Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11.
2.1 Хромосомные аномалии и клеточный мозаицизм 11.
2.1.1. Классификация хромосомных аномалий 11.
2.1.2. Клеточный мозаицизм по аномалиям хромосом, общая характеристика 12.
2.1.3. Мозаичные формы анеуплоидий 13.
2.1.4. Современные подходы к исследованию мозаичных форм хромосомных аномалий 17.
2.2. Мозаичные формы хромосомных аномалий в эмбриональном развитии 18.
2.2.1. Хромосомные аномалии у спонтанных абортусов 19.
2.2.1.1. Хромосомные аномалии в материале спонтанных абортусов, выявляемые цитогенетическими методами 20.
2.2.1.2. Хромосомные аномалии в материале спонтанных абортусов, выявляемые, с помощью молекулярно-цитогенетических методов 24.
2.2.1.3. Хромосомные аномалии у повторных спонтанных абортусов 28.
2.2.1.4. Хромосомные аномалии у супружеских пар с повторными спонтанными абортами 29.
2.2.2. Летальность эмбрионов при хромосомных аномалиях 32.
2.3. Мозаичные формы различных хромосомных аномалий в постнатальном развитии 34.
2.3.1. Мозаичные формы численных аномалий плюсом (хромосомы X и Y) 36.
2.3.1.1. ХромосомаХ 36.
2.3.1.2. Хромосома Y 42.
2.3.2. Численные аномалии аутосом, их мозаичные формы 44.
2.3.2.1. Трисомия хромосомы 8 44.
2.3.2.2. Трисомия хромосомы 9 46.
2.3.2.3. Трисомия хромосомы 13 (синдром Патау) 47.
2.3.2.4. Трисомия хромосомы 18 (синдром Эдвардса) 48.
2.3.2.5. Трисомия хромосомы 21 (синдром Дауна) 50.
2.3.2.6. Трисомия хромосомы 22 (синдром «кошачьего глаза») 53.
2.4. Заключение 55.
3. Объект и методы исследования 56.
3.1. Объект исследования 56.
3.2 Методы исследования 57.
3.2.1. Цитогенетический метод 57.
3.2.1.1. Культивирование лимфоцитов периферической крови 58.
3.2.1.2. Приготовление препаратов метафазных хромосом и интерфазных ядер 58.
3.2.1.3. G-окрашивание хромосом (GTG) 58.
3.2.1.4. С-окрашивание хромосом (CBG) 59.
3.2.1.5. Принцип анализа хромосомных препаратов 59.
3.2.2. Метод получения препаратов интерфазных ядер из материала спонтанных абортусов 60.
3.2.3. Молекулярно-цитогенетические методы 60.
3.2.3.1. ДНК-полимеразная реакция замещения (ник-трансляция) 60.
3.2.3.2 Флюоресцентная гибридизация in situ: FISH на препаратах клеток с использованием проб, меченых различными флюорофорами 62.
3.2.3.3. Принцип анализа флюоресцентных сигналов после проведения гибридизации in situ 66.
3.3. Статистическая обработка полученных результатов 66.
4. Результаты собственных исследований 66.
4.1. Численные хромосомные аномалии спонтанных абортусов, выявляемые методом mFISH (группа I) 66.
4.1.1. Структура и частота хромосомных аномалий 67.
4.1.1.1. Анеуплоидия аутосом 69.
4.1.1.2. Анеуплоидия гоносом (хромосомы X и Y) 71.
4.1.1.3. Полиплоидия 74.
4.1.1.4. Случаи выявления нескольких хромосомных аномалий в одном образце спонтанного абортуса 76.
4.1.2. Анализ материнского возраста при спонтанных абортусах с различными хромосомными аномалиями 78.
4.1.3. Сроки беременности при спонтанных абортусах с различными хромосомными аномалиями 80.
4.1.4. Соотношение полов 82.
4.1.5. Обсуждение результатов исследования 86.
4.2. Обследование детей с недифференцированными формами задержки психомоторного или психоречевого развития, пороками и/или микроаномалиями развития (группа II) 94.
4.2.1. Анализ хромосомных аномалий, выявляемых цитогенетическими исследованиями 94.
4.2.2. Анализ хромосомньк аномалий, выявляемых молекулярно-цитогене-тическими исследованиями 97.
4.2.2.1. FISH исследования случаев мозаицизма, определенного цитогене-тическим методом 98.
4.2.2.2. FISH исследования при незначительной доле аномальных клеток, выявленных цитогенетическим методом 101.
4.2.2.3. FISH обследование детей со стертой клинической картиной и регулярным кариотипом, определенным цитогенетически 103.
4.2.3. Анализ соотношения полов 106.
4.2.4. Обсуждение результатов исследования 108.
4.3. Сравнение результатов исследования, полученных в двух анализируемых группах ПО.
5. Заключение 113.
6. Выводы 116.
7. Список литературы
- Современные подходы к исследованию мозаичных форм хромосомных аномалий
- Культивирование лимфоцитов периферической крови
- Случаи выявления нескольких хромосомных аномалий в одном образце спонтанного абортуса
- Анализ хромосомньк аномалий, выявляемых молекулярно-цитогене-тическими исследованиями
Введение к работе
Актуальность темы.
Достижения медицинской генетики последних лет связаны с разработкой и внедрением новых высокоэффективных технологий в диагностику наследственной патологии, в том числе и хромосомной. Несмотря на эти достижения, проблемы, связанные с изучением мозаичных форм численных и структурных аномалий хромосом, с их влиянием на эмбриональное и постнатальное развитие, по-прежнему, остаются недостаточно изученными и актуальными. Увеличение частоты врожденной патологии среди новорожденных, наблюдаемое в последнее время, также требует применения эффективных методов генетической диагностики (Ворсанова и др., 19986, 2006; Кириллова и др., 2000; Iourov et al., 2006).
Среди всей хромосомной патологии численные хромосомные аномалии остаются одной из основных причин умственной отсталости, врожденных пороков развития, а также отягощенного акушерского анамнеза (Ворсанова и др., 1999, 2006). Так, при общей частоте хромосомных аномалий в 0,5-0,8% у живорожденных численные аномалии составляют 50-60% (Bond, Chandley, 1983; Hassold et al., 1980; Iourov et al., 2006). В группе мертворожденных эти цифры выше: при общей частоте хромосомной патологии в 6-7% численные аномалии встречаются в 70-85% случаев (Machin, Crolla, 1974; Nielsen, Wohlert, 1991). Наиболее высокая частота численных аномалий хромосом наблюдается в материале спонтанных абортусов 1-го триместра беременности: при общей частоте хромосомной патологии в 45-65% численные хромосомные аномалии в этой группе составляют 92-97% (Jacobs, Hassold, 1995; Warburton et al., 1986).
При численных хромосомных аномалиях возможна и эффективна цитогенетическая диагностика. Однако мозаичные формы хромосомной патологии, когда в организме присутствуют две или более клеточных линий, сложны для диагностики (Ворсанова, 1991; Ворсанова и др., 1989,2006).
Последнее время появляется все больше работ, указывающих на связь низкопроцентного мозаицизма с клиническими проявлениями. Наличием мозаицизма можно объяснить степень тяжести заболевания при различных хромосомных синдромах. Присутствие у больного определенной доли нормальных клеток при таких хромосомных синдромах, как Шерешевского-Тернера, Клайнфельтера, Дауна, Эдвардса, трисомии по хромосомам 22 и X предполагает более благоприятный прогноз течения болезни, а своевременная эффективная диагностика мозаичных форм хромосомных аномалий способствует лечебной коррекции, особенно при аномалиях половых хромосом. Обнаружение же незначительной доли клеток с хромосомной аномалией может объяснить причину заболевания. Выявление такого «скрытого» хромосомного мозаицизма с помощью современных молекулярно-цитогенетических методов позволит провести эффективную медико-генетическую консультацию с корректным диагнозом, определить прогноз и соответствующую терапию больному ребенку .
В настоящее время осуществляется множество исследований для определения частоты мозаичных форм численных хромосомных аномалий. Проведение цитогенетических и молекулярно-цитогенетических исследований по наиболее часто встречающимся анеуплоидиям в группе детей с умственной отсталостью, врожденными пороками и/или микроаномалиями развития, а также нарушением полового развития с определением их частоты в этой группе является актуальным.
Известно, что около 50% спонтанных абортусов первого триместра беременности этиологически связаны с численными хромосомными аномалиями плода или плаценты (Hassold et al., 1980; Jacobs, Hassold, 1995; Kalousek, 1987; Vorsanova et al., 2005; Warburton et al., 1986). Доля мозаичных форм хромосомных аномалий в этих случаях также оценена недостаточно по причине небольшого числа молекулярно-цитогенетических исследований в этой области. Молекулярно-цитогенетические методы позволяют с эффективностью определить долю мозаичных форм хромосомных аномалий в материале спонтанных абортусов и у детей с умственной отсталостью, пороками и/или микроаномалиями развития. Мозаицизм низкого уровня может приводить как к внутриутробной гибели плода, так и послужить причиной рождения больного ребенка.
Наиболее применяемым методом молекулярно-цитогенетической диагностики для выявления мозаицизма является метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), основанный на использовании хромосомоспецифичных ДНК проб. Метод многоцветовой флюоресцентной гибридизации in situ (mFISH) на неделящихся интерфазных клетках различных тканей позволяет избежать проблем, связанных с получением хромосомных препаратов, дает возможность исследования различных тканей, и за счет анализа большого числа клеток за короткое время получить высоко достоверные результаты (Soloviev et al., 1995; Vorsanova et al., 1997; Yurov et al., 2002).
Известно, что к наиболее распространенным формам анеуплоидии у детей относятся следующие: трисомия хромосомы 21 (синдром Дауна) с частотой 1:600-800 у новорожденных (Ворсанова и др., 1999, 2006; Nielsen, 1975), трисомия хромосомы 18 (синдром Эдвардса) с частотой 1 : 7000 у новорожденных (Ворсанова и др., 1999, 2006), трисомия хромосомы 13 (синдром Патау) с частотой 1:6000-13000 (Ворсанова и др., 2006), моносомия хромосомы X у девочек (синдром Шерешевского-Тернера) с частотой 1 : 1900-2500 (Бужисвская, Выговская, 1990; Ворсанова и др., 1999, 2006; Nielsen, Wohlert, 1991), дисомия хромосомы X у мальчиков (синдром Клайнфельтера) с частотой 1 : 570-850 (Ворсанова и др., 1999, 2006; Nielsen, Wohlert, 1991), трисомия хромосомы X у девочек (синдром трисомии X) с частотой 1 : 950-1500 (Ворсанова и др., 1999, 2006; Nielsen, Wohlert, 1991) и синдром дисомии хромосомы Y с частотой 1 : 850-1000 новорожденных мальчиков (Ворсанова и др., 1999, 2006; Nielsen, Wohlert, 1991). Все вышеперечисленные хромосомные синдромы могут встречаться в виде мозаичных форм.
Исследования наиболее распространенных форм численной хромосомной патологии, проведенные в двух группах, а именно, в группе детей с умственной отсталостью, пороками и/или микроаномалиями развития, а также в материале спонтанных абортусов, могли бы способствовать определению частоты пренатального и постнатального хромосомного мозаицизма, пониманию механизмов его возникновения, а также определению частоты мозаичных форм хромосомных аномалий, приводящих к гибели плода на ранних стадиях эмбриогенеза.
Исходя из вышесказанного определялись цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования:
С помощью многоцветовой флюоресцентной гибридизации in situ (mFISH) определить частоту мозаичных форм численных аномалий хромосом в эмбриональном и постнатальном развитии и разработать показания к проведению молекулярно-цитогенетической диагностики «скрытых» форм хромосомного мозаицизма у детей с умственной отсталостью, врожденными пороками и/или микроаномалиями развития.
Задачи исследования:
1. Определить частоту различных форм хромосомного мозаицизма наиболее частых численных хромосомных аномалий в материале спонтанных абортусов с помощью методов молекулярно-цитогенетической интерфазной диагностики (группа I).
2. Определить частоту различных форм хромосомного мозаицизма у детей с умственной отсталостью, врожденными пороками и/или микроаномалиями развития с помощью методов цитогенетической и молекулярно-цитогенетической диагностики (группа II).
3. Провести сравнительный анализ частоты различных форм хромосомного мозаицизма в двух обследуемых группах, на основании которого оценить вклад мозаичных форм хромосомной патологии в общую частоту анеуплоидий в раннем онтогенезе.
4. Разработать показания к проведению молекулярно-цитогенетической диагностики «скрытых» форм хромосомного мозаицизма у детей с умственной отсталостью, врожденными пороками и/или микроаномалиями развития.
5. Разработать метод приготовления цитологических препаратов из различных тканей спонтанных абортусов для молекулярно-цитогенетической диагностики. Оптимизировать условия проведения метода mFISH для интерфазной молекулярно-цитогенетической диагностики на клетках различных тканей.
Научная новизна:
Впервые определена частота мозаичных форм наиболее часто встречающихся хромосомных синдромов у детей с задержкой психомоторного и психоречевого развития, пороками и/или микроаномалиями развития. Впервые проведена оценка частоты мозаичных форм наиболее частых хромосомных аномалий в раннем эмбриональном развитии на большой выборке спонтанных абортусов с применением методов молекулярно-цитогенетической диагностики. Впервые при сравнении различных форм эмбрионального и постнатального мозаицизма оценен их вклад в общую частоту численных хромосомных аномалий (анеуплоидий и полиплоидии) на ранних стадиях онтогенеза. Впервые показано, что мозаичные формы численных хромосомных аномалий наблюдаются в четыре раза чаще в эмбриональном, чем в постнатальном развитии, что свидетельствует о высокой летальности плодов с мозаичными формами численных хромосомных аномалий в первом - начале второго триместрах беременности. Впервые обнаружено преобладание женского пола среди мозаичных форм хромосомных аномалий в эмбриональном и постнатальном развитии: соотношение полов (мужской/женский) - 22/37 (0,59), и 4/17 (0,24), соответственно.
Практическая значимость:
На основании оценки частоты мозаицизма по отдельным хромосомам, включая «скрытые» формы, и анализа фенотипа детей с мозаичными формами хромосомных синдромов определены следующие показания для проведения молекулярно-цитогенетической диагностики: стертая клиническая картина (forme fruste) таких хромосомных синдромов у детей, как синдромы Дауна, Эдвардса, трисомии хромосомы X, Шерешевского-Тернера; дисгенезия гонад при нормальном кариотипе, определенном цитогенетическим методом. Эффективность выявления «скрытых» мозаичных форм численных ХА молекулярно-цитогенетическим методом на интерфазных клетках показывает целесообразность использования FISH метода для выявления хромосомной патологии, включая мозаичные формы, в пренаталыюй и постнатальной диагностике. Разработан метод приготовления цитологических препаратов клеток эмбриональных тканей для проведения интерфазной многоцветовой молекулярно-цитогенетической диагностики. Оптимизированы условия проведения метода mFISH на интерфазных клетках.
Практические рекомендации:
Для выявления мозаичных форм хромосомных аномалий в постнатальном развитии, рекомендовано проведение молекулярно-цитогенетического исследования (FISH), как дополнительного эффективного метода диагностики хромосомного мозаицизма низкого уровня по следующим показаниям: детям со стертой клинической картиной таких хромосомных синдромов, как синдромы Дауна, Эдвардса, Шерешевского-Тернера, трисомии хромосомы X; девочкам с отдельными признаками синдрома Шерешевского-Тернера, дисгенезией гонад при нормальном кариотипе, определенном цитогенетическим методом; детям с хромосомным мозаицизмом в малой доле (2-3%) клеток, выявленной цитогенетическим методом. При исследовании хромосомного набора спонтанных абортусов рекомендовано применение молекулярно-цитогенетического метода (FISH) с использованием ДНК проб на хромосомы, наиболее часто вовлеченные в анеуплоидию для выявления «скрытых» мозаичных форм численных хромосомных аномалий. Для более эффективного выявления хромосомного мозаицизма рекомендовано проведение интерфазной многоцветовой FISH с анализом большого числа клеток (300-1000). Рекомендуется приготовление препаратов интерфазных клеток ворсин хориона на основе выделения и фиксации клеток в пробирке, а не на стекле, как принято для цитогенетической диагностики. При проведении интерфазного молекулярно-цитогенетического анализа следует учитывать как сроки приготовления препаратов, так и условия их последующей обработки.
Область применения и формы внедрения:
Результаты диссертационной работы использованы для диагностики хромосомных аномалий у детей с задержкой психомоторного или психоречевого развития, пороками и/или микроаномалиями развития в лаборатории молекулярной цитогенетики нервно-психических заболеваний ФГУ МНИИ педиатрии и детской хирургии Росмедтехнологий; при медико-генетическом консультировании супружеских пар с нарушением репродуктивной функции в клинике акушерства и гинекологии Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова, консультативном отделении МНИИ педиатрии и детской хирургии Росмедтехнологий, лаборатории цитогенетики Научного центра психического здоровья РАМН.
Положения, выносимые на защиту:
1. Определена частота мозаичных форм численных аномалий в эмбриональном развитии на большой выборке спонтанных абортусов ранних сроков беременности по хромосомам 9, 13/21, 14/22, 15, 16, 18, X и Y и полиплоидии, которая составила 24,6%.
2. Определена частота мозаичных форм хромосомных аномалий в раннем постнатальном развитии, которая составила 5,9% в группе детей с задержкой психомоторного и психоречевого развития, пороками и/или микроаномалиями развития.
3. Показано, что мозаичные формы численных хромосомных аномалий наблюдаются в материале спонтанных абортусов в четыре раза чаще, чем у детей с задержкой психомоторного и психоречевого развития, пороками и/или микроаномалиями развития. Таким образом, значительная часть плодов с мозаичными формами численных хромосомных аномалий погибает на ранних стадиях эмбриогенеза. 4. Разработаны показания для проведения молекулярно-цитогенетической диагностики (FISH) с целью выявления «скрытого» мозаицизма у детей с задержкой психомоторного и психоречевого развития, пороками и/или микроаномалиями развития.
Современные подходы к исследованию мозаичных форм хромосомных аномалий
Исследования МФ численных ХА до недавнего времени были ограничены изучением клеток, способных к делению, с помощью анализа метафаз. При этом анализе могут возникать некоторые проблемы, связанные с селективным культивированием аномальных или нормальных клеток, что ведет к ложноотрицательным результатам в случаях мозаицизма низкого уровня (Ворсанова и др., 1989, 2006; Howard et al., 1995; Vorsanova et al., 2005). Однако большинство исследований было проведено этим методом, который остается основным для анализа ХА.
Прогресс в молекулярной цитогенетике сделал возможным идентификацию МФ анеуплоидии в интерфазных ядрах (Ворсанова и др., 1989, 1991; Соловьев и др., 1995; Soloviev et al., 1994, 1995; Vorsanova et al., 1986). Эти исследования возможны с помощью метода флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Метод FISH основан на использовании ДНК проб, специфичных для конкретных участков хромосом. Суть метода заключается в следующем: клеточные ядра-мишени денатурируются для получения одноцепочечной ДНК и гибридизируются с химически модифицированными (например, с присоединенным биотином) ДНК пробами, высокоспецифичными к исследуемому участку хромосомы. Детекция ДНК пробы на хромосоме проводится при флюоресцентной микроскопии с помощью соответствующих реагентов (например, флуоресцеин-меченым авидином). Наличие сигнала после гибридизации указывает на присутствие исследуемой хромосомы или ее участка, а отсутвие сигнала говорит об их потере. Для исследования МФ численных ХА обычно применяются ДНК пробы на околоцентромерные районы хромосом, или сочетание околоцентромерной и сайтспецифичной ДНК проб.
Анализ мозаицизма в неделящихся клетках возможен с помощью молекулярно-цитогенетических методов, в частности, исследование бластомеров после искусственного оплодотворения, постмортальных тканей, различных тканей плода при СА и др. Иитерфазный FISH анализ необходим для определения ХА в половых клетках. Эти работы связаны с исследованием гонадного мозаицизма (Шаронин и др., 1999; Miharuetal., 1994; Somprasit etal., 2004; Yurov et al., 1996a).
Оценку эффективности интерфазного FISH исследования провела группа канадских ученых (Winsor et al., 1999). Они обобщили данные разных публикаций относительно ложноположительных и ложноотрицательных результатов исследований амниоцитов с помощью FISH для различных ДНК проб (хромосомы 13, 18 21, X и У).
Некорректные результаты FISH, обусловленные контаминацией материнскими клетками, неспецифической гибридизацией ДНК пробы на хромосому У и особенностями ДНК пробы на хромосомы 13/21, были единичными. Приведенные данные демонстрируют высокую эффективность интерфазного FISH исследования.
Преимущества интерфазного FISH метода следующие: 1) Отсутствие необходимости в приготовлении хромосомных препаратов; 2) возможность исключить избирательность культивирования отдельных клеточных линий в случае хромосомного мозаицизма; 3) возможность определения мозаицизма низкого уровня, который сложно обнаружить стандартным цитогенетическим методом; 4) возможность проведения анализа на неделящихся клетках; 5) более короткие сроки проведения исследования. Обычная FISH проводится в пределах 24 часов, быстрая FISH - в течение 4-5 часов (Soloviev et al., 1994).
Интерфазный FISH анализ может быть более эфективным при использовании сразу нескольких ДНК проб, меченых флюорофорами разного цвета, так называемая многоцветовая FISH (mFISH) (Соловьев и др., 1995; Vorsanova et al., 2003, 2005; Yurov etal., 1996b).
В настоящее время FISH диагностика эффективно применяется как в эмбриональной, так и в постнатальной оценке хромосомной патологии. В клинической практике FISH метод используется для детализации цитогенетических результатов: определения природы дополнительного хромосомного материала, в т.ч. добавочных маркерных хромосом, уточнения точек разрыва в случаях структурных перестроек, а также для уточнения доли мозаицизма. Показано, что такие исследования необходимы в группе детей с недифференцированной умственной отсталостью, пороками и/или MAP более чем в 20% (Ворсанова и др., 1999, 2006; Vorsanova et al., 2007), а у супружеских пар с нарушением репродуктивной функции - более, чем в 40% случаев (Берешева и др., 1998; Ворсанова и др., 1999, 2006).
Молекулярно-цитогенетические методы исследования будут подробно освещены в последующих главах обзора.
Как уже отмечалось, МФ численных ХА, в основном, возникают на ранних стадиях эмбрионального развития. В зависимости от стадии дробления зиготы, когда произошло неправильное расхождение хромосом, мозаицизм может наблюдаться в клетках всех или отдельных тканей плода. Так, например, известно явление плацентарного мозаицизма, осложняющее пренатальную диагностику, когда аномальный клон обнаруживается лишь в плаценте, но не в тканях эмбриона (Kalousek, Barret, 1994; Lestou, Kaloushek, 1998; Robinson et al., 1999; Wolstenholme, 1996). Плацентарный мозаицизм встречается в 1-3% случаев пренатальной диагностики. Также наблюдаются различные кариотипы в клетках ворсин хориона, амниона и крови плода; можно встретить упоминания о различии в кариотипах лимфоцитов крови и фибробластов кожи и т.д (Cantu et al., 1996; Chandley et al., 1980; Kohn, Shohat, 1987; Slavotinek et al., 2003; Thomas et al., 2004). В связи с этим необходимо учитывать происхождение различных тканей для анализа возникновения тканевого хромосомного мозаицизма.
Оценку кариотипа эмбриона, в основном, осуществляют путем анализа ворсин хориона (плаценты), имеющих экстраэмбриональное происхождение, и амниотических клеток или пуповинной крови - эмбрионального происхождения. Для определения мозаицизма на первых этапах дробления зиготы исследуются бластомеры от искусственно полученных эмбрионов, невостребованных после процедуры искусственного оплодотворения. Обычно исследования МФ численных ХА проводят в пренатальной диагностике и при анализе материала спонтанных абортусов. Поскольку одним из объектов настоящего исследования является материал спонтанных абортусов, отдельная глава обзора литературы посвящена проблеме ХА в данной группе.
Культивирование лимфоцитов периферической крови
По окончании культивирования клетки с питательной средой переносили в центрифужные пробирки и осаждали центрифугированием в течение 5-ти минут при 1000-1500 оборотах в минуту. Полученный осадок подвергали гипотонической обработке 0,075 М раствором хлорида калия до 20 минут при температуре 37С. Затем клетки фиксировали в трех сменах смеси метанол-уксусная кислота в соотношении 3:1, приготовленной ex tempore, по 20 минут в каждой смене. Предметные стекла перед раскапыванием клеточной суспензии обрабатывали насыщенным раствором бихромата калия в концентрированной серной кислоте (хромпик) не менее 30 минут и промывали в проточной воде 30 минут. После последнего центрифугирования и удаления супернатанта, суспензию клеток раскапывали на охлажденные влажные предметные стекла и высушивали на воздухе. Оценку качества препаратов проводили с помощью фазового контраста на микроскопе ZEISS «Axiophot».
G-окрашивание хромосом проводили по общепринятому методу (Seabright, 1972) в модификации (Захаров и др., 1982). Препараты хромосом помещали в 0,25% раствор трипсина на 10-30 секунд при комнатной температуре, затем трижды промывали в этиловом спирте в концентрации 70, 96, 100 с экспозицией не менее 30 секунд в каждом растворе. Препараты высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для окрашивания препаратов использовали 5% раствор красителя Гимзы, приготовленного на фосфатном буфере (рН 6,8). Процедура окрашивания длилась 4-5 минут. Затем препараты промывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе при комнатной температуре.
Для С-окрашивания хромосом использовали общепринятый метод (Sumner, 1972) в модификации, разработанной С.Г.Ворсановой и И.А.Демидовой в лаборатории молекулярной цитогенетики нервно-психических заболеваний Московского НИИ педиатрии и детской хирургии (Ворсанова, Демидова, 1988, рационализаторское предложение №744). Препараты хромосом обрабатывали насыщенным раствором гидрата окиси бария в течение 20 минут при комнатной температуре, ополаскивали под проточной водой и инкубировали 1,5 часа в растворе lOxSSC при температуре 65С. Затем препараты дважды промывали в 70 и 96 этиловом спирте при экспозиции не менее 30 секунд в каждом и высушивали на воздухе. Окрашивание препаратов производили красителем Райта, приготовленном на фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 7 минут.
Отбор метафазных пластинок и анализ хромосом осуществляли согласно общепринятым критериям (Кулешов, 1991).
Цитогенетический анализ проводили на препаратах хромосом, дифференциально окрашенных по длине G- и С-методами, как описано выше. В каждом случае анализировали не менее 20 метафазных пластинок.
При обнаружении численной или структурной хромосомной аберрации в одном кариотипе число анализируемых клеток увеличивалось в два раза, или же применялись методы молекулярно-цитогенетической диагностики, речь о которых будет идти ниже.
Материалом для FISH исследования СА был ворсинчатый хорион. Препараты некультивированных интерфазных ядер готовили по оригинальной, специально разработанной методике. Выбранный фрагмент ткани в количестве около 50 мг промывали в трех сменах изотонического раствора (0,9% хлорида натрия) для удаления клеток материнской крови. Затем ткань помещалась в чистую микропробирку объемом 2 мл, в которую добавляли 0,5 мл уксусной кислоты в концентрации 60%. Микропробирку закрывали и ее содержимое подвергали энергичному встряхиванию на электромешалке Vortex или же вручную в течение 2-15 минут при комнатной температуре. После этого в пробирку добавляли 1,0 мл этилового спирта (96,6%), содержимое пробирки перемешивали, фрагменты ткани удаляли, а полученную клеточную суспензию центрифугировали при 3000-4000 оборотах в минуту в течение 6-7 минут. Затем клеточный осадок фиксировали в трех сменах смеси этанол -уксусная кислота в соотношении 3:1, приготовленной ex tempore, по 30-40 минут в каждой смене при температуре 4С, тщательно пипетируя суспензию при введении фиксатора в пробирку. Суспензию клеток раскапывали на охлажденные влажные стекла и высушивали на воздухе.
Молекулярно-цитогенетические методы проводили в несколько этапов: приготовления ДНК проб, флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) и анализа флюоресцентных сигналов на препаратах. Используемые реагенты: 1) ДНК-полимераза I из E.coli (MBI Fermentas, Литва): Імкл препарата содержит 10 единиц фермента. 2) 10-кратный (10х) буфер для ДНК-полимеразы I: 0,5 М трис-HCl (рН 7,5) 0,lMMgSO4 1 mM дитиотреитол 500 мкг/мл бычий сывороточный альбумин 3) ДНКазаІ Готовый раствор содержит ДНКазу I (1мг/мл) в 0,15 М NaCl и 50% глицерина. 4) Дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ) (Sigma) Водные растворы дНТФ концентрации 0,5 мМ хранятся при температуре -20С. 5) Водный раствор 2-меркаптоэтанола концентрации 0,1 М (Merck). 6) Поли-А (10 мг/мл) 7) Меченые биотином, дигоксигенином или флюорофором дНТФ в концентрации 1 мМ. 8) Гибридизационная смесь следующего состава: 2xSSC, 10% декстрансульфат, 65% формамида.
Приготовление меченых биотином, дигоксигенином или флюорофором (СуЗ, FluorX) ДНК проб (зондов) для FISH осуществляли в лаборатории цитогенетики НЦПЗ РАМН согласно стандартной процедуре ник-трансляции (Maniatis et al., 1982) с некоторыми модификациями.
Случаи выявления нескольких хромосомных аномалий в одном образце спонтанного абортуса
Десять случаев, в каждом из которых наблюдалось несколько ХА, представленны в таблице 14. Эти случаи составили 7,2% всей хромосомной патологии. Все они представляли собой сочетание двух или трех различных численных ХА: 8 случаев анеуплоидии аутосомы в сочетании с мозаичной анеуплоидией плюсом (в основном, хромосомы X) и 2 случая сочетания анеуплоидии аутосомы с МФ тетраплоидии 4п/2п.
Трисомии аутосом наблюдались во всех 10-ти случаях: 4 случая регулярной трисомии хромосомы 16; 4 случая трисомии хромосом 13/21, два из которых были мозаичными; один случай регулярной трисомии хромосом 14/22 и один случай мозаичной трисомии хромосомы 9. Анеуплоидия гоносом наблюдалась в 8-ми случаях в МФ: 6 случаев анеуплоидии хромосомы X и 2 - анеуплоидии хромосом X и Y (табл.6). В пяти случаях анеуплоидия гоносом наблюдалась менее чем в 50% клеток, и в трех случаях - более чем в 50%. Тетраплоидия в виде небольших клеточных клонов (менее 10%) наблюдалась в двух случаях в сочетании с регулярной трисомией хромосом 16 и 14/22.
В литературе имеются описания СА с двумя и более ХА (Eiben et al., 1990; Kajii et al., 1980; Reddy, 1997). Большинство описанных случаев представляют собой сочетание двух трисомии аутосом, редко - сочетание анеуплоидии аутосомы с анеуплоидией гоносом или с полиплоидией. Среди наших случаев была обнаружена большая доля сочетания анеуплоидии аутосом с мозаичной анеуплоидией хромосомы X (8 случаев из 10), что раньше не было описано другими исследователями.
Анализ материнского возраста при спонтанных абортусах с различными хромосомными аномалиями.
Средний материнский возраст в общей группе (п=240) составил 30,5±5,5 лет (19-48 лет), в группе с хромосомной патологией у СА (п=138) - 30,5+5,8 лет (19-48 лет), из них с регулярными формами ХА (п=79) - 30,5±5,4 лет (20-43 года), с МФ ХА (п=59) - 30,6±6,2 лет (19-48 лет), в группе с невыявленной хромосомной патологией у СА (п=102) - 30,4±5,3 лет (20-44 года). 32,2+5,9 года, а при пересчете со случаями, включающими несколько ХА, в восьми из которых наблюдалался мозаицизм по хромосоме X, средний возраст матери составлял 34,4±6,7 лет. Это различие было статистически достоверно (р 0,01). Более полные данные о среднем материнском возрасте обобщены в таблице 15.
Из таблицы видно, что возраст матерей, имеющих СА с трисомией 13/21 и 14/22, выше среднего в общей группе как при регулярных, так и при мозаичных формах, однако статистически достоверным это отличие было только для трисомии 13/21 (р 0,001).
Полиплоидия в материале СА чаще наблюдалась у более молодых матерей, что соответствует данным литературы (Rua et al., 1995). Достоверные отличия наблюдались для мозаичной полиплоидии (р 0,01) при среднем материнском возрасте 27,2±3,8. В группе с несколькими ХА у плода материнский возраст был выше среднего (35,3±7,2 лет) и это значение было достоверным (р 0,01), что также соответствует данным литературы (Reddy, 1997). Таким образом, при анализе возраста матерей, имеющих МФ ХА у СА, статистически достоверным было увеличение материнского возраста только при мозаичной анеуплоидии хромосомы X в материале СА.
Средние сроки беременности при исследовании СА были следующими: в общей группе (п=240) - 8,4±2,2 нед (4-15 нед), в группе СА с хромосомной патологией (п=138) - 8,5+2,1 нед (4,5-14,5 нед), из них с регулярными формами ХА (п=79) - 8,5±1,9 нед (4,5-14,5 нед), с МФ ХА (п=59) - 8,4±2,3 нед (4,5-14,5 нед), среди образцов с невыявленной хромосомной патологией (п=102) - 8,3±2,3 нед (4,5-15 нед).
В приведенных выборках средние сроки беременности не имели значительных различий. Некоторые отличия наблюдались при анализе отдельных форм хромосомной патологии у СА. Сроки беременности по основным группам хромосомной патологии (анеуплоидия аутосом, анеуплоидия хромосомы X и полиплоидия) представленны на рисунке 6.
Из рисунка видно, что сроки беременности при анеуплоидии аутосом были меньшими, чем при анеуплоидии X и полиплоидии. Причем отличие наблюдалось только при сравнении регулярных форм патологии, тогда как сроки беременности при МФ патологии практически не отличались.
Сравнение сроков беременности в случае регулярных и МФ ХА позволило выявить достоверные различия этих значений только при моносомии X у СА. При регулярных формах этой патологии сроки беремености были большими (10,1 нед.), чем при мозаичных (7,7 нед.) - р 0,01. Был проведен анализ зависимости срока беременности от доли аномального клона клеток в двух наиболее многочисленных группах хромосомной патологии: полиплоидии и анеуплоидии хромосомы X. Так при мозаичных случаях полиплоидии с 50% и более аномальной клеточной линией средний срок беременности составлял 7,9 нед. (11 случаев), менее 50% - 9,2 недели (9 случаев). В случаях мозаицизма по хромосоме X эта зависимость была противоположной: СА с более 50% аномальным клоном имели большие сроки беременности - среднее значение 9,4 нед. (5 случаев), чем СА с долей менее 50% аномальных клеток, имеющие средний срок беременности - 7,8 недели (8 случаев). Однако эти различия не были статистически достоверными.
Соотношение полов (мужской пол/женский пол) по основным группам СА было следующим: в общей группе С А (п=240) - 112/128 (0,88), среди СА с хромосомной патологией (п=138) - 55/83 (0,66), из них с регулярными формами ХА (п=79) - 33/46 (0,72); с МФ ХА (п=59)- 22/37 (0,59); среди случаев с одной ХА, за исключением анеуплоидии X (п=97) - 44/53 (0,83); среди СА с невыявленной хромосомной патологией (п=102) - 57/45 (1,27).
Таким образом, отмечалось преобладание СА женского пола во всех группах, кроме группы с невыявленными ХА. Преобладание мужского пола среди СА с невыявленной патологией также указывает на отсутствие кантаминации материнскими клетками в исследуемых образцах. Соотношение полов СА с нормальным кариотипом по данным литературы колеблется от 0,7 до 1,3.
Известно, что анеуплоидия X наблюдается чаще у представителей женского пола и, таким образом, может оказывать значительное влияние на соотношение полов среди случаев с ХА. При анализе соотношения полов СА с ХА, исключая случаи с анеуплоидией X (соотношение полов 11/30-0,37), также наблюдалось преобладание женского пола - 44/53 (0,83).
Анализ хромосомньк аномалий, выявляемых молекулярно-цитогене-тическими исследованиями
Молекулярно-цитогенетическая диагностика FISH проводилась 29 детям для подтверждения или выявления возможного мозаицизма.
Эти исследования были выполнены на хромосомных препаратах и/или интерфазных ядрах лимфоцитов периферической крови в следующих условных группах:
1) детям с мозаицизмом, выявленным цитогенетическим методом, для уточнения процентного содержания аномальных клеток - 12 случаев;
2) детям, у которых при цитогенетическом анализе была обнаружена лишь одна клетка, отличная по кариотипу от преобладающей клеточной линии с нормальным или аномальным кариотипом, для уточнения диагноза - 6 случаев;
3) детям с регулярным аномальным или нормальным кариотипами, которые имели стертую клиническую картину синдрома (forme fruste), для выявления возможного мозаицизма - 11 случаев.
Использовались критерии оценки МФ при интерфазном FISH исследовании на основании следующих данных литературы: -в случае анеуплоидии по аутосоме использовали результаты исследований, где учитывалась доля анеуплоидного клона не менее 5% (Vorsanova et al., 2005; Yurov et al., 2007). -в случае моносомии X при сравнении результатов исследований использовали данные по интерфазному FISH анализу моносомии X у здоровых детей (Guttenbah et al., 1995). По данному исследованию у девочек до 5 лет моносомия X выявлялась в среднем в 1,6% лимфоцитов, т. е. в нашем исследовании аномальный клон учитывался, если он был выше 1,6%. Если выявлялись другие дополнительные анеуплоидные клоны, их доля суммировалась с долей клеток с моносомией. -нормальная клеточная линия в случаях обнаружения клеток с анеуплоидией учитывалась от 5% клеток, согласно работе по FISH исследованию мозаицизма при синдроме Дауна (Mody et al., 2003).
Результаты молекулярно-цитогенетических исследований представлены ниже.
Как отмечалось выше, мозаицизм был выявлен у 12 детей цитогенетическим методом. Результаты FISH исследования случаев хромосомного мозаицизма представлены в таблице 20. Среди этих случаев наблюдали следующие: 3 случая - трисомии 21; 2 случая - трисомии 22; 5 случаев - анеуплоидии X, среди которых наблюдались кариотипы: 45,Х/46,ХХ - два случая, 45,Х/47,ХХХ/46,ХХ; 45,X/46,X,i(X)(qlO) и 45,X/46,XX,fra(16)(q22)/46,XX; 1 случай маркерной хромосомы и 1 случай кольцевой хромосомы 11.
FISH анализ подтвердил присутствие мозаицизма во всех случаях кроме одного при обнаруженном ранее кариотипе 45,Х [3]/46,ХХ [40].
Следует отметить, что в трех мозаичных случаях трисомии 21, клиническая картина лишь частично соответствовала синдрому Дауна, т.е наблюдалась стертая форма синдрома (forme fruste), что соответствует данным литературы о МФ ХА (Ворсанова и др., 1999, 2006; Ковалева и др., 1999; Schinzel, 2001).
В двух случаях трисомии 22 симптомокомплекс не соответствовал синдрому «кошачьего глаза». Доля аномального клона у этих пациентов, уточненная FISH, была невысокой (3,5% и 14%), в связи с чем, клиническая картина была стертой. При молекулярно-цитогенетическом исследовании проводился анализ метафазных клеток. Мозаицизм по хромосоме X в группе детей наблюдался наиболее часто по сравнению с другими хромосомами. Из 4-х подтвержденных методом FISH случаев мозаичной анеуплоидии хромосомы X с клоном 45,Х такие признаки СШТ, как низкий рост, короткая шея, гипертелоризм глазных щелей и сосков, а также дисгенезия гонад наблюдались в 3 случаях.
Таким образом, мозаицизм, определенный цитогенетическим методом в случаях присутствия 2-х и более клеток, отличающихся по кариотипу от преобладающей клеточной линии, был подтвержден методом FISH в 11 случаях из 12, что может свидетельствовать о том, что две и более цитогенетически обнаруженные клетки, в большинстве случаев отражают истинный мозаицизм. Однако доля мозаичных клонов, а также дополнительные клеточные линии, не обнаруженные цитогенетическим методом, корректнее определяются с применением методов молекулярно-цитогенетической диагностики.
В эту условную группу вошли случаи выявления только одной клетки, отличающейся по кариотипу от преобладающей клеточной линии. Результаты исследования приведены в таблице 21. Таких случаев было шесть: 1 случай трисомии хромосомы 21 с присутствием одной клетки с нормальным кариотипом; 1 случай трисомии хромосомы X с присутствием одной нормальной клетки; два случая с одной трисомной клеткой по хромосоме 18 и два случая с одной 45,Х клеткой при нормальном преобладающем клоне.
Мозаицизм был подтвержден только в двух первых случаях, а именно было определено наличие нормальной клеточной линии при трисомиях хромосом 21 и X. В четырех случаях, в которых цитогенетическим методом была обнаружена единственная анеуплоидная клетка, не был выявлен истинный мозаицизм после проведения FISH исследования. Таким образом, обнаружение даже одной нормальной клетки при цитогенетическом исследовании анеуплоидии, может отражать истинный мозаицизм, и таким детям может быть рекомендовано молекулярно-цитогенетическое исследование для выявления нормального клона клеток.
Для выявления возможного мозаицизма в связи со стертой клинической картиной или с наличием отдельных признаков синдрома при аномальном или нормальном регулярном кариотипе, была проведена FISH диагностика. У 11 детей была стертая клиническая картина следующих синдромов: трисомия хромосомы 18 (синдром Эдвардса) (два ребенка); трисомия хромосомы 21 (синдром Дауна) (три ребенка); трисомия хромосомы X (одна девочка); признаки СШТ и нормальный кариотип (пять девочек).
В результате этого исследования мозаицизм был обнаружен у 8 из 11 детей. Более подробные данные представлены в таблице 22.
Так из двух случаев с диагнозом синдрома Эдвардса в одном был выявлен мозаицизм с присутствием нормальной клеточной линии; обнаружен также мозаицизм в случае трисомии X, а из пяти девочек с предположительным диагнозом - СШТ и нормальным кариотипом аномальный клон был выявлен у трех девочек.
Из трех случаев СД у мальчиков со стертой клинической картиной (forme fruste) нормальный клон клеток был обнаружен во всех трех случаях. После проведенных FISH исследований пациентам с forme fruste доля мозаичных случаев СД составила 25% (7 из 28 детей с СД) по сравнению с долей 10,7% (3 из 28), выявленной цитогенетическим методом.
