экспрессия мРНК генов ADAM-2, PRM-1, PRM-2 в зависимости от оплодотворения. Показано снижение экспрессии всех изучаемых факторов в группах с ИКСИ. Проведенный тест Круаскала-Уоллиса для групп в зависимости от метода оплодотворения показал статистически не значимые различия по уровню экспрессии мРНК протаминов. Однако по уровню экспрессии мРНК фертилина-Р выявлено статистически значимое в 1,9 раза снижение экспрессии (р=0,037) в группе с ИКСИ (таблица 28).
Таким образом, оценка профиля экспрессии спермальных мРНК ADAM-2, PRM-1, PRM-2 подтверждает возможность использования данного метода не только для прогнозирования исходов ВРТ, но и для комплексной оценки спермограммы в сочетании с морфометрией в день ТВП в рамках проведения программы ЭКО и ПЭ.
Нами также был проведен анализ зависимости уровня экспрессии мРНК ADAM-2 от исхода ЭКО при различных методах оплодотворения. Полученные данные свидетельствовали о незначимых различиях по уровню экспрессии мРНК ADAM-2 (р=0,535) в случае наступления и отсутствия беременности при стандартном ЭКО. Однако при использовании ИКСИ, получены статистически значимые различия по уровню экспрессии мРНК ADAM-2 в случаях наступления беременности и ее отсутствия (р=0,019) (таблица 29).
В группе с наступившей беременностью определена статистически значимая корреляционная зависимость высокой силы ADAM-2 и PRM-2 (rS=0,833, p=0,01), что может дополнительно свидетельствовать в пользу подтверждения теории, высказанной Huszar G. и соавт., о параллелизме между зрелостью ядра и цитоплазматической мембраны сперматозоида.
Корреляционный анализ морфологических и молекулярно-генетических параметров спермограммы в исследуемых группах не выявил значимых связей по большинству параметров, что соответствует данным многих авторов [22, 138, 265, 267, 268, 299, 300]. Наличие тератозооспермии коррелировало с экспрессией PRM-1 и ADAM-2 (rS=0,308, р=0,037 и rS=0,308, р=0,018, соответственно). Изменение экспрессии протаминов, фертилина-Р отражает не поддающиеся морфологической оценке изменения структуры и функции сперматозоидов, которые могут в значительной степени влиять на исход программы ЭКО и ПЭ.
Процессы раннего эмбрионального развития ранее рассматривались исключительно с позиций перехода от ооцита к эмбриону (oocyteo-embryo transition - переход ооцита к эмбриону) [197]. Этот сложный процесс невозможен без участия сперматозоида, функция которого, как становится понятным, заключается не только в доставке ДНК, но и многих других молекул, в частности мРНК, которые могут привносить в ооцит значимое количество потенциально важных для дальнейшего развития эмбриона факторов [101, 120, 180]. Таким образом, нельзя исключить потенциальную важную роль спермальных транскриптов не только в формировании изначального качества мужских гамет, но и их участие в сложных взаимодействиях материнского и отцовского геномов, в наступлении и дальнейшем развитии беременности.
