Содержание к диссертации
Введение
1. История и состояние вопроса 11-30
I.I.Области применения экспериментальной полиплои дии в селекционной работе с плодовыми и ягодными культурами II—15
1.2. Сиетематическая принадлежность и цитологическая характеристика смородины и крыжовника 15-17
1.3.Экспериментальная полиплоидия смородины и крыжовника 18-20
1.4.Методы полиплоидизации растений 20-30
2. Материал и методика исследований 31-33
3. Разработка и совершенствование методов получения полиплоидных форм черной смородины и крыовника 33-82
3.1.Обработка прорастающих семян водным раствором колхицина совместно с глюкозой и без нее 33-40
3.2.Получение полиплоидов воздействием на сеянцы водным раствором колхицина, с предварительной частичной синхронизацией фаз деления клеток стеблевой меристемы 40-46
3.3. Индуцирование полиплоидов опрыскиванием надземной части сеянцев водным раствором колхицина 46-48
3.4.Применение аценафтена в качестве полиплоидогенного вещества 48-50
3.4.1. Воздействие парами аценафтена на клетки стеблевой меристемы молодых сеянцев смородины и крыжовника 50-51
3.4.2. Воздействие масляным раствором на стеблевую меристему сеянцев смородины и крыжовника, 51-54
3.4.3. Применение аценафтена для получения нередуциро ванной пыльцы 54-61
3.5. Предварительная обработка материала с целью точного подсчета хромосом в клетках опытных растений 61-63
3.6. Изучение онтогенетических изменений полиплоиди-зируемых растений смородины и крыжовника и идентификация полиплоидов на разных этапах развития 63-82
4. Цитогенегический и вдтоэмбриологический анализ экспериментальных тетраплощщых форм кршювника 83-133
4.1. Микроспорогенез у тетрашюидных и диплоидных форм крыжовника 85-110
4.2. Влияние температурного фактора на сроки наступления, продолжительность редукционного деления и качество пыльцы у тетрашюидных форм ІІ0-ІІ7
4.3. Особенности микрогаметогенеза;' ІІ7-І25
4.4. Особенности макроспоро- и макрогаметогенеза 125-134
5. Изучение особенностей у перспективных тетраплоидных форм кршовника и черной смородины 135-154
5.1. Автотетраплоидные формы крыжовника 135-145
5.2. Тетраплоидные формы черной смородины 145-154
Обсуждение 154-167
Выводы 168-170
Практические рекомендации і70-і7і
Список использованной
Литературы 172-198
- Сиетематическая принадлежность и цитологическая характеристика смородины и крыжовника
- Индуцирование полиплоидов опрыскиванием надземной части сеянцев водным раствором колхицина
- Изучение онтогенетических изменений полиплоиди-зируемых растений смородины и крыжовника и идентификация полиплоидов на разных этапах развития
- Влияние температурного фактора на сроки наступления, продолжительность редукционного деления и качество пыльцы у тетрашюидных форм
Сиетематическая принадлежность и цитологическая характеристика смородины и крыжовника
В вопросах классификации смородины и крыжовника единого мнения нет. Большинство систематиков, в том числе А. Л. Тахта джян (1966) и С.К. Черепанов (1973), относят смородину и кры жовник К СЄМ. (irossulariaceae DC. , Другие - Н.К. Смольяни нова (1968) к сем. Saxifragaceae Juss . В более узком плане смородину и крыжовник рассматривают или как виды одного рода Ribes L. , ( Тахтаджян, 1966), или выделяют их в два самосто ятельных рода Kibes L. И (irossularia DC. (Berger , 1924; Пояркова,1939; Лозина-Лозинская,1954; Черепанов, 1973).
Янчевский ( Janczewski ,1907 ), один из первых исследователей смородины и крыжовника, на основании изучения огромного числа видов (более 160), расчленил род, Ribes на 6 под-родов: Ribesia Goreosma » Grossularioides » Gros-suiaria Pariiia » Berisia Им установлено, что скрещивание видов возможно не только внутри подродов, но и между вицами разных подродов, резко различающихся по своим морфологическим признакам.
Позже Редер ( Kehder , 1954) все многообразие видов смородины и крыжовника объединил в 15 секций и 4 подрода::Berisia , Grossuiaria , Grossularioid.es И Ribesia , также не выделяя крыжовник в самостоятельный род. Е.Кип ( Keep ,1962), анализируя гибридное потомство от скрещивания разных видов смородины и крыжовника по степени их фертилъности, и в целом, считая систему Редера наиболее рациональной, сочла целесообразным выделить из 7 секций подрода Rlbesia несколько самостоятельных подродов: Microsperma , Уутріюсаіух , Heritiera , Ei-besia , (Jalabotria с двумя секциями Oalobotria И Eucoreosma . Исходя из ее классификации, виды внутри секций будут легко скрещиваться и давать фертильное потомство, внутриподродовые гибриды, в образовании которых принимали участие виды из разных секций, должны характеризоваться слабой фертильное тью, а полученные межподродовые гибриды должны быть стерильными.
Американский исследователь Бергер ( Berger, 1924), на основании резких морфологических различий, выделил крыжовник из рода Ribes в самостоятельный род Grossuiaria , Согласно его классификации род Grossuiaria , включающий 52 вида, поделен на 4 подрода: Eebsenia, Hesperia, Lebbia, Eugrossularia, а род Ribes , насчитывающий свыше НО видов - на 6 подродов: Ribesia, Grossularioides, Eucoreosma, Galobotria, Berisia, Rarilla.
Во многих советских академических изданиях, в частности, ВО " Флоре СССР " (I939)jRibes и Grossuiaria описываются А.И. Поярковой как отдельные роды. Такую точку зрения разделя - 17 ют К.Д. Сергеева (1969), А.Ф. Попова (1970), посвятившие много лет селекционной работе с крыжовником и смородиной.
Определению степени генетического родства организмов порой способствует изучение различий в строении наиболее консервативных элементов, к которым, по мнению Б.А. Поддубной-Арнольди (1976), относятся женский и мужской гаметофиты у растений. В результате сравнительного изучения развития и строения женской генеративной сферы у крыжовника отклонённого и смородины альпийской В.Ю. Мандрик (1969) пришла к выводу, что между этими культурами имеет место наличие родовых отличий в развитии, семяпочек, макроспорогенеза, гаметофитогенеза, а также в форме и функционировании элементов зародышевых мешков и считает более правильным выделение рода Grossuiaria из рода Kibes в представленной работе мы рассматриваем смородину и крыжовник как представителей родов Eibes ь. u cirossuiaria но. , относящихся к семейству Grossulariaceae DC.
Первые работы по цитологическому изучению рода Kibes L.( по Янчевскому) были выполнены в начале XX века немецким ученым Тшплером ( Павлова,1931 ). На основании изучения 12 чистых видов и трех отдаленных гибридов им было установлено диплоидное число хромосом для смородины и крыжовника, равное 16.
Меурману ( Meurman, 1928) иДарлингтону ( Darlington ,1928), значительно расширившим объем исследований, обнаружить растения с иным числом хромосом не удалось. Позже Зелинскиі; ( zielinski, 1953), обследовав 60 видов смородины и крыжовника, также не обнаружил у них других чисел хромосом.
Индуцирование полиплоидов опрыскиванием надземной части сеянцев водным раствором колхицина
При обработке точек роста проростков и молодых сеянцев применяют различные приемы колхицинирования: полное погружение надземной части в раствор колхицина, нанесение раствора или накладывание смоченных ватных тампонов, подведение к точке роста раствора с помощью ватного или марлевого фитиля и т.д. В некоторых случаях ( при получении полиплоидов табака ) надземную часть растений опрыскивали раствором колхицина ( Терновский, 1971 ) . Для предотвращения быстрого испарения колхицина и лучшего сохранения его на растении применяют смесь колхицина с различными веществами: глицерином, желатином, агар-агаром, касторовым маслом. Для лучшей проницаемости и смачивания рекомендуется добав -лять к раствору в небольших дозах такие вещества, как твин-80, ( Hull , Britton , 1958 ) или метилцеллюлозу ( Терновский, 1971 ). В связи с тем, что опыты по получению полиплоидов смородины и крыжовника, опрыскиванием надземной части сеянцев ранее не проводились, необходимо было испытать эффективность данного приема. С этой целью верхушки сеянцев в фазе одного настоящего листа опрыскивали из пульверизатора раствором колхицина в концентрациях 0,5 и 1,0$. Обработку проводили в течение 2,4,7,10,15 дней, смачивая растения два раза в день в утренние и вечерние часы. Для предотвращения быстрого испарения колхицина, ящики с опытными сеянцами плотно покрывали полиэтиленовой пленкой. В каждом варианте опыта, обрабатывали по 50 растений.
Сеянцы, обработанные однопроцентным раствором колхицина, находились в угнетенном состоянии, прекратили рост и большинство из них через некоторое время погибло. Это явление можно, объяснить не только отрицательным воздействием повышенной дозы колхицина на клетки, но и токсичным влиянием его при попадании на корни растений через почву. Общая тенденция угнетения растений наблюдалась и при обработке сеянцев 0,5% раствором колхицина. В вариантах опыта, с 2, 4, 7-дневным воздействием видимого эффекта изменения морфологических признаков обнаружено не было. В период обработки рост растений приостанавливался, а по окончании опрыскивания, через 6-8 дней, вновь возобновлялся. Десяти- и пятнадцати - 48 дневное воздействие колхицина вызвало морфологические изменения выживших растений, среди которых нам удалось выделить полиплоидные формы. Полученные полиплоиды составляли у смородины не более 4? а у крыжовника - не более 2% от числа обработанных растений ( табл. 5 ).
Анализ полученных результатов показывает, что обработка надзеглнои части сеянцев путем опрыскивания их раствором колхицина не может быть рекомендована селекционерам для создания исходного материала из-за большой гибели опытных сеянцев, низкого выхода полиплоидных растений и значительного расхода колхицина.
Опытами А.А. Шмука и Г.С. Ильина (1938) было установлено, что на растения действуют непосредственно пары аценафтена, вызывая у них морфологические изменения. Обработке аценафтеном могут быть подвергнуты прорастающие семена, точки роста, тычинки и пестики взрослых растений. Водный раствор аценафтена для большинства культур малоэффективен из-за крайне слабой растворимости реагента ( 0,002% ), а непосредственный контакт растений с кристаллами аценафтена не допустим, так как приводит к их гибели. Б период обработки всё растение или отдельные его органы должны быть заключены в изоляторы, содержаще пары аценафтена. В качестве изоляторов используют чашки Петри, полиэтиленовые мешки, стеклянные колпаки и т.д. Чтобы кристаллы аценафтена лучше удерживались на стенках и не соприкасались с тканями растений, внутреннюю поверхность изоляторов смазывают вазелином, ланолиновой пастой или обрабатывают раствором аценафтена в серном эфире. После испарения растворителя кристаллы аценафтена равномерно распределяются по поверхности и довольно прочно удерживаются на ней. Заключенные в такие изоляторы растения или отдельные их органы будут испытывать воздействие паров аценафтена. Решающим фактором при обработке аценафтеном является соблюдение температурного режима, так как летучесть этого вещества резко зависит от температуры. Опыты, проведенные А.А. Шмуком ( 1951 ), показали, что летучесть аценафтена резко возрастает с повышением температуры. Так при +20 концентрация паров аценафтена в одном литре воздуха составляет 0,01 мг,при +30 - 0,03 мг, а при +50 - уже достигает 0,2 мг, т.е. возрастает почти в 7 раз.
Изучение онтогенетических изменений полиплоиди-зируемых растений смородины и крыжовника и идентификация полиплоидов на разных этапах развития
С целью выявления действия пониженной температуры на разброс и укорочение хромосом корешки и молодые листочки полиплоидизи-руемых растений смородины и крыжовника перед фиксацией помещали в сосуды с дистиллированной водой и выдерживали при температуре около нуля градусов в течение 12-24 часов. После фиксации и окрашивания установили, что данная температура при 24-часовом воздействии приводит к сокращению хромосом, однако , разброс их в экваториальной плоскости не всегда удовлетворительно для цитологического анализа.
В качестве химических веществ для укорочения хромосом применяют парадихлорбензол, кумарин, 8-оксихинолин, с(-монобромна-фталин, колхицин и др. Некоторые исследователи ( Гечев, 1972; Будин, Крашенинник, 1976 ) и другие применяют последовательную или совместную обработку растворами двух или более веществ. Применение малоконцентрированных растворов колхицина, хорошо зарекомендовавших себя, при исследовании чисел хромосом у земляники ( Зурдыкулов,1973 ), оказалось неэффективным при подсчете хромосом в корешках и листочках смородины и крыжовника. Хромосомы, хотя и значительно сокращаются, остаются лежать в клетке скученной массой. Хорошие результаты по укорочению хромосом смородины и крыжовника дает обработка молодых корней и листьев этих культур водным раствором кумарина и парадихлорбензола, но при этом разброс хромосом не всегда позволяет точно их подсчитать.
В наших опытах наилучшим оказался комплексный раствор, для приготовления которого берутся в соотношении I : I насыщенный раствор парадихлорбензола и насыщенный раствор J - монобромнафта-лина. Незадолго до предобработки оба раствора смешивают и мате -риал выдерживают в этом растворе 6-8 часов при температуре +8-10. Испытанный раствор позволяет получить четкий разброс и укорочение хромосом и точно определить их число в вегетативных клетках полиплоидизируемых растений смородины и крыжовника (рис.5 и 6).
При воздействии полиплоидогенными средствами на делящиеся инициальные или меристематические клетки в большинстве случаев меньшая или большая часть их переходит на тетраплоидный уровень и в зависимости от этого по-разному протекает дальнейшее разви -тие организма. Если преобладают диплоидные клетки, они, как пра -вило, в дальнейшем подавляют развитие полиплоидных клеток. При этом растения, имевшие в начальный период признаки полиплоидных форм, в дальнейшем продолжают свое развитие как диплоидные. Если же полиплоидизации подвергалось большинство делящихся клеток, то они могут со временем вытеснить диплоидные клетки, и растения полностью переходят на тетраплоидный уровень. Может иметь место и явление миксоплоидии, при котором в одних и тех же тканях развивающегося организма нормально функционируют диплоидные и полиплоидные клетки, что было отмечено нами (Трунин, 1970) и други -ми исследователями (Чувашина, Шелаботин,1969; Бавтуто, Волуз - 65 нев, 1970 ) при индуцировании полиплоидов смородины и крыжовника. Помигло перечисленных явлений у опытных растений возможна полиплои-дизация отдельных тканей или участков. В результате этого на одном и том же растении развиваются побеги с разной плоидностью, из которых выделяют и выращивают константные тетраплоиды.
Конус нарастания стебля у покрытосеменных растений состоит из нескольких гистогенных слоев ( Синнот,1963 ). Перевод на тет-раплоидный уровень клеток внешнего слоя 3J- І приводит к образованию химер с полиплоидным эпидермальным слоем. Очевидно, химеры такого типа существенного значения для селекции иметь не будут. Полиплоидизация субэпидермального гистогенного слоя -2 ведет к формированию химер с полиплоидной спорогенной тканью. Растения, выращенные из семян, собранных с таких химерных экземпляров, будут полностью полиплоидными. У плодовых и ягодных растений такие химеры могут быть сохранены и закреплены вегетативным размножением.
В результате обработки полиплоидогенными веществами прорастающих семян и сеянцев смородины и крыжовника возникают, как правило, растения разной степени химерноети, которые по внешним морфологическим признакам можно разделить на две группы. Растения первой группы внешне не отличаются или мало чем отличаются от контроля. У растений второй группы сразу же после обработки колхицином или аценафтеном приостанавливается рост, а затем при возобновлении появляются характерные для химер морфологические изменения: утолщение побегов,темная окраска и кожистость листовых пластинок, которые имеют неправильную форму и сидят на укороченных, довольно хрупких черешках.
Влияние температурного фактора на сроки наступления, продолжительность редукционного деления и качество пыльцы у тетрашюидных форм
Наряду с генотипическими особенностями организма значительное влияние на процесс редукционного деления и качество пыльцы оказывают внешние условия, и в частности температурные.
Крыжовник относится к растениям, рано вступающим в период вегетации. Развитие и прохождение им определенных фенофаз теснейшим образом связано с температурными условиями. Так, раздвижение почечных чешуи у него начинается при максимальной температуре воз духа + 10-12 и при минимальной температуре не ниже 0. При минимальной температуре воздуха + 2-4 начинают распускаться.почки. Зацветает крыжовник не раньше, чем установится минимальная температура + 6-7, а максимальная + 17-18 (Павлова М.А., 1968).
Цветковые кисти у тетраплоидных форм крыжовника малоцветковые и состоят из одного, двух и реже трех цветков. Порядок развития и распускания цветков в соцветии акропетальний, причем верхние цветки часто сильно отстают в своем развитии от нижних. В той же последовательности начинается и протекает в соцветіш мейоз. Начало редукционного деления зависит также от взаимного расположения побегов в пределах куста, раньше оно начинается у основания куста, где создаются более благоприятные условия.
Мейоз у полученных нами тетраллоидных форм крыжовника в районе Мичуринска наблюдается ( за исключением отдельных лет) в первой или во второй декаде апреля, что соответствует фазе зеленого конуса растений. В период выдвижения бутонов в пыльниках одноцветковых кистей редукционное деление МКМ уже бывает закончено, пыльцевые мешки наполнены пыльцой и только в более молодых верхних бутонах трех- и двухцветковых соцветий еще возможны завершающие фазы мейо-за. Рисунок 31 показывает варьирование среднесуточных температур воздуха в премейотически? период и период мейоза с 21 марта по 3 мая в наиболее контрастные ( с точки зрения начала, продолжительности деления и степени нарушении его фаз) годы. Такими были 1977 и сравнительные с ним 1978 и 1981 годы.
Условия весны 1977 года сложились таким образом, что в период мейоза МКМ с 9 по 12 апреля стояла теплая погода. Средняя температура воздуха в дневное время составляла +18,8,которая благоприятствовала нормальному протеканию мейоза. В этот год у тетраллоидных сеянцев 1-42-2, 1-І4-І мейоз начался 9 апреля, а у диплоидных сеянцев тех же сортов І-42-І и 1-І3-І - на день раньше. На следующий день начало мейоза было отмечено у тетра -плоидных форм І-79-І и 1-65-5 и 12 апреля - у тетраплоидного сеянца 1-57-2. Начало редукционного деления МКМ у полиплоидных форм крыжовника в сильной степени зависит от температурного режима в период, предшествующий мейозу. Раннему наступлению мейоза способствовала сравнительно высокая температура воздуха , -наблюдавшаяся в первой декаде апреля ( средняя за декаду +6,4).
: При этом максимальная температура в дневное время достигала +15,1. За это время мейоз уже закончился у тех форм, у которых он раньше начался. Резкое понижение температуры 13 апреля до +2,1, длившееся в течение трех суток, сказалось на продолжительности мейоза, в основном, у тетраплоидных форм с поздним наступлением редукционного деления.
