Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Демиелинизирутощие формы нейропатии Шарко-Мари-Тус .
1.1. Клиническая картина и основы классификации наследственных двигательно-сенсорных нейропатии .
1.2.Эпидемиология нейропатии Шарко-Мари-Тус. 25
1,3. Молекулярный патогенез СМТ . 29
1.4.Генетические основы нейропатии Шарко-Мари-Тус. 32
1.4Л. Роль гена РМР22 в патогенезе СМТ1 А. 32
1.4.2. Роль гена MPZ в нейропатии Шарко-Мари-Тус. 39
1.4.3. Роль гена Сх32 в формировании СМТХ1. 44
1.4.4. Роль гена NF-L в СМТ. 50
Глава 2. Материалы и методы. 56
2.1. Материалы. 56
2.2. Методы молекулярно-генетического анализа. 57
2.2.1. Подготовка ДНК к молекулярно-генетическому анализу .
2.2.2. Анализ генных мутаций и полиморфных вариантов ДНК.
2.2.2.1. Фракционирование ПЦР-продуктов, 62
2222. Секвенирование фрагментов ДНК. 66
2.2.3. Методы статистической обработки результатов. 68
Глава 3. Результаты и обсуждение. 70
3.1.. Анализ полиморфных микросателлитных повторов в локусе 17р11.2. 74
3.1 Л. Исследование полиморфизма микросателлитных повторов D17S921, D17S1358, D17S839, D17S1356 влокусе 17pl 1.2 в популяционных выборках .
3.1.2. Анализ STR-маркеров D17S921, D17S1358, D17S839,
DI7SI356 в семьях больных с наследственными мото сенсорными нейропатиями, 87
3.1.2,1. Выявление дупликации в локусе 17рИ.2у больных из Западной Сибири и медико-генетическое консультирование в семьях,
3.1.2.2. Выявление дупликации в локусе 17рП.2у 96 больных из Таджикистана,
3.1.23. Сегрегация заболевания с локусом 17р11.2 в семьях. 98
3.2. Изучение мутаций в генах, вовлеченных в формирование
103 демиелинизирующих форм нейропатин Шарко-Мари-Тус.
3.2.1.. Выявление нуклеотидных замен в гене РО (MPZ). 105
3.2.2. Поиск точечных мутаций в гене РМР22. 115
3.2.3. Выявление точечных мутаций в гене Сх32. 117 3.24. SSCP-анализ гена JVF-I. 130
Заключение 133
Выводы 140
Список литературы 142
Приложения 186
- Клиническая картина и основы классификации наследственных двигательно-сенсорных нейропатии
- Молекулярный патогенез СМТ
- Подготовка ДНК к молекулярно-генетическому анализу
- Исследование полиморфизма микросателлитных повторов D17S921, D17S1358, D17S839, D17S1356 влокусе 17pl 1.2 в популяционных выборках
Введение к работе
Вся наследственная патология определяется грузом мутаций, как вновь возникающих, так и унаследованных от предыдущих поколений, В настоящее время известно улсе около 5000 наследственных болезней [Бочков Н.П., 2004]. Весомую долю среди моногенных патологий составляют болезни нервной системы, характеризующиеся чрезвычайным разнообразием нозологических форм, генетической гетерогенностью и выраженным клиническим полиморфизмом, что часто затрудняет диагностику и усложняет проведение медико-генетического консультирования в отягощенных семьях [Бадалян Л.О, и др., 1983; Дадали Е.Л., 1999; Умаханова 3,Р., 2000; Иллариошкин СИ. и др., 2002, 2004]. Наследственные болезни нервной системы являются важной медико-социальной проблемой, поскольку этиология, патогенез и клинические проявления этих патологий по-прежнему не изучены в достаточной степени, а значит, существующие методы лечения не эффективны в должной мере [Бадалян Л.О., 1974; Руденская Г\Е., 1998]. В большинстве стран изучению этих патологий уделяется все большее внимание: постоянно пополняются сведения о клинических формах, генетической компоненте, ведется поиск подходов к более эффективному оказанию помощи таким больным [Ахмадесва Л.Р. и др., 2003; Бочков Н.П., 2004], Знание генетического дефекта делает возможным проведение профилактических мер для предотвращения заболевания, либо смягчения его течения, а значит необходимо как можно более широкое применение медико-генетического консультирования в отягощенных семьях. Основной сложностью изучения наследственных болезней является их клиническая и генетическая гетерогенность. Впервые термин «генетическая гетерогенность)) ввел С.Н. Давиденков [Давидснков С. Н, 1934], это понятие означает, что клиническая форма болезни может быть обусловлена мутациями в разных локусах или множественными аллелями в одном локусе (фактически, с этиологической точки зрения - это разные
7
нозологические формы) [Бочков Н.П., 2004]. Генетическая гетерогенность
обнаружена для ряда моиогенных заболеваний, например - наследственных
атаксий, спастических параплегии, первичного паркинсонизма и т. д,
[Иллариошкин С.Н., 2004]. Наследственные нейромышечные заболевания
представляют собой самый большой класс наследственных заболеваний
нервной системы [Гехт Б.М., Ильина И.А., 1982; Вельтищев ЮБ., 1998]. При
этом нейролатия Шарко-Мари-Тус (наследственная мото-сенсорная
нейропатия) составляет около 80% * всех наследственных невропатий
[Бадалян Л.О., Скворцов И.А., 1986] и является группой генетически
различных патологий, объединенных одним названием благодаря сходству
их клинических проявлений. Встречаются наследственные мото-сенсорные
нейропатии с частотой 1-2 на 10000 [De Jonghe P. et al., 1998]; наследование
аугосомно-доминантное, аутосомно-рецессивное, Х-сцепленное
(доминантное и рецессивное), встречаются и мутации сЫ novo [Chance Ph.F., FischbeckK.H., 1994].
Нейропатия Шарко-Мари-Тус (Charcot-Marie-Tooth, CMT) названа по именам трех исследователей, независимо клинически описавших ее в 1886 г,, как нарушение нервной системы, ведущее к мышечной слабости и атрофии. Это клиницисты из Франции Ж.-М. Шарко (Charcot) и П. Мари (Marie) и врач из Англии Г. Туе (Tooth) [Chance Ph.E, Fisclibeck КЯ, 1994]. В 60-70 гг. XX в,, благодаря развитию клинических исследований, были детально описаны разные субтипы СМТ и другие связанные с ней нейропатии. В 80 т.г. прошлого столетия пристальное внимание было обращено на детальное генетическое исследование этой группы заболеваний.
В настоящее время, базируясь на неврологических и гистопатологических исследованиях, выделяют 2 основные формы СМТ -демиелинизирукицую (СМТ1) и аксональную (СМТ2) [Chance Ph,F., Fischbeck K.IL, 1994; Bort S. et al, 1997]. Известны также: промежуточная форма, с признаками и СМТ1, и СМТ2; и спинальная форма СМТ, с
8 вовлечением в патологический процесс спинного мозга [Chance Ph.R, Fischbeck К.Н., 1994; Bort S. et aL, 1997].
На сегодняшний день известно порядка двадцати различных генов, ответственных за формирование фенотипа СМТ, Белки, кодируемые этими генами, вовлечены в различные клеточные процессы, такие как; формирование структур цитоскелета, ядерной оболочки, миелина; транспорт небольших молекул внутри и вокруг миелиновой оболочки; энергообмен; передача сигналов; клеточная пролиферация и дифференцировка; аксональный транспорт; среди них есть факторы транскрипции; онкогены; белки теплового шока, и ряд других цротеинов, выполняющих различные внутриклеточные функции. В последние годы описываются все новые гены, причастные к формированию этой патологии [Bolino A. et al., 2000; Street V.A. et al., 2002; Antonellis A et ah, 2003; Azzedine H. et al., 2003; Senderek J. et al., 2003; Street V.A. et al., 2003; Verhoeven K. et al., 2003; Evgrafov O.V. ct al, 2004; Hirano R. et al., 2004; Kijima K. et aL, 2005; Tang B.S. et al., 2005; ZuchnerS. ctal., 2005].
Несмотря на многообразие уже известных форм СМТ, до сих пор описываются новые клинические варианты [Bergmann С. et aL, 2000; Jordanova A. et aL, 2003; Vucic S. et aL, 2003; Tazir M. et aL, 2004; Sacco S. et aL, 2004; Boseley M.E et al., 2005], Среди уже описанных форм - далеко не у всех известен биохимический дефект. Поэтому выявление генов, связанных с формированием СМТ-фенотипа, и поиск в них точечных мутаций, приводящих к развитию патологии, является одним из важнейших направлений в исследовании этого заболевания. Сведения о генетических дефеїсгах при СМТ делают возмолаїьш проведение медико-генетического консультирования в семьях на новом уровне, включая досимптоматическую и пренатальную диагностику, а в дальнейшем - и генную терапию.
Клини ко-генетическое изучение нейропатии Шарко-Мари-Тус активно проводится во всем мире: в Европе [Barisic N., Mihatov L, 2000; Boerkoel C.F, et aL, 2003; Di Maria E. et aL, 2004; Stojkovic T. et aL, 2004; Kochanski A., 2005;
9 McEntagart M.E. et al, 2005]; в Северной Африке [Azzedine H. et al, 2003;
Birouk N. et al., 2003; Kakar R. et al. 2003; Tazir M. et al., 2004]; в азиатском регионе [Нігало R. et al, 2004; Lee Y.C. et al., 2004; Tang B.S. et al, 2004, 2005; Zhang R.X. et al., 2004, 2005; Kijiim K. et al, 2004, 2005; Shimohata M. et al, 2005]; в Северной и Южной Америке [Berghoff С, et al, 2004; Bosefey MR et al, 2005; Marques W. Jr. et al, 2005; Saifi G.M. et al, 2005; Shirk AJ. et al, 2005]. В последнее время такие работы осуществляются и в нашей стране [Mersiyanova LV. et al, 2000; Одинокова О.Н. и др., 2002; Evgrafov O.V. et al, 2004], Учитывая клиническую и генетическую гетерогенность СМТ, с одной стороны, а также этническую и территориальную специфичность в распределении мутаций с другой, важным представляется как можно больший охват популяций клиническими и молекулярно-генетическими исследованиями. Популяции различаются по распространенности клинических форм, по распространенности мутаций, приводящих к патологии. Наиболее частой является форма СМТ1А, в основе которой лежит дупликация в 17plL2, в то время как точечные мутации при СМТ регистрируются во многих генах, но, как правило, их частота невысока и нередко они уникальны ~ то есть, описаны лишь для одной семьи. В связи с этим, вызывает несомненный интерес исследование встречаемости различных форм заболевания и спектра мутаций, их вызывающих, как в относительно замкнутых этнических группах, в которых наиболее часто описываются новые формы заболевания, так и в более открытых популяциях, для которых характерно включение в генофонд компонентов других этносов. Более подробное изучение новых редких субтипов зачастую приводит к интересным результатам. Во всем мире наиболее часто регистрируется форма СМТ1, причем более половины всех случаев СМТ связаны с 1,4 Mb дупликацией в 17-й хромосоме. Поэтому при изучении СМТ представляется целесообразным начинать молекулярно-генетический анализ с изучения сцепления данного заболевания с локусом 17р11.2; затем проводить изучение кодирующих последовательностей генов, наиболее часто являющихся
10 причиной заболевания, а именно - генов РМР22, Сх32, Р0 и NF-L. Вопросы клиники и генетики СМТ не решены, что делает актуальным расширение как спектра изучаемых этносов, так и поиск приводящих к патологии генов и мутаций в них.
-і Цель исследования:
Провести сравнительный молекулярно-генетический анализ
демиелинизирующих форм нейропатии Шарко-Мари-Тус, сцепленных с
локусами 17рП,2, lq21.3-23, Xql3,l и 8р21, в группах больных из двух
регионов - Западной Сибири и Таджикистана.
Задачи:
Изучить полиморфизм ДНК-маркеров DJ7S92J, D17S1358, D17S839, D17S1356 в локусе ПрП.2, связанном с наиболее распространенной формой наследственной нейропатии Шарко-Мари-Тус - СМТ1 А,
Оценить информативность маркеров Dl7S921, Dl 7S1358, Dl 7S839, D17S1356 для медико-генетического консультирования в семьях больных с клиническим диагнозом нейропатия Шарко-Мари-Тус из Западной Сибири и Таджикистана. Для выявления форм заболевания, сцепленных с мутациями в локусе 17РІ1.2, в обследуемых семьях провести сегрегационный анализ данных полиморфных STR-локусов с заболеванием,
Изучить встречаемость дупликационных вариантов СМТ1А в локусе 17р11.2 в группах больных из Западной Сибири и Таджикистана.
Провести поиск точечных мутаций в кодирующих регионах генов РМР22, Сх32, P0t NF-L в группах больных с нейропатией Шарко-Мари-Тус из Западной Сибири и Таджикистана.
Предложить алгоритм молекулярно- генетической диагностики для медико-генетического консультирования семей больных с наследственной нейропатией Шарко-Мари-Тус.
Научная новизна.
В результате выполненного исследования получены новые данные о молекулярно-генетической гетерогенности нейропатии Шарко-Мари-Тус у больных из Западной Сибири и Таджикистана, В таджикской популяции показана низкая частота встречаемости дупликации в регионе 17р11.2, являющейся наиболее частой мутацией при СМТ в мире. Получены новые данные об информативности используемых микросателлитных ДНК-маркеров для целей медико-генетического консультирования семей в
-і
исследованных популяциях- Изученные STR-локусы впервые
охарактеризованы в Западной Сибири и Таджикистане, С помощью STR-маркеров D17S92U D17S1358, D17S839, D17S1356 в локусе 17р11.2 показаны популяционные особенности выборки русского населения Западной Сибири и коренного населения Таджикистана (таджики).
Практическая значимость.
Получены данные об информативности изученных полиморфных ДНК-маркеров для целей медике^генетического консультирования. Выявлены семейные случаи заболевания, причиной которых являются точечные мутации в гене Сх32 (локус Xql3.1), дупликация в 17 хромосоме (локус 17pl 1.2-12); а также семьи с полиморфным вариантом в гене MPZ (локус lq21.3-23). Результаты работы используются для целей медико-генетического консультирования в семьях с наследственными: мотосенсорными нейропатиями. В практику здравоохранения сибирского региона внедрена диагностика некоторых форм демиелинизирующей нейропатии Шарко-Мари-Тус, связанных с локусами 17рП.2 (ген РМР22), lq21.3-23 (ген Р0), XqB.l (ген Сх32) и 8р21 (ген NF-L) (формы СМТ1А, СМТ1В, СМТЗА, СМТЗВ, СМТХ1, CMT1F и СМТ2Е), позволяющая осуществлять выявление носителей мутации, проводить раннюю (доклиническую) диагностику и, в последующем, дородовую профилактику заболевания.
12 Положения, выносимые на защиту:
Спектр частот аллелей и гетерозиготность исследованных STR-маркеров DJ7S92J, D17SI358, D17S839, D17S1356 в локусе 17р11.2 в Таджикистане и Западной Сибири существенно отличаются от описанных ранее и друг от друга, показывая значительные вариации между изученными популяциями и различную информативность для медико-генетического консультирования в семьях.
В Западной Сибири дупликация в регионе 17р11.2 является наиболее частой причиной патологии у больных с клиническим диагнозом нейропатия Шарко-Мари Туе.
Наиболее частой формой нейропатии Шарко-Мари-Тус в Таджикистане является Х-сцепленная форма - СМТХ1, с мутациями в кодирующей последовательности гена Сх32.
Точечные мутации в кодирующих последовательностях генов РМР22, РО и NF-L не относятся к категории частых у пришлого населения Западной Сибири и коренного населения Таджикистана.
Апробация работы:
Основные результаты работы были представлены в виде докладов или стендовых сообщений: на конференциях молодых ученых СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2000, 2001, 2002); на I международной конференции «Проблема вида и видообразования» (Томск, 2000); на Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (Москва, 2003); на научных конференциях ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН «Генетика человека и патология» (Томск, 2002, 2004); на V международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке" (Томск, 2004); на съезде Европейского общества генетиков человека (Прага, 2005); на V съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005); на V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005).
Клиническая картина и основы классификации наследственных двигательно-сенсорных нейропатии
В структуре неврологических заболеваний существенное место занимают наследственно-дегенеративные патологии, подавляющее большинство которых проявляется в детском возрасте [Бадалян Л.О. и др., 1971], Это группа тяжелых генетически гетерогенных болезней периферической нервной системы, характеризующихся выраженным клиническим полиморфизмом; как меж-, так и внутрисемейным, а также различными нейрографическими показателями, которые необходимо учитывать при диагностике [Юдина ГЛС и др., 2004]. Разные формы передаются как по аутосомно-доминантному, так и по аутосомно-рецессивному и Х-сцепленному путям наследования- Классификация группы двигательно-сенсорных нейропатий до сих пор не установилась окончательно: с появлением более детальной генетической информации выделяют все новые формы этой патологии.
В клинической практике часто используется старая медицинская терминология, основанная на синдромальном описании. Очерчивают, по крайней мере, 3 близких по клиническим характеристикам формы: невральная амиотрофия Шарко-Мари-Тус (перонеальная мышечная атрофия), иптерстициальный гипертрофический неврит Дежерина-Сотта (семейная полиневропатия), наследственный синдром атаксии-арефлексии (Русси-Леви) [Андреев И, и др., 1981; Бадалян Л.О., 1984; Берман Р,Е. и др., 1989; Шмидт Е.В. и др., 1989]. Патологические проявления этих нозологии достаточно сходны, с незначительными особенностями для каждой. Наследственная мото-сенсорная нейропатия, таким образом, представляет собой медленно прогрессирующее заболевание, основным признаком которого является атрофия мышц в дистальных отделах нижних конечностей (в первую очередь мышцы, иннервируемые п. Peroneus). Первые симптомы слабость в ногах, быстрая утомляемость, парестезии, нередко мышечные боли — «крампи», отсутствие или значительное снижение сухожильных рефлексов; иногда присутствует положительный симптом Бабинского. Нередко имеются чувствительные расстройства по типу чулков и носков. Появляются характерная походка степпаж (англ. steppere - трудовая лошадь); выявляются фридрейхова стопа, кифосколиоз. При исследовании электровозбудимости обнаруживается частичная или полная реакция перерождения; на элсктромиограмме виден ритм «частокола» (отдельные пики). Как правило, определяют выраженное снижение скорости проведения импульса (СПИ) по моторным и сенсорным волокнам. Наряду с электромиографией большое диагностическое значение имеет гистологическое исследование биопсийного материала мышц. При патоморфологическом исследовании., обнаруживают дегенеративные изменения задних корешков, периферических нервов (может выявляться гипертрофическая невропатия), задних и боковых столбов спинного мозга. Изменения в мышцах носят вторичный характер. Процесс постепенно распространяется на проксимальные отделы конечностей [Андреев И. и др., 1981; Бадалян Л.О,, 1984; Берман Р.Е. и др., 1989; Шмидт Е,В. и др., 1989;
Яхпо Н.Н., 1995]. Для лечения таких больных предлагаются сходные комплексные симптоматические подходы: витаминотерапия (преимущественно группы В), общеукрепляющая терапия (аминокислоты, АТФ), антихолинэстеразные препараты физиопроцедуры, массаж, лечебная физкультура и ортопедическое лечение (в тяжелых случаях - тенотомия). Подчеркивается, что при синдроме Дежерина-Сотта следует избегать охлаждения, тяжелой физической нагрузки. [Бадалян Л.О., 1984; Шмидт Е,В. и др., 1989]- Мужчины болеют несколько чаще, чем женщины. При этом в клинических руководствах встречаются разночтения в отношении начала манифестации разных нозологии и типа наследования [Андреев И. и др., 1981; Бадалян Л.О., 1984; Берман Р.Е. и др., 1989; Шмидт Е,В. и др., 1989].
Существующий полиморфизм клинических проявлений заболевания как в пределах одной семьи, так и межсемейный в границах одной формы, и в то же время, сходные фенотипические проявления разных форм затрудняют диагностику. Кроме прочего, описаны и отличия в среднем возрасте манифестации при семейных и спорадических случаях одних и тех же форм, однако, еще С.Н. Давиденков высказывал мнение, что такие различия искусственны, поскольку, в случае семейного заболевания признаки патологии привлекают к себе внимание в более раннем возрасте [Давиденков С. Н., 1934]. Фактически, классическая форма СМТ встречается реже, чем атипичные [Лобзин B.C. и др., 19S4]. Поэтому изучению этих патологий уделяется много внимания: постоянно пополняются сведения о клинических ([юрмах, генетической компоненте, ведется поиск подходов к более эффективной дифференциальной диагностике. Так, например, показано, что содержание миоглобина в крови резко повышено у больных с прогрессирующими мышечными дистрофиями и амиотрофиями по сравнению с нормой. Учитывая, что количество миоглобина в крови прямо коррелирует со степенью деструкции мышечной ткани, и, соответственно, его уровень у больных с мышечными дистрофиями выше, чем у больных с невральными и спинальными амиотрофиями, этот показатель можно использовать для дифференциальной диагностики данных заболеваний [Герасимова М.М. и др., 1999]. Другим биохимическим тестом может быть измерение уровня гликозаминогликанов в моче: при нейропатии СМТ их суммарная экскреция увеличена в 2-3 раза [Бондаренко Е.С, и др., 1976], причем главным образом за счет увеличения выведения хондроитин -і сульфатов с одновременным снижением выделения гиалуроновой кислоты [Ахмадеева Л.Р. и др., 2003].
Молекулярный патогенез СМТ
Существует два различных механизма формирования компактного миелина у позвоночных - это формирование миелина центральной нервной системы (ЦНС) и периферической (ПНС), Несмотря на сходство функций, эти два типа миелина имеют различные ультраструктуру, белковую композицию, эмбриональное происхождение и генетическую основу [Kirkpatrick L.L. et al., 2001]. Во время миелиногенеза одновременно индуцируется транскрипция многих генов, кодирующих миелин-специфические протеины, что требует координации синтеза этих белков. Тщательно регулируются и перемещение как мРНК, так и белков в клеточных структурах [Wrabetz L. et aL5 2000]. В регуляции транскрипции миелиновых генов могут быть задействованы, по крайней мере, три различных сигнальных системы. Первый путь - активизация взаимодействий между аксоном и шванновскими клетками, переход к миелинизирующему фенотипу и функционирование миелин-образующих клеток. Изменения в экспрессии миелиновых генов, произошедшие во время регуляции первого пути, такие как, например, активизация гена ОСТ67 могут также изменять способность шванновских клеток отвечать на аксональный сигнал, управляя, таким образом, первым процессом в развитии или ремиелинизации. Второй путь связан уже непосредственно с белками, находящимися в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР), чувствительными к холестерину и неправильной топологии. Эти белки необходимы для регуляции биосинтеза белков и липидов. Третий путь, опосредованный, в частности, РО, так же участвует в координации регуляции экспрессии миелиновых генов, изменяя структуру ансамбля белков в миелине и их компактизацию. Эта сигнальная система, вероятно, локализована непосредственно в миелиновой оболочке или паранодальных регионах.
Нарушение любого из этих трех путей может дать начало развитию патологического процесса, ведущего к CMTL Например, недостаточность экспрессии гена EGR2 блокирует переход шванновских клеток из промиелинизирующей в миелинизирующую стадию. Точечные мутации в гене РМР22 при СМТ1 нарушают сборку миелина в ЭПР, где постепенно накапливается мутантный белок. Это увеличивает количество РМР22, доступного для формирования комплекса из белков миелина и, вероятно, изменяет каскад передачи сигнала между ядром и ЭПР в результате обратной регуляции транскрипции миелиновых генов. Недостаток РО вызывает СМТ1, мешая процессу компактизации миелина, а так же ведет к нарушениям в каскаде сигналов, связанных с адгезией, тем самым далее затрудняя регуляцию экспрессии миелиновых генов,
СМТ1 является, таким образом, результатом разрушения одного или нескольких различных, но взаимосвязанных, клеточных путей, каждый из которых необходим для нормальной миелинизации [Kamholz J. et al,, 2000], В настоящее время существует только симптоматическое лечение данной -і группы заболеваний, которое в силах замедлить прогрессию болезни, но не излечить ее. Одна из основных целей изучения иейропатии СМТ1 - это развитие молекулярных подходов к рациональной геиотерапии данного заболевания. Именно дальнейшее понимание СМТ1, как результата разрушения путей передачи сигнала (вне- и внутриклеточных), вовлеченных в регуляцию миелинизации, сможет обеспечить основу для разработки геиотерапии [Kamholz J. et al, 2000]. Роль аксональной дегенерации в формировании демиелинизипун)ших_нсйропатий. В наследственных демиелилизирующих -j нейропатиях патологические изменения затрагивают в основном миелиновую оболочку, хотя в аксолеме перехватов Ранвье или окружающих ее структурах тоже наблюдаются некоторые изменения - так называемая вторичная аксональная дегенерация [Nishimura Т. et al., 1996; Yoshikava Н. et а!., 1996]. На мышиных моделях показано, что начальные дефекты в шванновских клетках могут вести к вторичным изменениям свойств аксонов _Yin X, et al., 1998], включая подверженность аксонов дегенерации [Frei R. et al., 1999; Sancho S. et al. 1999; Wrabetz L. et al., 2000].
Известно также, что, хотя демиелипизация является патологическим физиологическим маркером СМТ1, клинические признаки болезни -мышечная слабость и сенсорная недостаточность - являются результатом не демиелинизации, а дегенерации аксонов. Например, скорость проведения нервного импульса у детей с СМТ1 снижена еще до проявления первых симптомов болезни, и с прогрессией заболевания значительно не меняется [Nicholson G.A., 1991]. Это говорит о том, что демиелинизация, как такопая, не является достаточной причиной появления признаков болезни. К тому же, у больных с СМТ1А показана четкая корреляция мышечной слабости с амплитудой моторного потенциала действия, а не со скоростью проведения нервного импульса. Данный факт также подтверждает ведущую роль аксональной недостаточности в качестве причины мышечной слабости [Kamholz J. et al., 2000; Krajewski K.M. et al, 2000]. Еще одним подтверждением ведущей роли аксональной дегенерации в развитии заболевания является анатомическое доказательство прогрессии недостаточности по длине аксона у пациентов с СМТ1, а также у мышей со сверхэкспрессией гена РМР22 [Sancho S. et al., 1999; Kamholz J. et al., 2000; Sahenk Z, et aL, 2003]. Таким образом, именно дистальная аксональная недостаточность, а не демиелинизация, является основной причиной инвалидшации при СМТ
Подготовка ДНК к молекулярно-генетическому анализу
Исследования мутаций в различных генах и более детальные изучения фенотипов Шарко-Мари-Тус, связанных с ними, показали, что, как и мутации в гене РО, мутации в гене NF-L могут приводить и к аксональным [Mersiyanova L V. et al., 2000 Georgiou D.-M. et al, 2002], и к демиелинизирующим [Jordanova A. et al., 2003] формам нейропатии. В последние годы это показано рядом авторов [Luo W. et al., 2003; Choi B.O. et a1.f 2004; Pcrez-Olle R. et al-, 2004; Andrigo C. et al., 2005], Роль гена NF-L в развитии патологии пока мало изучена, поскольку вовлеченность а их гены - сходное строение. Гены виментина (IF клеток мезенхимального происхождения), дссмина (IF мышечных клеток) и глиального фибриллярного кислого белка (IF астроцитов) содержат по 8 интронов в идентичных позициях, б из них были локализованы внутри региона, кодирующего альфа-спиральную последовательность белка. Большинство интронов в филогенетически более удаленных кератиновых (IF эпителиальных клеток) генах находятся в сходных или идентичных позициях. Ген NF-L, содержит только 3 интрона, отличаясь, тем самым, от генов остальных промежуточных филаментов. Такое же строение генов характерно и для других нейрофиламентов [Brownlees J. et aL, 20021-Нейрофиламенты формируют в аксонах параллельные лучи, которые часто пересекаются с другими такими ЖЕ пучками нейрофиламентов или микротрубочек. Отсутствие в аксонах нейрофиламентов приводит к прекращению радиального роста аксонов. Не менее интересным фактом является и то, что у мышей с .мутацией Trembler (в гене ртр22) одним из первых дефектов описаны уменьшение фосфорилирования NF-H, увеличение плотности нейрофиламентов и иигибирование нормального радиального роста аксонов [Hirokawa N., Takeda S., 1998].
Как и остальные члены семейства промежуточных филаментов, нейрофиламенты имеют общую структурную организацию, включающую центральный альфа-спиральный стержне видный домен, который фланкирован N-терминальным головным и С-терминальным хвостовым доменами. Центральные стержневидные домены облегчают формирование попарно скрученных олигомеров, которые затем собираются в филаменты диаметром 10 нм. Существует высокая консервативность N-терминального головного домена от Xenopus до млекопитающих. Полагают, что N-терминальный головной домен регулирует сборку протеинов в филамент, а С-термипальные хвостовые домены NF-M, NF-H (которые длиннее, чем NF-L) формируют боковые «ручки», которые выступают из филамента и способны формировать разводки между нейрофиламентами и другими органеллами аксоплазмы [Brownlees J. et al., 2002], J. Brownlees с соавт, (2002) установили, что две мутации (NF-Lrn58Arfi и NF-LGln333I ra) в гене NF-L разрушают сборку нейрофиламентов и аксональный транспорт. Однако влияние разных мутаций NF-L при СМТ на сборку и архитектуру нейрофиламентов остается неизвестным [Brownlees J. ct ah, 2002]. -і Эксперименты на нокаут-мышах по гену nf-l показали, что, потеря белка NF-L приводит к сильной редукции уровня белков NF-M и NF-H в головном мозге и седалищном нерве, хотя было определено повышение уровня других белков цитоскелета. Несмотря на отсутствие нейрофиламентов и гипотрофию аксонов, «/-/-нокаут мыши развивались нормально. Однако и у гомозиготных, и у гетерозиготных по мутациям в nf-l мышей отсутствовала нормальная регенерация мислинизированных нервных волокон после их разрушения. Процесс регенерации в этом случае был сильно замедлен, а значит, нейрофиламент играет роль в созревании регенерирующих миелинизированных аксонов [Mersiyanova I.V. et al., 2000]» M.D. Nguen с соавт. предположили, что нейрофиламенты в моторных нейронах могут играть роль и фосфорнлировании, ингибируя активность проводящих ее белков, уменьшая тем самым вредное гиперфосфорилирование нейрональных субстратов [Nguyen M.D, et al., 2001].
Таким образом, в формировании СМТ на клеточном уровне принимают участие многочисленные биохимические процессы, задействовано большое количество белков с различными функциями и гены, кодирующие их- Лишь взаимодействие всех этих механизмов приводит к окончательному клиническому проявлению, к формированию определенного фенотипа. До сих пор остаются неясными многие вопросы патогенеза заболевания, а именно: причины вариаций в проявлении тяжести заболевания и неполной пенетрантпости при изменении дозы гена (удвоение дозы гена РМР22 при дупликации в локусе 17р11.2)
Исследование полиморфизма микросателлитных повторов D17S921, D17S1358, D17S839, D17S1356 влокусе 17pl 1.2 в популяционных выборках
Среди большого числа мутаций, приводящих к формированию СМТ-фенотипа, наиболее часто регистрируется дупликация в локусе 17р11.2 размером 1,4 млн. п.о. [Nelis Е. et al., 1996; Timmerman V. et al., 1996b; Young P. et al., 1996], Поэтому при изучении пейропатии Шарко-Мари-Тус в первую очередь целесообразно проводить поиск дупликаций в этом регионе, а затем - мутаций в генах, наиболее вероятно вовлеченных в формирование патологии. Субмикроскопические дупликации и делеции являются геномными перестройками, и заболевания, возникающие в результате таких перестроек, могут быть классифицированы как геномные. СМТ1А является, таким образом, примером хорошо охарактеризованного геномного заболевания [Inoue К. et al., 2001]. В регионе СМТ1А дупликации/HNPP делеции локализовано порядка 30-50 различных генов. Интересно то, что из них только ген РМР22 является дозочувствительным; то есть изменение дозы гена модифицирует фенотип. Хотя формально остается вероятность минорного эффекта различных нарушений в других генах этого региона, влияющего на вариабельность проявления заболевания [Inoue К. et al., 2001]. Дупликация не выявляется стандартными цитогенетическими методами. Но для ее определения разработан целый ряд подходов, как-то: FISH-анализ, детекция дополнительных фрагментов при пульс-гель электрофорезе (PFGE), выявление дозовых различий между длинами полиморфных рестрикционных фрагментов (RFLP), детекция трех уникальных аллелей при анализе полиморфных STR-маркеров [Roa В.В. et al, 1996; Chang J.-G, et al., 1993], Информативность методов FISH и PFGE достаточно высока [Nelis E. et al., 1996]; FISH, кроме этого, позволяет выявлять мозаицизм при СМТ1А [Sorour Е. et al., 1995], Тем не менее, указанные методы трудоемки и требуют использования дополнительного сложного оборудования и вовлечения специальных методических подходов. При анализе STR-маркеров чаще всего используют дозочувствительную методику с применением блот-гибридизации [MuraKami Т. et al, 1995; Roa В.В, et al., 1996a; Tarroni F. et al-, 1995]. Однако количественная оценка является довольно субъективной и представляет собой трудную задачу. Кроме того, эта процедура часто подразумевает использование радиоизотопов, что является ее несомненным недостатком. Вместе с тем, микросателлитный анализ возможно осуществлять и прямой детекцией исследуемых аллелей на полиакриламидных гелях. Наиболее надежно для диагностики, если при микросателлитном анализе выявляются три аллеля. Информативность и блот-гибридизации, и микросателлитного анализа в ПААГ напрямую зависит от гетерозиготпости используемых ДНК-маркеров.
Анализ микросателлитных повторов традиционно применяется при непрямой диагностике наследственных заболеваний, поскольку позволяет изучать не только больных, но и семьи в целом, проводить в них сегрегационный анализ. При исследовании нейропатии Шарко-Мари-Тус микросателлитный анализ может использоваться и для проведения прямой диагностики, так как однозначно указывает на наличие дупликации при выявлении на геле трех аллелей или удвоении дозы одного из аллелей у больных. При диагностике геномных перестроек, в частности - при выявлении дупликации/делеции при CMT/HNPP, подобные исследования несут в себе наибольший объем информации. В качестве обязательного этапа таких исследований предусматривается анализ частот аллелей и " информативности анализируемого ДНК-маркера в рассматриваемой популяции.
Для выявления дупликации с помощью микросателлитного анализа в литературе предложено использовать панель из 9 динуклеотидных STR-маркеров, достаточно информативных и в совокупности позволяющих выявлять дупликацию у 85% СМТІА пациентов [Blair LP, et aL, 1995; Cndrey С, et al., 1995]. Из этого списка нами были выбраны 4 (табл. 4). Выбор маркеров осуществлялся на основе их гетерозиготности3 спектра выявляемых аллелей и оптимальности размера айализируемых фрагментов (данные, взятые из GDBS получены по результатам исследований европеоидов),
