Молекулярно-генетическое исследование наследственной компоненты подверженности к инсульту у населения г. Томска [Электронный ресурс] Фролова Светлана Юрьевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 16

1.1. Современные представления об этиологии и патогенезе, классификации и факторах риска инсульта 16

1.2. Клинико-эпидемиологические исследования как основа формирования групп риска 28

1.3. Характеристика основных генов-кандидатов подверженности к инсульту 37

Глава 2. Материалы и методы 55

2.1. Общая характеристика обследованных лиц 55

2.2. Клинико-биохимические методы исследования 57

2.3. Молекулярно-генетические методы анализа полиморфизма генов 63

2.4. Статистические методы анализа данных 67

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 70

3.1. Результаты клинического исследования больных инсультом 70

3.1.1. Клинические проявления и факторы риска у лиц, перенесших ишемический инсульт 71

3.1.2. Клинические проявления и факторы риска у больных с геморрагическими инсультами 83

3.1.3. Сравнительная оценка биохимических показателей и параметров системной гемодинамики и их взаимосвязь с факторами риска у больных инсультом 93

3.2. Оценка частот аллелей и генотипов по полиморфизмам генов NOS3, FV, FII, GPIIIa у жителей г.Томска 103

3.3. Полиморфизмы генов NOS3, FV, FII, GPIIIa у больных инсультом 108

3.4. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов NOS3, FV, FII, GPIIIa с инсультом 114

3.5. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов NOS3, FV, FII, GPIIIa с некоторыми факторами риска инсульта 123

3.6. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов NOS3, FV, FII, GPIIIa с клиническими признаками инсульта 130

3.7. Связь полиморфных вариантов генов NOS3, FV, FII, GPIIIa с патогенетически значимыми количественными для инсульта признаками 140

Заключение 147

Выводы 156

Практические рекомендации 157

Список литературы 159

• Современные представления об этиологии и патогенезе, классификации и факторах риска инсульта
• Молекулярно-генетические методы анализа полиморфизма генов
• Клинические проявления и факторы риска у больных с геморрагическими инсультами
• Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов NOS3, FV, FII, GPIIIa с клиническими признаками инсульта

Введение к работе

Цереброваскулярная патология занимает второе место среди главных причин смертности и является ведущей причиной инвалидизации населения в экономически развитых странах, что определяет ей как одну из важнейших медицинских и социальных проблем [Беленков и др., 2003; Гусев и др., 2004; Скворцова и др., 2003]. Обсуждается более 100 гуморальных факторов патологических процессов, наследственно-конституциональных аномалий, относимых к факторам риска (ФР).

Исследования отечественных и зарубежных учёных позволили сделать вывод о том, что семейная предрасположенность является самостоятельным фактором риска развития инсульта [Давиденкова и др., 1979; Скворцова и др., 2003]. Известно, что отягощённость одновременно по отцовской и материнской линиям намного больше увеличивает риск развития инсульта, чем наследование по одной из них. Наследование по материнской линии является «независимым» фактором риска развития инсульта [Булеца, 1990; Welin et al.,1987; Killy et al., 1993; Jousilahti et al., 1997]. В близнецовых исследованиях показано, что конкордантность по риску развития ишемического инсульта у монозиготных близнецов составила 17,7%, у дизиготных - 3,6% [Bras et al., 1992].

Одним из подходов в изучении генетической предрасположенности к возникновению инсульта является использование полиморфных маркёров различных генов для анализа сцепления и/или ассоциаций с болезнями или их клиническими проявлениями. Гены, потенциально «задействованные» в развитии ишемического инсульта, относятся к разным генетическим системам: гены ренин-ангиотензиновой системы (РАС), системы гемостаза, гены синта-зы окиси азота (NOS-геиы), гены кодирующие метаболизм гомоцистеина и липидов, гены апоптоза и другие [Скворцова и др., 2003].

Выбор генов-кандидатов проводился на основании анализа метаболических нарушений, характерных для данной патологии. По данным литературы известно, что мутация Лейдена (G1691 А) ассоциирована с ишемическим инсультом [Margaglione et al., 1999; Casas et al., 2004], венозными тромбозами [Kosch, 2002], инфарктом миокарда [Middendorf et al., 2004]. Установлено, что мутация гена протромбина FII (G20210) часто встречается вместе с лейденской мутацией, повышая риск развития тромбозов и инфарктов [Doggen et al., 1998]. Показано, что PLA2 полиморфизм гена GPIIIa является фактором риска поражения крупных сосудов при инсульте у мужчин [Slowik et al., 2004], может вносить вклад в развитие инфаркта миокарда и коронарного атеросклероза и ассоциирован с развитием инсульта у молодых женщин европеоидной расы.

В последнее время большое число публикаций посвящено изучению функциональной роли молекулы оксида азота (NO) в организме человека [Снайдер, 1992; Башкатова и др., 1998; Зенков. 2000; Cooke, Tsao, 1992; Dem-ple, 1992; Gelis, Billiar, 1998]. Установлено, ч-ф ЧЫШШМШШй систе-

С Петербург Oru і

о» wfflffl \

ме (ЦНС) гиперпродукция NO играет роль в развитии эпилепсии и инсультов. NO, вырабатывается эндотелиальной синтазой оксида азота — eNOS, кодируемой геном NOS3, является самым мощным из известных эндогенных вазо-дилятаторов [Ванин, 1998; Гомазков, 2000; Wilcox et al., 1997] и его связь с сердечно-сосудистой патологией, не вызывает сомнений [Степанов и др., 1998; Чистяков и др., 2000; Пузырёв, 1999; Ковалев, 2001; Косянкова, 2002; Макеева, 2004; Sessa, 1994; Warpeha et al., 1999; Hingorani et al., 1999; Guzic et al., 2001; Colombo et al., 2003; Casas et al., 2004]. Однако, анализ литературы показывает множество пробелов в наших современных знаниях по исследованиям роли гена NOS3 в патогенезе инсульта

Для эффективного определения характера генетических изменений, лежащих в основе инсульта, и для дальнейшего развития представлений о механизмах его развития целесообразно проведение популяционно-генетического исследования. Такой подход может служить основой в оценке общей подверженности популяции к развитию цереброваскулярной патологии. Таким образом, анализ генетической компоненты в этиологии и патогенезе развития инсульта представляется весьма актуальным.

Цель исследования: Установить факторы риска инсультов и значимость аллельных вариантов генов NOS3, FV, FII, GPHIa в развитии острых нарушений мозгового кровообращения у русских жителей города Томска.

Задачи исследования:

1. Изучить основные факторы риска развития инсульта у жителей г. Томска.

2. Оценить частоты аллелей и генотипов по полиморфным вариантам генов-кандидатов подверженности к инсульту: гена эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3), гена пятого фактора свертываемости крови (FV), гена протромбина (FH) и гена рецептора интегринов (GPHIa) в Томской популяции.

3. Изучить ассоциации полиморфных вариантов генов NOS3, FV, FII, GPHIa с факторами риска развития инсульта и его клиническими проявлениями.

4. Определить связь генов NOS3, FV, FII, GPHIa с количественными, патогенетически значимыми для инсульта признаками.

Научная новизна: Впервые проведено исследование генетической изменчивости полиморфных вариантов VNTR, С774Т, G894T, С-691Т гена эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3); G1691A, A4070G гена пятого фактора свертываемости крови (FV), полиморфизма G20210A гена протромбина (FII) и варианта Т196С гена рецепторов интегринов (GPIHa) у жителей г. Томска, перенесших мозговой инсульт. Получены новые сведения о вкладе полиморфных вариантов генов NOS3, FV, FII, GPHIa в предрасположенность к инсульту. Показано, что полиморфизмы VNTR и С774Т гена NOS3 могут быть факторами риска развития инсульта и служить генетическими маркёрами при тестировании данной патологии.

Впервые оценена роль генов NOS3, FV, FII, GPIHa в изменчивости комплекса количественных патогенетически значимых признаков при инсульте. Показано, что полиморфные варианты гена NOS3 ассоциированы с показате-

лями уровня липидов и свёртывающей системы крови (VNTR полиморфизм гена NOS3 с показателями уровня триглицеридов; полиморфизм G894T с уровнем общего фибриногена; аллельные варианты полиморфизма С-691Т с показателями холестерина в составе липопротеидов высокой плотности и идексом атерогенности). Полиморфизм Т196С гена GPIIIa связан показателями свёртывающей системы крови (уровнем общего фибриногена, активированным тромбопластиновым временем).

Практическая значимость; Сведения о значимости артериальной гипертонии как фактора риска инсульта у лиц с отягощенным семейным анамнезом позволяют обратить внимание на более активную профилактику инсульта не только на популяционном, но и на индивидуальном уровне, направленном на максимально раннее выявление лиц с заболеваниями и патологическими процессами, повышающими риск развития острых нарушений мозгового кровообращения (ОНМК). Полученные данные о вкладе молекулярно-генетических маркёров в формирование клинического полиморфизма инсульта могут быть учтены при формировании групп риска и организации профилактических мероприятий, стать основой для осуществления молекулярно-генетического тестирования подверженности к данной патологии в семьях, служить ориентиром в выборе лекарственной терапии (генотип-специфическая терапия). Полученная информация о распространении частот аллелей и генотипов полиморфизма генов NOS3, FV, F1I, GPIIIa может быть использована в области генетической эпидемиологии, в популяционной и эволюционной генетике для углублённого описания генофондов народонаселения.

Положения, выносимые на защиту:

5. Ведущий фактор риска развития инсульта - артериальная гипертония - ассоциирован с полиморфизмами (VNTR, С774Т, G894T, С-691Т) гена эндо-телиальной синтазы оксида азота (NOS3)

6. Аллельные варианты гена NOS3 связаны с показателями уровня липидов и свёртывающей системы крови (VNTR полиморфизм с показателями уровня триглицеридов; полиморфизм G894T с уровнем общего фибриногена; С-691Т с показателями холестерина в составе липопротеидов высокой плотности и идексом атерогенности).

7. Наличие мутации Лейдена /*T(G1691A) является фактором риска более тяжёлого течения инсульта.

4. Полиморфизм Т196С гена GPIIIa ассоциирован с показателями свёрты
вающей системы крови (уровнем общего фибриногена, активированным
тромбопластиновым временем), а также с нарушением ритма сердца у па
циентов, перенесших инсульт.

Апробация работы: Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на межлабораторном научном семинаре ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 2005г.); IV и V конгрессах молодых учёных «Науки о человеке» (Томск, 2003; 2004); на V Конгрессе с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация в здраво-

охранении» (Афины, 2003г.); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 300-летию Санкт-Петербурга «Актуальные проблемы современной неврологии, психиатрии и нейрохирургии» (Санкт-Петербург, 2003г.); Международной конференции «Современные подходы к диагностике, профилактике и лечению нейродегенеративных заболеваний (деменции, инсульта и болезни Паркинсона)» (Новосибирск, 2003г.); Международном европейском конгрессе по генетике человека (Мюнхен, Германия, 2004г.); научно-практической конференции, посвященной 25-летнему юбилею факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов (Томск, 2004г.), Российском национальном конгрессе кардиологов (Томск, 2004), VII научной конференции «Актуальные проблемы клинической генетики» (Томск, 2004г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объём диссертации: Диссертационная работа изложена на 181 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов, практических рекомендаций. Данные проиллюстрированы 47 таблицами, 16 рисунками. Библиографический указатель включает 229 источников, из них 88 работ отечественных авторов.

Современные представления об этиологии и патогенезе, классификации и факторах риска инсульта

Инсульт - это клинический синдром, представленный очаговыми неврологическими и/или общемозговыми нарушениями, развивающийся внезапно вследствие острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК), сохраняющийся не менее 24 часов или заканчивающийся смертью больного в эти или более ранние сроки [Верещагин, 2002].

Классификация инсульта. Выделяют: ишемический инсульт (ИИ) и геморрагический инсульт (ГИ). Последний подразделяется на: кровоизлияние в мозг и субарахноидалыюе кровоизлияние. Кроме того, выделяют субарахноидалыю-паренхиматозные, паренхиматозно-субарахноидальные кровоизлияния и «смешанные» инсульты [Виленский, 2002]. Так ГИ встречаются в 20,2%, в том числе кровоизлияния в мозг - в 16,8%, субарахноидальные кровоизлияния - в 3,4%, ИИ - в 79,8% случаев [Суслина, 2002; Гусев и соавт., 2003]. Таким образом, среди всех видов инсульта преобладают ишемические поражения мозга. По данным международных мул ьти центровых исследований, соотношение ишемического и геморрагического инсультов составляет в среднем 5,0-5,5 к 1. Смешанные инсульты составляют 10% от всех инсультов [Скворцова, 2001].

С учётом продолжительности существования неврологического дефицита, выделяют несколько типов нарушений мозгового кровообращения [Виленский, 1995]: преходящие нарушения мозгового кровообращения (ПНМК), при которых неврологические нарушения ликвидируются в течение 24 часов с момента их возникновения. Диагноз может быть установлен только ретроспективно. «Малый инсульт» диагностируется в том случае, если неврологические проявления ликвидируются в течение трёх недель. Отдельно выделяют массивный инсульт, при котором очаговая симптоматика сохраняется более трёх недель. Е.И. Гусевым (1992) предложена классификация, основанная на оценке степени тяжести состояния больных: малый инсульт - незначительно выраженная неврологическая симптоматика, полностыо регрессирующая в течение трёх недель с момента появления; инсульт средней степени тяжести -без клинических признаков отёка мозга, расстройств сознания с преобладанием в клинической картине очаговой неврологической симптоматики; тяжёлый инсульт, проявляющийся выраженной общемозговой симптоматикой с угнетением сознания, признаками отёка мозга, вегетативно-трофическими нарушениями, грубым очаговым дефектом, часто дислокационными симптомами.

Классификация, основанная на локализации инфаркта мозга, базируется на соответствии топической характеристики очаговой неврологической симптоматики определённым артериальным бассейнам: средняя, передняя, задняя мозговые артерии, основная артерия и их дистальные ветви [Аносов, Виленский, 1963].

В настоящее время существует положение о гетерогенности ишемических инсультов, согласно которого выделяют несколько подтипов [Верещагин, 2003; Суслина, 2003]. Различают:

- атеротромботический инсульт, развивающийся вследствие атеросклероза экстракраниальных артерий, который связан с нарушением целостности атеросклеротической бляшки и образованием тромба, что приводит к полному закрытию просвета сосуда или его критическому сужению;

- кардиоэмболический инсульт - источником тромбоэмболии являются различные изменения в полостях или клапанном аппарате сердца (кардиоцеребральная эмболия). В качестве эмболов могут выступать также фрагменты тромба;

- гемодинамический инсульт, развивающийся вследствие изменения магистральных артерий головы или интракраниальных сосудов. В развитии этого типа играют роль факторы, вызывающие нестабильность системной гемодинамики с последующей редукцией церебральной ишемии;

- лакунарный инсульт, причиной которого являются изменения мелких внутримозговых артерий, характерные, прежде всего, для артериальной гипертонии;

- гемореологическая микроокклюзия, когда в развитии ишемического инсульта приобретают самостоятельное значение изменения реологии крови и гемостаза.

Эпидемиология. Инсульт ежегодно поражает в России более 450 000 человек, т.е. каждые 1,5 минуты у кого-то из россиян впервые развивается это заболевание [Скворцова, 2001]. У больных с гипертонической болезнью в России инсульты возникают в 4 раза чаще, чем в США и развитых странах [Виленский, 1995]. Россия занимает второе место по смертности от церебрального инсульта, которая в 3-8 раз выше, чем в США, Франции, Швейцарии, кроме того, в отличие от Японии, США, Австралии и многих стран Западной Европы, в России смертность от инсульта не снижается [Sans et. al., 1997]. В 1999 г. ранняя (30-дневная) летальность после инсульта составляла 35%, в течение года умирали около 50% больных. Около 55% больных инсультом, выживших к концу 3-го года заболевания, не удовлетворены качеством своей жизни и лишь около 20%) больных могут вернуться к прежней работе [Скворцова и др., 2001].

Сводные данные по сертификатам смерти в разных странах, свидетельствуют о том, что каждый год в мире регистрируется приблизительно 4,6 млн. смертей от инсульта, из которых три четверти приходятся на развивающиеся страны [Bonita, 1995].

Иная ситуация имеет место в экономически развитых странах Западной Европы, США, Канаде. Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в 1995 году сформулирована фундаментальная программа «Организация борьбы с гипертонией», обобщающая принципы и методы профилактических мер, направленные на сокращение частоты инсультов и летальных исходов, вследствие острых нарушений мозгового кровообращения (ОНМК). В связи с этим в настоящее время наиболее актуален вопрос о всестороннем изучении факторов риска, приводящих к возникновению инсультов [Виленский, 2002]. Факторы риска инсульта. В соответствии с рекомендациями Американской Национальной Ассоциации (National Stroke Association) по изучению инсульта (1991) и Международного объединения по профилактике инсульта (International Stroke Prevention Counsil, 1991), а также по некоторым материалам, опубликованным в последние годы, все факторы риска рубрифицированы следующим образом:

1) наиболее значимые факторы риска;

2) менее значимые факторы риска;

3) факторы риска, имеющие дополнительное значение (табл. 1). Данная рубрификация различающихся по значению предпосылок к развитию инсульта основана на неодинаковой частоте их выявления у перенесших ОНМК. Естественно, имеют место крайне вариабельная индивидуальная значимость, а также весьма различающиеся в каждом отдельном случае сочетания упомянутых предпосылок к развитию инсульта [Виленский, 2002]. Поэтому необходимо все вышеперечисленные «факторы риска» рассматривать с позиции концепции патокинеза. Патокинез характеризует особенности развития и динамики патологического процесса, все его стадии и формы, клинические и морфологические варианты, а также защитно-компенсаторные механизмы, проявляющиеся в процессе болезни.

Согласно данной концепции, существует три последовательных этапа нарушений функции организма, завершающихся развитием инсульта: 1) нарушения центральной регуляции сосудистого тонуса, сердечного ритма и гомеостаза; 2) условия, предрасполагающие к развитию инсульта; 3) непосредственные причины развития инсульта.

Молекулярно-генетические методы анализа полиморфизма генов

Исследовались полиморфные варианты генов NOS3(VNTR, С774Т, G894T, С-691Т), FKG1691A, A4070G), FII (G20210A), GPIIIa(T І96С) (табл. 6).

При поступлении образцов крови больных инсультами, выделение ДНК проводили по стандартной неэнзиматической методике [Маниатис, Фрич, 1984; Lahiri, 1992]. Выделенную ДНК замораживали и хранили при -20 С до проведения эксперимента.

Генотипирование осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл. 7).

Смесь для ПЦР содержала 0,5-2,0 мкл специфической пары праймеров концентрацией 1 о.е./мл, 1,2-2,0 мкл 10х буфера для амплификации с концентрацией MgCl2 0,5-2,0 mM, 0,5-2,0 е.а. Taq ДНК-полимеразы («Сибэнзим», «Медиген», Новосибирск) и 100-200 нг геномной ДНК.

Смесь помещали в 0,5 мл пробирки типа «Эппендорф», наслаивали сверху минеральное масло для предотвращения испарения и амплифицировали в автоматических минициклерах «MJ Research» (США) и «ЦиклоТемп 105» (Россия-Австрия).

Программа амплификации включала предварительную денатурацию при 94С в течение 5 минут, с последующими 30-35 циклами отжига при специфической для каждой пары праймеров (1 мин.), элонгации цепи при 72С (45 сек.) и денатурации при 94С (45 сек.). Программу завершала финальная элонгация при 72С в течение 3 минут. Амплификат подвергали гидролизу соответствующей рестриктазой (Табл.7) при оптимальной для фермента температуре в течение 12-24 ч. Рестрикционная смесь включала 5-7 мкл амплификата, 1,0-1,2 мкл 10х буфера для рестрикции, поставляемого фирмой-производителем («Сибэнзим», Новосибирск), и 1-5 единиц активности фермента (в зависимости от эффективности его работы).

Продукты рестрикции фракционировали в 3% агарозном или 6% полиакриламидном гелях при напряжении 120 В в течение 30 минут для разделения в агарозном, и при напряжении 160 В в течение 120 минут - в полиакриламидном геле. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ-свете с применением компьютерной видеосъемки на приборе "UV-VIS Imager-ir (CHIA).

Клинические проявления и факторы риска у больных с геморрагическими инсультами

Во 2-ой группе обследовано 16 пациентов, перенесших геморрагический инсульт (ГИ). Фоновыми заболеваниями в данной группе явились АГ у 12 (75,00 %) пациентов, а также сочетание АГ и церебрального атеросклероза у 4 (25,00 %) обследованных (табл. 19). При этом отмечено, что АГ чаще наблюдалась у женщин и составила 77,77%.

Провоцирующими факторами у больных ГИ явились: психотравмирующая ситуация (у 4 пациентов - 25,00%), физическая нагрузка (у 4 - 25,00%), алкоголизация (у 2 больных - 12,50%). У 6 (37,50%) обследованных не удалось установить провоцирующих факторов заболевания.

Среди факторов риска в данной группе оказалась наиболее значимой артериальная гипертензия, которая была установлена у 100,00% пациентов. Пограничная и 1 ст. (мягкая) АГ наблюдалась у одинакового количества пациентов и составила 37,50%, а умеренная АГ - у 25,00% пациентов (табл. 20).

При анализе длительности гипертонии установлено, что у 37,50% больных артериальное давление повышалось в течение 5 лет. В течение 6-10 лет и более страдали гипертонией одинаковое количество пациентов -(31,25%) (табл. 20).

На момент госпитализации у подавляющего большинства были зарегистрированы повышенные цифры АД, за исключением 3 (18,75%) больных, ими оказались пациенты, регулярно принимающие гипотензивные препараты. Средние показатели САД/ДАД оказались выше, чем в группе больных, перенесших ИИ и равнялись 161,35±19,82/98,54±8,36 мм.рт.ст. Показатель среднего артериального давления (среднее АД) составил 118,72±11,23мм.рт.ст. Данные результаты могут быть обусловлены тем, что 37,50% пациентов данной группы страдали АГ 1 ст. (мягкой), и 25,00% - 2ст. (умеренной) АГ.

Отмечено, что у 68,75% пациентов лечение АГ было эпизодическим, а всего 31,25% больных принимали гипотензивные препараты. В данном исследовании установлено, что у мужчин преобладала пограничная и умеренная АГ (42,85%), а у женщин 1-я степень (мягкая) АГ (55,55%) (табл. 20).

Следует особо подчеркнуть, что все мужчины в данной группе либо не получали необходимую терапию вообще, либо лечились нерегулярно, в то время как у женщин процент регулярного приёма гипотензивных препаратов составил 44,44%, а нерегулярного, оказался выше и составил 55,55%.

Среди других факторов риска, в проведённом исследовании преобладали: сочетание стресса, метеочувствительность и употребления в пищу острого и солёного (у 10 - 62,50% пациентов), курение (у 5 - 31,25% пациентов), перенесённые ОНМК (в анамнезе более 1-го года) у 25,00% обследованных, стенокардия (у 4 - 25,00% больных) (табл. 21).

Среди мужчин наиболее часто отмечены следующие факторы риска: стресс (85,71%), курение (71,42%), сочетание метеочувствительности и употребления острой и солёной пищи (57,14%), стенокардия (42,85%), сахарный диабет и приём алкоголя (28,57%). Среди женщин преобладало сочетание метеочувствительности и употребления с пищу острого и солёного (66,66%), стресс (44,44%), наличие в анамнезе перенсённого ОНМК (22,22%) (табл. 21).

При опросе пациентов и их родственников удалось выяснить, что отягощенный наследственный анамнез в данной группе наблюдался в 68,75% случаев. При этом отмечено, что по отцовской линии в 25,00% случаев по инсульту и АГ, а по материнской линии у 31,25% пациентов по инсульту и в 18,75% случаев по АГ. Было отмечено, что в 12,50% семей сестры пациентов (пробандов) страдали АГ, а 18,75% братьев перенесли инфаркт миокарда (табл.22).

Артериальная гипертония в 2 раза чаще встречалась у сестёр пробандов, чем у братьев, а инфаркты миокарда наблюдались только по мужской линии - у отцов и у братьев пробандов Инсульты, в анамнезе были отмечены только у сестёр (табл. 22).

Основная часть больных была госпитализирована в стационары в течение 6-12 часов - 10 (62,50%) пациентов, до 6 ч. - 2 (12,50%) больных, до трёх суток - 4 (25,00%) пациентов (табл. 23).

В зависимости от локализации патологического процесса у 12 (75,00%) больных очаг локализовался в бассейне внутренней сонной артерии (ВСА), а у 4 (25,00%) пациентов в вертебрально-базилярном бассейне (ВББ). У 6 (37,50%) обследованных лиц наблюдалось смешанное паренхиматозно-субарахноидальное, у 7 (43,75%) - паренхиматозное, у 3 (18,75%) -субарахноидалыюе кровоизлияние. Прорыв крови в желудочки мозга был выявлен в 18,75% случаев. У 56,25% больных отмечалась левополушарная локализация патологического процесса, а в 43,75% - правополушарная.

Согласно представленной классификации степени тяжести инсульта, предложенной Е. И. Гусевым и соавтр. (1996), состояние при поступлении расценивалось как удовлетворительное у 1 (6,25%) пациента. У 5 (31,25%) обследованных, состояние оказалось средней степени тяжести, а у 9 (56,25%) пациентов состояние было расценено как тяжёлое. Преобладание тяжёлой степени заболевания можно, по-видимому, объяснить характером инсульта и наличием отёка головного мозга.

Одновременно была проведена оценка степени выраженности неврологических нарушений, согласно представленной шкале NIH-NINDS и объективным данным. При этом, были выделены 3 группы больных (табл. 24).

Первую группу составили пациенты 5(31,25%) (суммарный балл по шкале NIH-NINDS - 3,0±1,58 балла), в клинической картине которых преобладали очаговые неврологические расстройства. Во вторую группу вошло 5(31,25%) больных со средней степенью выраженности неврологического дефицита (суммарный балл по шкале NIH -NINDS -8,60±0,89 балла), в неврологическом статусе этих пациентов преобладала более выраженная очаговая симптоматика. Третью группу (37,5%) составили лица (суммарный балл по шкале NIH-NTNDS - 15,0±3,40 балла), в неврологическом статусе которых преобладали общемозговые симптомы с нарушением сознания до степени сопора и комы и выраженная очаговая неврологическая симптоматика (табл. 24).

При сравнении показателей уровня среднего АД со степенью выраженности неврологических нарушений отмечались достоверные различия показателей среднего АД (р 0,05) между группами с лёгкой и тяжёлой степенями выраженности неврологического дефицита (табл. 25).

С учётом субъективных и объективных неврологических данных в группе больных, перенесших геморрагический инсульт, были выявлены различные клинические симптомы (табл. 26). Наиболее часто встречались нарушение сознания в виде оглушения (31,25% случаев), речевые расстройства (дизартрия (43,75%) и сенсорная и моторная афазия (37,5%)), глазодвигательные нарушения в виде ограничения взора, диплопии и нистагма.

Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов NOS3, FV, FII, GPIIIa с клиническими признаками инсульта

В настоящем исследовании изучены взаимоотношения полиморфных вариантов генов NOS3, FV, FII, GPIIIa с некоторыми клиническими признаками инсульта: степенью тяжести (шкала NIH), показателями ЭКГ (ритм, гипертрофия левого желудочка (ГЛЖ), изменениями миокарда (желудочков и/или предсердий), изменениями глазного дна (гипертензивная ангиопатия сетчатки (ГАПС), артериолосклероз сетчатки (АС)).

Для сравнения исследуемых полиморфных вариантов генов и степенью тяжести инсульта (шкала NIH) все пациенты были поделены на 3 группы: I группу составили пациенты с лёгкой степенью тяжести инсульта, II группу -со средней степенью и III - с тяжёлой степенью нарушения мозгового кровообращения. Четвёртую группу составили пациенты контрольной группы.

Взаимосвязь со степенью тяжести инсульта. При сравнении частот аллелей и генотипов между подгруппами больных инсультом с разной степени тяжести заболевания не было обнаружено различий по изученным полиморфным вариантам генов NOS3, FV, FII, GPIHa (табл. 42). Вместе с тем, при сравнении больных инсультом разной степени тяжести с контрольной группой показано накопление аллеля «А» полиморфизма G1691А гена FV в группе больных с наибольшей степенью тяжести заболевания (группа III) (р=0,02) и различия в распределении генотипов между группой III и контролем (х2 =7,603; р=0,02) (рис. 11).

По данным литературы известно, что мутация Лейдена (G1691 А) связана с развитием различных патологических состояний, обусловленных сосудистыми нарушениями. Показан вклад мутации Лейдена в предрасположенность к таким заболеваниям, как ишемический инсульт [Margaglione et al., 1999; Casas et al., 2004], венозные тромбозы [Kosch, 2000; Alhenc-Gelas, 1999], инфарктом миокарда [Rosendaal et al. 1997; Middendorf et al., 2004], острая ишемическая болезнь [Holm et al. 1999]. Риск развития данных патологий многократно увеличивается при наличии у пациентов таких факторов риска как курение, ожирение, диабет, гипертензия, гиперхолестеринемия [Lu demann et al., 1998].

Кроме этого, выявлены различия в группах больных с легкой и тяжелой степенью инсульта по сравнению с контрольной группой по частотам аллелей и генотипов полиморфизма VNTR гена NOS3 (рис. 12). В группах больных с легкой и тяжелой степенью инсульта частота «патологического» аллеля «А» составила 25,4% и 31,25% соответственно, тогда как в контрольной группе частота данного аллеля находилась на уровне 14,7% (рис. 12). Кроме того, что больные с тяжелой степенью инсульта характеризуются накоплением «патологического» аллеля «А», в этой группе выявлено повышение частоты гомозиготных носителей данного аллеля (рис. 12).

Так как I группу по тяжести заболевания составили пациенты с пограничной степенью АГ (146-147/92-94), а III группу - со средней и тяжёлой степенью АГ (153-175/96-103), то данный результат является закономерным, поскольку нами установлена связь полиморфизма VNTR и степенью АГ (см. раздел 3.4).

Несмотря на то, что не было выявлено различий в частотах аллелей полиморфизма С774Т гена NOS3 у больных с различной степенью тяжести инсульта и в контрольной группе, были обнаружены значимые различия в распределении генотипов между группой больных со средней степенью заболевания и контрольной группой (р=0,01). У больных со средней степенью тяжести инсульта наблюдается повышение частоты гетерозигот «СТ» до 56,3%о по сравнению с контрольной группой, где частота гетерозигот составила 43,5% (р=0,031 - уровень значимости получен с помощью t-критерия при сравнении долей) (рис. 13).

Полученные результаты свидетельствуют, что некоторые полиморфные варианты гена NOS3 могут вносить вклад в предрасположенность к развитию инсульта и дают возможность прогнозировать тяжесть течения заболевания. Наличие мутации Лейдена может являться фактором риска тяжелого течения инсульта.

Взаимосвязь с нарушением сердечного ритма. Дальнейшим этапом работы было изучение ассоциаций полиморфных вариантов генов NOS3, FV, FII, GpIIIa с сердечно-сосудистыми нарушениями, а именно изменениями ритма на ЭКГ. Не было выявлено статистически значимых отличий по частотам генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов NOS3, FV, FII.

Отмечено достоверное увеличение патологического аллеля PLA2 (16,7%) гена GpIIIa в группе больных инсультом с нарушениями сердечного ритма на ЭКГ (группа 1) по сравнению с группой больных инсультом без нарушений ритма на ЭКГ (группа 2) (х2=4,46; р=0,034). Статистически значимыми были отличия по частотам генотипов (% =3,953; р=0,046) в данных группах (табл. 43).

По литературным данным известно, что аллель PLA2 может вносить вклад в развитие сердечно-сосудистой патологии, такой как ИМ, коронарный атеросклероз [Weiss et al., 1996; Feng et al., 1999] и цереброваскулярной патологии [Carter et al., 1999]. При инсульте было выявлено разнонаправленное действие аллеля PLA2. С одной стороны, аллель PLA2 являлся фактором риска поражения крупных сосудов при инсульте у мужчин [Slowik et al., 2004], с другой - данный аллель имел протективное значение против субарахноидального кровоизлияния [Iniesta et al., 2004].

Данных о взаимосвязи полиморфизма Т196С гена GPIHa с нарушением сердечного ритма в литературе не выявлено, однако, исходя из выявленных ранее ассоциаций данного полиморфизма с сердечно-сосудистой патологией, полученная ассоциация с нарушением ритма сердца является возможной.

Взаимосвязь с изменениями миокарда на ЭКГ. При сравнении частот аллелей и генотипов в группе больных инсультом с изменениями миокарда на ЭКГ и контрольной группой не было выявлено достоверных отличий по полиморфным вариантам генов FVL, FVA, FH, GpIIIa, NOS3 (G894T, С691Т). Однако, наблюдалось статистически достоверное отличие по частотам аллелей и генотипов полиморфного варианта VNTR гена NOS3 и различия в распределении генотипов С774Т в группе больных инсультом с изменениями миокарда на ЭКГ и контрольной группой (р=0,018; р=0,019) (р=0,04) (табл. 44; рис.14). В литературе имеются данные о связи аллеля «A» VNTR полиморфизма с ЭГ, ишемической болезнью сердца в г. Москве и Японии [Минушкина и др., 2002; Чистяков и др., 2000; Yoshimura, 1998], ГЛЖ у жителей г. Томска [Степанов и др., 1998].

Данные результаты могут свидетельствовать о связи VNTR полиморфизма гена NOS3 с клиническими проявлениями со стороны сердечно-сосудистой системы при инсульте.

Взаимосвязи полиморфизмов, изучаемых в проведённом исследовании с гипертрофией левого желудочка (ГЛЖ) не наблюдалось.

Полученные результаты показали, что полиморфизмы генов GpIIIa (С196Т) и NOS3 (VNTR, С774Т) взаимосвязаны с клиническими проявлениями со стороны сердечно-сосудистой системы при инсульте и указывают на патогенетическую общность ССЗ и инсульта.

Изучение ассоциаций с изменениями на глазном дне. При изучении взаимосвязи полиморфизмов генов FVL, FVA, FII, GpIIIa, NOS3 (G894T) с изменениями на глазном дне (гипертензивная ангиопатия сетчатки (ГАПС), артериолосклероз сетчатки (АС)) не было найдено статистически значимых отличий по частотам аллелей и генотипов. Выявлено повышение частоты аллеля A VNTR полиморфизма гена NOS3 у больных инсультом с АС (26,6%) по сравнению с контрольной группой (14,7%) (%=4,18; р=0,041). Так же выявлены изменения распределения частот генотипов полиморфных вариантов С774Т у больных ГАПС по сравнению с контрольной группой (р=0,025) и G894T между группами больных инсультом с ГАПС и АС (р=0,032) (рис. 15, 16). В группе больных инсультом с ГАПС наблюдается значимое повышение частоты гетерозигот «СТ» полиморфного варианта С774Т по сравнению с контрольной группой за счет уменьшения частоты гомозигот обоих классов (р=0,006). Кроме этого, в группе больных инсультом с АС было выявлено повышение частоты гомозигот обоих классов и понижение частоты гетерозигот (х =3,88; р=0,048) полиморфного варианта G894T по сравнению с больными инсультом с ГАПС (рис. 15).

Данные изменения могут быть закономерными, так, как нами установлена взаимосвязь данных полиморфизмов с гипертонией, клиническими проявлениями которой являются изменения на глазном дне.

Похожие диссертации на Молекулярно-генетическое исследование наследственной компоненты подверженности к инсульту у населения г. Томска [Электронный ресурс]

Популяционно-генетическое исследование сельского населения Киргизской РеспубликиСолтобаева Жаныл Осмонбековна

Частота и спектр хромосомных нарушений у работников ядерно-химического производства и населения сопредельных территорийЯковлева Юлия Сергеевна

Этногеномика населения Северной ЕвразииСтепанов Вадим Анатольевич

Особенности распределения HLA-антигенов, генов и гаплотипов у пришлого и коренного населения Северо-Востока РоссииПереверзева Виктория Владимировна

Генетическое разнообразие коренного населения Сибири и Средней Азии по полиморфным Alu-инсерциям Хитринская Ирина Юрьевна

Структура и филогеография генофонда коренного населения Сибири по маркерам Y-хромосомыХарьков, Владимир Николаевич

Анализ повторяющихся последовательностей ДНК в эволюционно- и популяционно-генетических исследованиях кровососущих комаров семейства CulicidaeБрагинец Ольга Петровна

Генетико-эпидемиологическое исследование фенилкетонурии в популяции Краснодарского краяЗинченко Людмила Васильевна

Молекулярно-генетическое исследование демиелинизирующих форм нейропатии Шарко-Мари-ТусБабушкина Надежда Петровна

Молекулярно-генетическое исследование комаров комплекса Culex pipiensХраброва Наталья Валерьевна