Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1 Характеристика генов BCR, ABL, BCR-ABL и их белковых продуктов 15
1.2 Клиническая характеристика, диагностика и особенности терапии хронического миелолейкоза 19
1.3 Молекулярный мониторинг хронического миелолейкоза 24
1.4 Мехнизм арезистентности у больных хроническим миелолейкозом при лечении ИТК 26
1.4.1 BCR-ABL-зависимый механизм устойчивости 27
1.4.2 BCR-ABL-независимый механизм.устойчивости 30
1.5 Роль протоонкогенов и генов супрессоров опухолевого роста в этиологии ХМЛ и резистентности к лечению препаратами ИТК 34
1.6 Эпигенетическая регуляция хронического миелолейкоза 38
1.6.1 Митилирование 38
1.6.2 Роль микроРНК в развитии хронического миелолейкоза 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1 Материалы исследования 44
2.2Методы исследования 45
2.2.1 Выделение геномной ДНК 45
2.2.2 Выделение суммарной РНК 46
2.2.3 Синтез кДНК с помощью реакции обратной транскрипции 46
2.2.4 Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 47
2.2.5 Рестрикционный анализ 51
2.2.6 Метод электрофореза 52
2.2.7 Определение нуклеотидной последовательности гена BCR-ABL 52
2.2.8 Количественная ОТ-ПЦР в режиме реального времени 52
2.2.9 Статистическая обработка результатов 54
Глава 3. Результаты и обсуждение 5 6
3.1 Анализ уровня экспрессии гена BCR-ABL в лейкоцитах периферической крови у больных хроническим миелолейкозом из РБ 56
3.2Анализ мутаций в гене BCR-ABL у больных из РБ 61
3.3 Анализ частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов, участвующих в метаболизме ИТК, у больных хроническим миелолейкозом. Изучение уровня экспрессии химерного гена у носителей различных генотипов исследованных полиморфных локусов 73
3.3.1 Анализ полиморфного варианта rs776746 гена изофермента цитохрома р450 CYP3A5 у больных хроническим миелолейкозом 73
3.3.2 Анализ полиморфного варианта rs683369 гена переносчика органических катионов hOCTl у больных хроническим миелолейкозом 76
3.4Анализ уровня экспрессии генов переносчиков лекарственных препаратов в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом и индивидов
контрольной группы 79
3.4.1 Анализ уровня экспрессии гена переносчика ABCG2 в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом и индивидов
контрольной группы 81
3.4.2 Анализ уровня экспрессии гена переносчика органических катионов hOCTl в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом
и индивидов контрольной группы 87
3.5 Анализ частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов в сайте связывания мкРНК в З -нетранслируемой области транскриптов гена BCR-ABL у больных хроническим миелолейкозом. Изучение уровня экспрессии химерного гена у носителей различных генотипов исследованных полиморфных локусов 94
3.6Анализ уровня экспрессии мкРНК-203, мкРНК-196 и мкРНК-323, в
клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови
больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной
группы 101
3.6.1 Анализ уровня экспрессии мкРНК-203 в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной группы 103
3.6.2 Анализ уровня экспрессии мкРНК-196 в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной группы 106
3.6.3 Анализ уровня экспрессии мкРНК-323 в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной
группы 111
3.7Анализ уровня экспрессии генов онкосупрессоров в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной
группы 116
3.7.1 Анализ уровня экспрессии гена тирозиновой фосфатазы PTPN1 в клеточной линии К562, у больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной группы 116
3.7.2 Анализ уровня экспрессии гена нейрофиброматоза первого типа NF1 в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом
и индивидов контрольной группы 124
Заключение 132
Выводы 141
Список литературы 143
- Мехнизм арезистентности у больных хроническим миелолейкозом при лечении ИТК
- Синтез кДНК с помощью реакции обратной транскрипции
- Анализ частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов, участвующих в метаболизме ИТК, у больных хроническим миелолейкозом. Изучение уровня экспрессии химерного гена у носителей различных генотипов исследованных полиморфных локусов
- Анализ уровня экспрессии гена тирозиновой фосфатазы PTPN1 в клеточной линии К562, у больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной группы
Введение к работе
Актуальность исследования. Хронический миелолейкоз (ХМЛ) является формой лейкоза, которая характеризуется усиленным и нерегулируемым ростом преимущественно миелоидных клеток в костном мозге с их накоплением в крови. ХМЛ развивается в результате появления в стволовой кроветворной клетке реципрокной транслокации t(9;22),(q34;qll), с образованием филадельфийской хромосомы (Ph-хромосома). Транслокация приводит к возникновению онкогенного химерного гена BCR-ABL, который кодирует цитоплазматический химерный белок, обладающий выраженной тирозинкиназной активностью. Именно белок BCR-ABL имеет ключевое значение в патогенезе ХМЛ (Kurzrock R. et al., 2004). Исследования молекулярных основ патогенеза ХМЛ подготовили почву для развития таргетной (целенаправленной) терапии этого заболевания, заключающейся в применении специфических ингибиторов BCR-ABL тирозинкиназы (ИТК). Создание первого из них - иматиниба (STI571), стало революционным прорывом в области целенаправленной противоопухолевой терапии (Куцев СИ., 2009).
Несмотря на высокую эффективность препарата, у больных в 20-30% случаев наблюдается первичная (рефрактерность) или вторичная (приобретенная) резистентность к проводимой терапии (Quintas-Cardama A. et al., 2009). Предполагают, что устойчивость к терапии, в основном, связана с возникновением точечных мутаций внутри гена BCR-ABL, приводящих к нарушению связывания препарата (Hochhaus A. et al., 2002; Soverini S. et al., 2006).
Возникновение мутаций киназного домена является наиболее частой причиной резистентности, однако у некоторых больных ХМЛ признаки резистентности проявляются и в отсутствии мутаций (Gromicho М. et al., 2011). Это указывает на наличие дополнительных механизмов образования резистентного к лекарственному препарату фенотипа. Предполагают, что в развитии резистентности к терапии у больных ХМЛ большую роль играют гены, участвующие в метаболизме препаратов ИТК, а также абберантная экспрессия некоторых онкогенов и супрессоров опухолевого роста (Копнин Б.П., 2004; Lepper E.R. et al., 2005). Кроме того, в последнее время уделяется большое внимание эпигенетическим механизмам регуляции экспрессии генов
при онкологических заболеваниях, в частности, роли микроРНК в развитии ХМЛ (Bueno MJ. et al, 2006). Таким образом, в то время как у большинства больных ХМЛ достигается определенный ответ на лечение иматинибом, у некоторых из них интенсивность, качество и продолжительность этого ответа являются субоптимальными, что лежит в основе развития резистентности. Механизм резистентности к иматинибу далеко не полностью понятен, и требует продолжения активных исследований в этой области.
Цель работы - изучение молекулярно-генетических основ хронического миелолейкоза и развития резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ.
Задачи исследования:
-
Изучить уровень экспрессии химерного гена BCR-ABL в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ и оценить эффективность терапии ингибиторами тирозинкиназ.
-
Определить спектр и частоту изменений нуклеотидной последовательности химерного гена BCR-ABL у больных ХМЛ, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ.
-
Провести поиск, генотипирование и анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов, приводящих к образованию сайтов связывания мкРНК в З'-нетранслируемой области транскриптов гена BCR-ABL - rs7457 (мкРНК-323), rs9762 (мкРНК-608), и полиморфного локуса rs4919510 в гене мкРНК-608 у больных ХМЛ. Изучить уровень экспрессии гена BCR-ABL у носителей различных генотипов исследованных полиморфных локусов.
-
Провести анализ уровня экспрессии генов мкРНК-203, мкРНК-196 и мкРНК-323, в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ и индивидов контрольной группы.
-
Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов CYP3A5 (rs776746) и hOCTl (rs683369), участвующих в метаболизме ингибиторов тирозинкиназ, у больных ХМЛ с различной эффективностью терапии.
-
Провести анализ уровня экспрессии генов переносчиков лекарственных препаратов (ABCG2, hOCTl) и генов онкосупрессоров (PTPN1, NF1) в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ и индивидов контрольной группы.
Научная новизна исследования. Впервые проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование хронического миелолейкоза в Республике Башкортостан. Впервые определен спектр и частота встречаемости мутаций в гене BCR-ABL у больных ХМЛ из РБ с высоким уровнем экспрессии химерного гена в лейкоцитах периферической крови. Выявлено 4 мутации в гене BCR-ABL (M244V, T315I, М351Т, H396R), приводящих к развитию резистентности к терапии ингибиторами тирозиикиназ у 32% больных ХМЛ с высокой экспрессией химерного гена. Показана роль полиморфных вариантов генов, отвечающих за фармакокинетику ИТК (hOCTl), а также однонуклеотидных замен, в сайтах связывания мкРНК в З'-нетранслируемой области транскриптов гена BCR-ABL (miR-323), в развитии резистентности к терапии больных ХМЛ. Выявлены различия уровня экспрессии генов переносчиков лекарственных препаратов (ABCG2, hOCTl), микроРНК (мкРНК-203, мкРНК-196Ь, мкРНК-323) и онкосупрессоров (PTPN1, NF1) в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ, индивидов контрольной группы и в клеточной линии К562.
Научно-практическая значимость работы. Представленные в работе результаты расширяют имеющиеся знания о механизмах развития и прогрессирования ХМЛ, вносят вклад в формирование представлений о молекулярно-генетических основах заболевания и развития резистентности к терапии ИТК. Высокая частота встречаемости мутаций киназного домена гена BCR-ABL у резистентных к терапии ингибиторами тирозиикиназ больных ХМЛ свидетельствует о необходимости проведения своевременной диагностики данных мутаций и корректировки тактики лечения. Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих генетических исследований ХМЛ. Результаты исследования также могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Апробация работы. Основные результаты диссертации изложены и обсуждены на: конференции Европейского общества генетики человека (Вена, 2009), VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), конференции «Медико-генетические проблемы онкологических заболеваний» (Стерлитамак, 2010), II Всероссийской школе-конференции «Биомика - наука 21 века» (Уфа, 2011), II Всероссийской школе-конференции «ЭкоБиотех-2011» «Современные методы и подходы в биологии и экологии»
(Уфа, 2011), научной конференции «Актуальные вопросы онкогенетики» (Москва, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе, 5 в журналах из Перечня ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 201 работу. Диссертация содержит 19 таблиц и 29 рисунков.
Мехнизм арезистентности у больных хроническим миелолейкозом при лечении ИТК
Различают три фазы ХМЛ - хроническую, акселерации и бластный криз [Sessions J. et al., 2007]. Хроническая фаза отличается большой вариабельностью клинических проявлений и у 40% больных может протекать бессимптомно. Обычно симптомы проявляются в виде усталости, ночной потливости, потери веса. У больных наблюдаются нейтрофильный лейкоцитоз, спленомегалия, анорексия, дистрофия тканей, анемия [Cortes J., 2004]. Хроническая стадия без лечения продолжается, в среднем, 2-2,5 года.
Переход хронической стадии в фазу акселерации является трудно выявляемым, так как не существует повсеместно принятых критериев для его определения [Cortes J., 2004]. Наиболее применяемыми являются критерии Центра Андерсона по исследованию рака (MD Anderson Cancer Research Center), ВОЗ и Гематологического центра РАМН. Стадия акселерации проявляется, прежде всего, снижением чувствительности к ранее эффективной терапии. В крови, как правило, нарастает число незрелых элементов гемопоэза - промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов, суммарное количество которых нередко начинает превышать число зрелых элементов, чего никогда не бывает в хронической стадии болезни [Волкова М.А., 2003]. Одним из точных критериев начала фазы акселерации является цитогенетическая клональная эволюция, связанная с появлением дополнительных хромосомных аббераций, которую обнаруживают у 20-40% больных [Johansson В. et al., 2002]. Эта стадия может продолжаться от 2-3 месяцев до 1-1,5 лет.
Финальной фазой ХМЛ является бластный криз, который характеризуется присутствием более 30% бластных клеток в периферической крови или костном мозге [Cortes J., 2004]. Властная фаза напоминает агрессивный острый лейкоз (миелоидный у двух третей и лимфоидный у одной трети больных), при этом выживаемость больных составляет от 6 до 12 месяцев [Kurzrock R. et al., 2003]. Для диагностики ХМ Л используют следующие методы: общий анализ крови, стандартный цитогенетический анализ, флюресцентную гибридизацию in situ (FISH) хромосом и количественную полимеразную цепную реакцию. Эти методы отличаются по сложности и чувствительности.
Гематологический подсчет клеток является наименее чувствительным методом. Если при анализе в крови отсутствуют бластные клетки или их количество очень мало, а количество лейкоцитов возвращается в норму, это называется гематологическим ответом (ГО). Если анализ показывает отсутствие опухолевых клеток, ГО является полным (НТО); при наличии лейкозных клеток - частичным (ЧТО) [Sessions J., 2007].
Провести достоверную диагностику и мониторинг лечения ХМЛ позволяет стандартное цитогенетическое исследование (СЦИ) клеток костного мозга. СЦИ является единственным методом, позволяющим анализировать весь хромосомный набор клетки. Посредством СЦИ можно обнаружить дополнительные хромосомные аберрации, которые в ряде случаев свидетельствуют о неблагоприятном прогнозе заболевания. При этом необходимо понимать, что разрешающая способность этого метода относительно низкая и составляет 1-5% клеток. Филадельфийская хромосома с помощью стандартной цитогенетики выявляется почти у 90% вновь диагностированных нелеченых больных с ХМЛ [Куцев СИ. и соавт., 2008]. Ограниченность стандартного цитогенетического анализа в том, что Ph-хромосома не может быть обнаружена в скученных метафазных и интерфазных клетках.
Метод флюоресцентной in situ-гибридизации (FISH) хромосом является высоко чувствительным молекулярно-цитогенетическим методом, который позволяет обнаружить химерный ген BCR-ABL почти у всех Ph позитивных больных ХМЛ не только в метафазе, но также и в интерфазе митотического деления клетки [Jha СВ. et al., 2006]. Метод FISH позволяет обнаружить 1 опухолевую клетку на 200-500 клеток костного мозга. Для выявления слитного гена BCR-ABL используют ДНК-зонды, меченные различными флюорохромами. С помощью FISH-технологий данную перестройку удается обнаружить у 95% больных с клиническим диагнозом ХМЛ [Biernaux С. et al., 1995]. СЦИ и FISH-анализ используются как для диагностики ХМЛ, так и для мониторинга эффективности терапии ХМЛ ИТК.
Цитогенетический ответ на лечение определяется по проценту Ph+-клеток в костном мозге: полный - 0%, частичный - 1-35%, малый - 36-65%, минимальный - 66-95%, нет ответа - более 95%. Под большим цитогенетическим ответом (БЦО) подразумевается достижение полного или частичного ответа (в костном мозге 0-35 % РЬ+-клеток) [Baccarani М. et al., 2006].
В соответствии с рекомендациями European Leukemia Net [Baccarani M. et al., 2009] контрольные СЦИ или FISH-анализ (в случае отсутствия митозов клеток костного мозга) на фоне терапии ХМЛ ИТК проводят 1 раз в 6 месяц до достижения полного цитогенетического ответа, а затем 1 раз в год [Куцев СИ. и соавт., 2008].
Наиболее чувствительным методом является количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР), по результатам которой оценивают молекулярный ответ (МО) на лечение. Под большим молекулярным ответом подразумевают тысячекратное снижение уровня транскриптов BCR-ABL по сравнению с исходным (до начала терапии). Полным молекулярным ответом считают случаи, когда BCR-ABL-транскрипты не выявляются [Gabert J. et al., 2003].
В пределах чувствительности цитогенетического метода (10") оба метода (цитогенетический и молекулярный) равноценны для количественной оценки лейкозных клеток. В исследовании S.Branford и соавт. показано, что уровень экспрессии транскрипта гена BCR-ABL в периферической крови коррелирует с числом Ph-позитивных лейкозных клеток костного мозга (рис. 2) [Branford S. et al., 1999].
Синтез кДНК с помощью реакции обратной транскрипции
В опухолевых клетках, кроме нарушения структуры ДНК, изменения обнаруживаются на эпигенетическом уровне, т.е. на уровне считывания генетической информации. Метилирование является одним из механизмов, с помощью которого контролируется генетическая экспрессия. При ХМЛ обнаружена ярко выраженная корреляция прогрессирования болезни с профилем метилирования ряда генов. В частности, анализ метилирования CpG островков генов HAGE (Human cancer/testis antigen gene) и PRAME (Preferentially expressed antigen in melanoma) в раковых клеточных линиях выявил взаимосвязь между профилем метилирования этих генов и их экспрессией. Предполагается, что гипометилирование этих генов активирует их экспрессию и может играть значительную роль в прогрессировании заболевания [Roman-Gomez J. et ah, 2007a; 2007b].
Гены DAPK1 (death-associated protein kinase) и SHP1 (Src homology phosphatase-1) являются кандидатными онкосупрессорами, аномальное метилирование которых обнаружено при многих видах рака. Выявлена прямая связь между метилированием этих генов и развитием ХМЛ в сторону прогрессирующей стадии [Qian J. et ah, 2008; Uhm К. et ah, 2009].
С прогрессированием ХМЛ в бластный криз связано гиперметилирование генов НОХА5 (homeobox А4) и НОХА4 (homeobox А5) [Strathdee G. et ah, 2007], sFRPl (secreted frizzled-related proteinl) [Pehlivan M. et ah, 2008] и BIM (pro-apoptotic BCL-2-interacting mediator) [Jose-Eneriza E. et al., 2009]. Предполагается, что изменение профиля метилирования этих генов коррелирует с цитогенетической резистентностью к иматинибу и связано с неблагоприятным прогнозом.
Так как метилирование приводит к снижению экспрессии многих генов, которые подавляют развитие опухолей, интересным представляется ингибирование опухолевого роста с помощью специфических деметилирующих препаратов, таких как 5-аза-2 -дезоксицитидин (децитабин). Использование различных доз этого препарата показало противоопухолевую активность у больных при различных видах онкологических заболеваний [Momparler R.L. et al., 1997]. Вследствие этого, лечение, основанное на сочетании иматиниба с деметилирующими препаратами, может приводить к более значительному ответу на лечение у больных ХМЛ.
В целом, метилирование является фундаментальным аспектом развития неоплазии, который может сыграть ключевую роль в механизме возникновения резистентности на лечение.
МикроРНК представляют собой класс эндогенных, не кодирующих белок, малых РНК. Это очень важные регуляторные молекулы, закодированные в геноме, как животных, так и растений, участвующие в регуляции экспрессии генов, ингибирующие процессы трансляции с помощью расщепления матричной РНК. МикроРНК обладают огромным потенциалом для изучения биологии рака и противораковой терапии. Исследования последних лет продемонстрировали, что более 50% генов, кодирующих микроРНК, локализованы в участках генома, имеющих отношение к развитию рака, что свидетельствует о возможной роли микроРНК в патогенезе некоторых типов рака [Shafi G. et al., 2008].
МикроРНК кодируются генами, первые из которых были обнаружены в 2001 году у Caenorhabditis elegans. Эволюционно гены микроРНК являются производными мобильных элементов класса MITE (англ. miniature inverted-repeat transposable elements) и возникли из отдельных копий транспозонов. Транскрипты MITE, благодаря наличию инвертированных повторов и формированию шпилек, клетка распознавала и использовала для подавления активности остальных копий транспозонов. В настоящее время микроРНК обнаружены у животных и растений. Мишенями микроРНК является внушительное число генов — по меньшей мере, треть генов генома. Ранее считалось, что микроРНК присущи лишь многоклеточным организмам, однако, наличие этой группы молекул обнаружено и у одноклеточных эукариот, а именно, у вида зелёных водорослей Chlamydomonas reinhardtii. Это может свидетельствовать о большем эволюционном возрасте микроРНК, чем ранее предполагалось [Галицкий В.А., 2008; Shafi G. et al., 2008].
Методы молекулярной и клеточной биологии, используемые для сравнения опухолевых клеток со здоровыми, позволили выявить, что дефекты в некодирующих РНК (нкРНК) могут играть важную роль. Первый пример нкРНК, связанных с развитием опухоли, - НК HI9 [Нао et al. et al., 1993]. К настоящему времени список транскриптов нкРНК, вовлеченных в развитие различных типов рака, значительно вырос. Эти нкРНК включают как малые, так и большие молекулы РНК, способные, как выяснилось, генерировать микроРНК. Например, нкРНК гена BIC, связанного с онкогенезом, дает начало микроРНК двух видов, для одного из которых -miR155 - характерна повышенная экспрессия в В-лимфоцитах и клетках лимфомы Беркитта [Metzler М. et al., 2004; Eis P.S. et al., 2005].
В настоящее время у различных животных, растений и вирусов описаны тысячи молекул микроРНК [Zhang В.Н. et al., 2006], однако только некоторые из них прошли экспериментальную валидацию, в которой были доказаны их функции [Griffiths-Jones S. et al., 2006]. Результаты компьютерного анализа свидетельствуют о том, что количество молекул микроРНК составляет более 1% от общего числа генов, кодирующих белки (Lai E.C., 2003), и экспрессия более 30% генов может ингибироваться микроРНК [Berezikov Е. et al., 2005].
Изучение опосредованной малыми РНК регуляции экспрессии генов на модельных животных и в культурах клеток человека показало, что они играют ключевую роль в дифференцировке клеток и эмбриональном развитии, в процессе гематопоэза, функционировании нервной системы, онкогенезе, а также, возможно, в клеточном ответе на вирусные инфекции [Pushparaj P.N. et al, 2006].
Хотя точные функции растущего числа мкРНК, идентифицированных в геноме млекопитающих (более 1000), еще полностью не охарактеризованы, недавние исследования показывают, что снижение экспрессии мкРНК, модулирующих экспрессию онкогенов и онкосупрессоров, связано с развитием злокачественных заболеваний [Faber J. et al., 2008].
Первое доказательство участия микроРНК в развитии рака было представлено в исследованиях делеций длинного плеча хромосомы 13 (13ql4) человека при хроническом лимфолейкозе [Calin G.A. et al., 2002]. Было выявлено, что гены двух молекул микроРНК - miR-15 и miR-16 -локализованы на длинном плече 13 хромосомы - участке, подвергающемся делеции в более чем половине В-лимфоцитов при хроническом лимфолейкозе. Детальный анализ делеции показал, что гены двух этих микроРНК являются единственными генами на небольшом участке ДНК, которые у пациентов с хроническим лимфолейкозом подвергаются делеции. Анализ экспрессии этих микроРНК показал, что транскрипты miR-15 и miR-16 отсутствуют в клетках большинства (68%) пациентов [Calin G.A. et al., 2002].
Анализ частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов, участвующих в метаболизме ИТК, у больных хроническим миелолейкозом. Изучение уровня экспрессии химерного гена у носителей различных генотипов исследованных полиморфных локусов
Иматиниб, как и другие ингибиторы протеинкиназ, нацеленные на подавление онкогенных киназ, от которых зависит выживание раковых клеток, имеют большую эффективность в качестве терапии первой линии у пациентов с ХМЛ благодаря ингибированию BCR-ABL и индукции апоптоза [Sharma S.V. et al., 2007]. Более 80% впервые диагностированных пациентов достигают полной цитогенетической ремиссии, однако, главной проблемой при лечении больных ХМЛ остается появление резистентности к иматинибу, особенно в стадии прогрессирования заболевания [Hochhaus A. et al., 2009]. Одним из основных механизмов резистентности у пациентов с ХМЛ является наличие мутаций в тирозинкиназном домене BCR-ABL [Quintas-Cardama А. et al., 2009]. Если у одних больных ХМЛ признаки резистентности могут проявляться в отсутствии мутаций, то у других, возникновение мутаций может быть и не связано с появлением резистентности к иматинибу. Это указывает на наличие дополнительных механизмов образования резистентного к лекарственному препарату фенотипа [Mahon F.X. et al., 2008; OkabeS. etal., 2008].
Другие описанные механизмы резистентности включают амплификацию BCR-ABL, сверхэкспрессию семейства киназ SRC, уменьшенное усвоение и повышенный отток лекарственных препаратов, активацию репарации ДНК, и нарушение путей апоптоза [Quintas-Cardama А. et al., 2009]. Нилотиниб и дасатиниб, ингибиторы тирозинкиназ второго поколения, были разработаны для преодоления резистентности, но они также не эффективны против всех причин резистентности. Опубликованные данные свидетельствуют, что BCR-ABL позитивные клетки могут обходить ингибиторный эффект нилотиниба и дасатиниба при помощи механизмов, которые все еще недостаточно хорошо изучены, но схожи с теми, которые обнаружены у иматиниба [Mahon F.X. et al., 2008; Okabe S. et al., 2008].
Клеточная резистентность к лекарственному препарату является главным препятствием не только при ХМЛ, но и при терапии раковых заболеваний вообще. Раковые клетки могут приобретать резистентность или к одному конкретному препарату, например, к классу цитотоксических или новых таргетных препаратов, или к широкому спектру различных препаратов - феномен, известный как множественная лекарственная резистентность (МЛР, Multiple drug resistance - MDR) [Eckford P.D. et al., 2009].
Существует несколько механизмов, включая описанные выше, встречающихся при резистентности к иматинибу, которые могут содействовать появлению феномена множественной лекарственной резистентности. Чаще всего, МЛР является результатом активного АТФ-зависимого транспорта лекарственных препаратов из клеток посредством переносчиков, принадлежащих к семейству транспортеров ATP-binding cassette (ABC) [Eckford P.D. et al., 2009]. У человека описано 18 ABC-транспортеров, которые ассоциированы с транспортом препаратов in vitro [LageH. etal.,2008].
Показано, что дасатиниб и иматиниб являются лигандами транспортеров АВСВ1 и ABCG2 в лейкемических клетках. Однако выяснилось, что иматиниб также может является ингибитором ABCG2, и поэтому существует некоторые противоречия относительно роли этого переносчика в развитии резистентности [Brendel С. et al., 2007; Jordanides N.E. et al., 2006; Melo J.V. et al., 2006].
Кроме того, в ряде исследований показано, что клеточное усвоение (поглощение) иматиниба связано с белком-переносчиком органических катионов человека (hOCT-І или SLC22A1) [Thomas J. et al., 2004]. Несмотря на большое число опубликованных статей, до сих пор, неизвестно, какой из этих транспортеров является самым решающим для приобретения резистентности клетками ХМ Л к иматинибу. Отсутствует также подробная характеристика роли транспортеров [Burger Н. et al., 2004; Houghton P.J. et al., 2004; Nakanishi T. et al., 2006]. Постоянное применение ИТК предполагает необходимость изучения функций всех возможных белков переносчиков, которые могут быть причиной возникновения множественной лекарственной резистентности, а также анализа долговременного действия лекарственных препаратов при различных стадиях течения ХМЛ.
Определение профиля экспрессии генов ABC транспортеров с помощью количественной ПНР в режиме реального времени, является быстрым и чувствительным методом детекции, который позволяет количественно определить очень маленькое количество тотальной РНК. Это может стать ценным подходом в диагностике и мониторинге МЛР у пациентов во время лечения ХМЛ [Gillet J.P. et al., 2007].
Анализ уровня экспрессии гена тирозиновой фосфатазы PTPN1 в клеточной линии К562, у больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной группы
При изучении экспрессии мкРНК-323 было обнаружено, что у больных с высокой экспрессией химерного гена BCR-ABL уровень экспрессии мкРНК-323 был снижен в 4 раза по сравнению с остальными группами обследованных. Несмотря на важную роль данной мкРНК в процессах вирусной защиты организма, имеется мало данных о роли мкРНК-323 в процессе канцерогенеза.
Известно, что в появлении резистентного к иматинибу фенотипа большую роль играют гены переносчиков лекарственных препаратов. Несмотря на большое число опубликованных статей, мало известно, какой из этих транспортеров является самым решающим для приобретения резистентности клетками ХМЛ к иматинибу. При исследовании профиля экспрессии гена ABCG2 в лейкоцитах периферической крови, нами обнаружено статистически значимое повышение уровня его экспрессии у больных ХМЛ с полным молекулярным ответом (M±se: 2,294±0,3665) по сравнению с группой контроля (р=0,03). У больных с высокой экспрессией гена BCR-ABL уровень мРНК ABCG2 был ниже, чем, у больных с ПМО. Снижение уровня экспрессии ABCG2 в этой группе больных, возможно, происходит на фоне повышения дозы иматиниба. Резистентный к препарату фенотип может быть первоначально опосредован одним доминантным транспортером, однако, с увеличением дозировки препарата происходит компенсаторное переключение с этого транспортера на дополнительные ABC переносчики, экспрессирующиеся в опухоли. Полученные нами результаты, указывают, что роль изученного гена переносчиков оттока препаратов может быть важна на начальных стадиях резистентности, но после длительного воздействия и для высоких доз ИТК, могут иметь место другие механизмы.
При анализе экспрессии гена переносчика органических катионов hOCTl в лейкоцитах периферической крови выявлены статистически значимые различия в уровне экспрессии между контрольной группой (M±se:l,379±0,3732) и больными ХМЛ с высокой экспрессией BCR-ABL (M±se:2,492±0,3842) - р=0,01, а также между контрольной группой и больными с полным молекулярным ответом (M±se:2,275±0,3962) - р=0,03. Как и в случае с ABCG2, в клеточной линии К562 наблюдался довольно низкий уровень экспрессии гена hOCT. Вероятно, повышение активности переносчика hOCTl происходит, главным образом, под действием повышающихся концентраций химических агентов во внеклеточной среде. Экспрессия гена hOCTl показала линейный характер зависимости с уровнем экспрессии гена BCR-ABL. Повышение экспрессии гена hOCTl с течением времени, при постоянных дозах препарата предполагает, что анализ уровня экспрессии этого гена у больных ХМЛ до лечения не будет иметь большой прогностической значимости для терапевтического исхода.
Изменение профиля экспрессии различных протоонкогенов и опухолевых супрессоров играет ключевую роль при развитии онкологических заболеваний. По некоторым данным, ген тирозиновой фосфатазы первого типа PTPN1 вовлечен в развитие раковых заболеваний, однако, сравнительные данные показывают, что в различных клеточных линиях ген PTPN1 может обладать как онкосупрессорными, так и онкогенными свойствами. При анализе экспрессии гена PTPN1 в лейкоцитах периферической крови выявлены статистически значимые различия в уровне экспрессии между контрольной группой (M±se:l,061±0,08468) и больными ХМЛ с высокой экспрессией BCR-ABL (M±se:0,7683±0,07513) - р=0,02.
Данные, полученные в нашем исследовании, показывают, что у пациентов с ХМЛ ген PTPN1, выполняет онкосупрессорную роль, посредством своей дефосфорилирующей активности. Вероятно, низкая экспрессия PTPN1 у пациентов с ХМЛ, на фоне повышения уровня химерного гена BCR-ABL, является одним из факторов развития болезни в сторону прогрессирования. Таким образом, рост экспрессии BCR-ABL у больных со сниженным уровнем PTPN1 является потенциальным механизмом возникновения резистентности к лечению ИТК у больных ХМЛ.
Кандидатным онкосупрессором, который, возможно, вовлечен в развитие ХМЛ является ген нейрофиброматоза первого типа NF1. Его абберантная экспрессия показана при развитии многих онкологических заболеваний. Известно, что дети с нейрофиброматозом первого типа имеют 500-кратный риск развития миелоидных лейкозов, в частности ХМЛ, по сравнению со здоровыми. У половины из этих больных наблюдается потеря гетерозиготности в гене NF1. С целью выявления роли гена NF1 в развитии ХМЛ был проведен анализ экспрессии этого гена. При анализе экспрессии гена NF1 в лейкоцитах периферической крови выявлены статистически значимые различия в уровне экспрессии между контрольной группой (M±se:l,025± 0,1020) и больными ХМЛ с высокой экспрессией BCR-ABL (M±se:l,844± 0,2756) - р=0,01, а также между контрольной группой и больными с полным молекулярным ответом (M±se: 1,407± 0,1570) - р=0,02. Повышенная экспрессия гена NF1 у больных ХМЛ поднимает вопрос о том, является ли повышение уровня экспрессии гена NF1 одним из механизмов защиты раковых клеток.
Таким образом, мутации в киназном домене BCR-ABL являются одной из основных причин резистентности к терапии иматинибом у некоторых пациентов с ХМЛ, что подтверждается данными, полученными в нашем исследовании. Тем не менее, очевидно, что в развитии резистентности к лечению препаратами ИТК и прогрессировании ХМЛ в сторону акселерации и бластного криза могут играть важную роль множество других клеточных, генетических и эпигенетических факторов, которые в совокупности определяют индивидуальное развитие болезни у больных ХМЛ. Полученные нами данные о роли экспрессии мкРНК, генов переносчиков лекарственных препаратов и онкосупрессоров раскрывают некоторые патогенетические аспекты ХМЛ и вносят вклад в общее представление о молекулярно-генетических основах развития данного заболевания.
![Молекулярно-генетическое исследование наследственной компоненты подверженности к инсульту у населения г. Томска [Электронный ресурс]](/i/i/4336/180087.png "Молекулярно-генетическое исследование наследственной компоненты подверженности к инсульту у населения г. Томска [Электронный ресурс] Фролова Светлана Юрьевна")
