Содержание к диссертации
Введение
Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
Глава I. БОТАНИЧЕСКАЯ И КАРИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДОВ Vicia Ь., Cicer L., Paba Miller, Pisum L., Lathyrus L., Phaseolus L., Vigna Savi., Medicago L., Psophocarpus Gc ......... 12
Глава II. КАРИОТИП КАК ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА 34
1. Митоз и мейоз - механизмы, обеспечивающие преемственность клеток и организмов в ряду поколений . 34
2. Элементы структурной организации хромосом, определяющие их морфологию 41
3. Дифференциальное окрашивание хромосом . . 43
4. Гетеро- и эухроматические районы хромосом. 45
5. Эволюция кариотипа - изменение структуры, числа хромосом и целых геномов 48
6. Принципы и методы хромосомного анализа . . 50
Часть II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 57
Глава I. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 58
Глава П. ОБЩАЯ КАРИОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИДОВ ВИКИ 66
Глава Ш. МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ХРОМОСОМ ВИКИ 76
Глава IV. ПОЛИКАРИОГРАММНЫЙ АНАЛИЗ КАРИОТИПОВ ВИКИ 98
Глава V. МОРФОЛОГИЯ СБУТНИЧНЫХ ХРОМОСОМ НЕКОТОРЫХ
ВИДОВ ВИКИ . 102
Глава VІ. ОБЩАЯ КАРИОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГОРОХА,
ЧИНЫ, БОБОВ И ЛЮЦЕРНЫ 106
Глава VII. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ ОКРАШИВАНИЕ ХРОМОСОМ
БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ НО
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 118
ВЫВОДЫ 123
ЛИТЕРАТУРА 125
- БОТАНИЧЕСКАЯ И КАРИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДОВ Vicia Ь., Cicer L., Paba Miller, Pisum L., Lathyrus L., Phaseolus L., Vigna Savi., Medicago L., Psophocarpus Gc
- Митоз и мейоз - механизмы, обеспечивающие преемственность клеток и организмов в ряду поколений
- ОБЩАЯ КАРИОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИДОВ ВИКИ
- МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ХРОМОСОМ ВИКИ
- ПОЛИКАРИОГРАММНЫЙ АНАЛИЗ КАРИОТИПОВ ВИКИ
Введение к работе
Кариологические исследования стали в настоящее время одним из важнейших направлений изучения строения и функционирования наследственного аппарата. Эти исследования важны для понимания теоретических основ генетики, изменчивости геномов живых организмов в условиях изменяющейся окружающей среды, для выяснения путей эволюции в пределах различных таксономических единиц,вы -явления степени родства между представителями разных родов и семейств, для изучения геномного состава видов, популяций и для решения многих других существенных теоретических и практических вопросов.
Эти исследования несут важную информацию для целенаправ -ленной селекции на качество, повышенную устойчивость к болез -ням и вредителям. Они позволяют ускорить получение гибридных сортов, что важно для селекции на гетерозис и т.д. Так, кариология способствует выяснению таких проблем, как расширение, спектра видов диких и культурных растений, включаемых в скрещивание и способных облегчить проблему интрогрессии нужных генов: путем изучения процессов синапсиса хромосом в мейозе межвидовых гибридов от скрещивания разных видов удается контролировать возможные комбинации хромосомных фрагментов.
С другой стороны, исследования эллиминации отдельных хромосом позволяет заранее обнаружить, какая из хромосом будет утеряна из генома гибрида, а какая закрепится в нем.
Естественно, что такая целенаправленная работа возможна только в тех случаях, когда исследователям известна детальная кариологическая характеристика данного вида, разновидности или сорта, когда все хромосомы набора индивидуализированы с помощью цитологических маркеров.
Таким образом, кариологические и генетические исследования групп сцепления и тонкой структуры индивидуальных хромосом и изучение геномного состава данного организма особенностей мейо-за и митоза дают возможность интенсифицировать процесс селекции.
Однако реальность такого прогресса стала очевидной лишь недавно, после того как проводившиеся параллельно исследования цитологов, генетиков и эволюционистов позволили резко увеличить разрешающую способность методов идентификации индивидуальных хромосом,изучение их продольной дифференцированности с одновременным анализом геномного состава и предположительных путей эволюции в пределах изучаемой систематической группы.
Решающим моментом в обеспечении этого прогресса стало от -крытие "бэндинга" - индивидуальной дифференцированности хромо -сом на участке с эухроматическим и гетерохроматическим материалом ( Heitz 1935), впервые продемонстрировавшего их еще в трид-цатыХ-СОрОКОВЫХ годах ( Kostoff 1938; Darlington and La Cour
1940), а затем использованного для целей дифференциального анализа хромосом Касперсоном и соавторами в 1968 г. ( Casperson et ai., 1968). Усовершенствование способов дифференциальной окраски, в особенности разработка методик, основанных на частич -ной денатурации определенных последовательностей ДНК (в частности, ГЦ-повторяющихся последовательностей) и окраски ДИК в этих УСЛОВИЯХ ПО Гимза ( Arrighi and Hsu 1971; Graig-Holraes and Shaw 1971; Sumner 1972), расширило Сферу применимости методов индивидуальной кариологической характеристики и указало генетикам и цитологам новый путь исследования.
Что касается высших растений, то такие сведения были получены ДЛЯ ВеСЬМа УЗКОГО Набора РОДОВ И ВИДОВ:Scilla sibirica ( Vosa and Marchi 1972; Vosa 1973), Triticum ( Gill and Kimber 1974; Зурабишвили И др., 1974), Secale ( Sarraa and NatarayanI973;Mettin 1973; Zeller et al. 1973; Verraa and Rees 1974; Weimarck 1974, 1975 и др.), Oryza ( Mucker^ее and Muckerjee 1979) , тритикале ( Weimarck 1974; Иорданский, 1976) и ряда других (см. недавний обзор Свешникова и Грифа, 1981). Для большинства высших растений эта работа, несмотря на ее очевидную актуальность, еще не начата.
Актуальность темы. Все вышесказанное определяет интерес , который проявляют специалисты разных научных направлений к де -тальному кариологическому анализу неизученных видов высших ра -стений, в особенности тех из них, которые широко используются в качестве сельскохозяйственных культур.
Так весьма актуальна работа в отношении разных видов бобовых растений. Изучение кариологии культурных и дикорастущих видов рода Vicia обусловлено прежде всего необходимостью получения новых данных для целенаправленной селекционной работы с этой культурой. За истекшее десятилетие установлено, что многие дикорастущие виды вики и других видов бобовых могут служить донорами ряда ценных признаков: устойчивость к заболеваниям, повышенное содержание белка и устойчивость растений к пониженным тем -пературам и засухе и др.
Однако попытки простого использования дикорастущих видов для скрещивания с культивируемыми формами вики не дали пока существенных результатов. Недаром в литературе отмечалось, что становится все труднее и труднее получать улучшенные агрономически ценные сорта с использованием классических методов улучшения растений (Kammacher 1966, С. 336).
Следует признать, что без детального изучения кариологии этих видов, их геномного состава, характера конъюгации хромосом осуществить современные селекционные программы с целью интро -грессии желательных генов не удасться. Особое значение в этом отношении могли бы иметь исследования линейной цитологической характеристики и характера элиминации тех или иных сегментов и целых хромосом в клетках гибридов. К сожалению, такие сведения в отношении бобовых в литературе к моменту начала данной работы отсутствовали. Одна из основных трудностей в изучении хромосом бобовых обусловлена для большинства видов их малыми размерами.
Изучение кариологии бобовых имеет также важное теоретиче -ское значение, так как способствует выяснению таксономии родов и путей эволюции в пределах различных таксономических единиц,а также выявлению степени родства между представителями разных видов.
Настоящая работа проведена в соответствии с плановой те -мой по Институту общей генетики АН* СССР.
Цель работы заключалась в том, чтобы используя модифици -рованную методику дифференциального окрашивания хромосом про -вести идентификацию индивидуальных хромосом различных родов и видов бобовых растений. На основании морфометрических характеристик хромосом провести сравнительное кариологическое иссле- дование различных видов бобовых растений. Основные задачи исследования:
1. Описать хромосомные наборы диких и культурных видов Vicia , а также культурные ВИДЫ Cicer,Faba,Pisum,Lathyrus, Phaseolus,Vigna,Medicago,Psophocarpus.
2. Провести морфометрическое изучение хромосом 33 видов
ВИКИ ( V.amphicarpa, V.lathyroides, V.cordata, V.hajastana, V.hybrida, V.japonica, V.megalotropis, V.baicalensis, V.uni-juga, V.nana, Vhyrcanica, V.macrocarpa, V.sativa, V.pannonica, V.neglecta, V.amoena, V.sylvatica, V.peregrina, V.benghalensis, V.serratifolia, V.andicola, V.atropurpurea, V.hirsuta, V.lu-tea, V.villosa, V.michauxii, Vmonanthos, V.bithynica, V.varia, V.dasycarpa, V.tetrasperma, V.calcarata, V.articulata, V.megalotropis .)
Изучить хромосомный полиморфизм в роде Vicia на МО -дели митотических хромосом.
Использовать модификацию метода дифференциального окрашивания ХРОМОСОМ Phaseolus,Vigna,Cicer,Psophocarpus,Faba , Vicia , путем блокирования митоза пониженной температурой.
Идентифицировать индивидуальные хромосомы видов вики с помощью методов дифференциального и монохромного окрашивания и выявить маркерные жромосомы в наборах этих видов.
С помощью специально составленной программы для ЭВЛ на языке "фортран" провести статистическую обработку полученных данных.
Научная новизна полученных результатов. Впервые проведено детальное кариологическое исследование более 40 видов бобовых растений методом монохромного и дифференциального окрашивания хромосом, представителей различных таксономических единиц и дана сравнительная характеристика кариотипов этих видов.
Проведено морфометрическое изучение отдельных хромосом в наборах каждого из указанных видов Vicia , установлен размах колебаний у самых больших и самых малых хромосом набора, выяв -лены различия между ними по размеру хромосом и по суммарной длине хромосомных наборов.
Изучен хромосомный полиморфизм в пределах каящого вида Vicia , определены колебания в величине центромерного индекса и относительной длине у каждой пары хромосом диплоидных видов вики. С использованием ЭВМ получены данные о статистически достоверных различиях и сходстве между предположительно гомоло -гичными и негомологичными хромосомами наборов эволвдионно близких и различающихся видов.
На основании данных хромосомного анализа составлены идио-граммы и поликариограммы для всех изученных представителей рода Vicia и выявлены маркерные хромосомы. На примере отдельных видов на основании дифференциального окрашивания составлены их кариотипы с полной идентификацией всех хромосом набора.
Исследован полиморфизм спутничных хромосом пятнадцати видов рода Vicia
Практическая ценность. Полученные данные могут быть использованы в работе по таксономии бобовых в качестве одного из кри -териев видовой характеристики. Они найдут применение в работе по генетике и селекции сортов вики, фасоли,нута, чины, люцерны, вигны, и других видов бобовых, создании коллекции гаплоидных, анеуплоидных линий, для анализа продуктов гибридизации и вняв -ления вклада разных геномов в полученные гибриды.
Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены на конференции молодых ученых Института общей генетики АН СССР в 1984 г., а также на семинарах лаборатории цитогенетики растений ВНИИ ШБиГ ВАСХНИЛ 1983-1984 гг.
Результаты работы опубликованы в Докладах ВАСХНИЛ 1983 г. и журнале "Селекция и семеноводство", 1983 г. Соавтор учебного пособия "Атлас хромосом растений" (в печати). - II -
Часть I
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Ботаническая и кариологическая характеристика представителей РОДОВ Vicia Ь., Cicer L., Paba Miller, Pisum L., Lathyrus L., Phaseolus L., Vigna Savi., Medicago L., Psophocarpus Gc
РОД Vicia - ВИКа ОТНОСИТСЯ К Семейству Fabaceae представляет многолетние, двулетние и однолетние растения с большей частью слабым лазающим или приподнимающимся стеблем . Листья парноперистые (многопарные до однопарных), с черешком, кончающимся ветвистым усиком, реже острием, очень редко непарным листочком. Прилистники полустреловидные. Цветки представ -ляют собой пазушные много- или малоцветковые кисти на длинных цветоносах, почти сидячие сине-фиолетовые, пурпурные, беловатые или светло-желтые.
Согласно последним исследованиям, род Vicia делят на три подрода:
1) Ervum (L.) Gams, - ОДНОЛвТНЫе С МЄЛКИМИ бвЛОВаТЫ ми или голубоватыми цветками, одиночными или в немногоцветковых КИСТЯХ на ДЛИННОМ цветоносе ( V.ervilia, V.monanthos, V.hirsuta идр.).
2) V.cracca (Med.) Gams. - большей чаСТЬЮ МНОГОЛеТНЫе
с цветками средней величины в многоцветковых кистях на длинном цветоносе ( V.cracca, V.villosa, V.picta, V.pisformis, V.sylv-atica И Др.) .
3) Euvicia Vis. - цветками различной величины от
- ІЗ мелких до очень крупных, одиночными или в виде малоцветковых кистей на очень коротком цветоносе до почти СИДЯЧИХ ( V. Берігші, V.pannonica, V.sativa, V.narbonensis, V.oroboides).
Многолетние вики являются "истинными" видами вики, напри -мер v.cracca, v.amoena и др. Специфику "истинных" вик имеет
Группа ВИДОВ V.villosa, V.atropurpureaH Т.Д.
Третья группа основных видов Euvicia Vis. характеризуется СОЦВеТИеМ С СИДЯЧИМИ цветками - V.amphicarpa, V.sativa
Другие виды группы Euvicia обладают сильной редукцией признаков, которые бесспорно, составляют ядро рода vicia , хотя генезис их форм совсем иной, чем первых двух групп.
Из 150 видов этого рода в культуре используется весьма немногие - всего около Ь%% а в СССР еще меньше - 2,5$. Процент этот может значительно повыситься за счет полезных дикорастущих вик, из которых, по данным И.Н. Свешниковой (1976), особого внимания заслуживают 15 видов: V.ervilia, V.hirsuta, V.monanthos, V.Picta, V.cracca, V.amoena, V.pseudo-orodus, V.japonica, V.atropurpurea, V.villosa, V.oroboides, V.narbonensis, V.pannonica, V.sepium, V.sativa.
Митоз и мейоз - механизмы, обеспечивающие преемственность клеток и организмов в ряду поколений
Существует два основных типа клеточного деления - митоз и мейоз.Митоз представляет собой такое деление, при котором весь генетический материал поровну распределяется между двумя дочерними клетками, которые в генетическом отношении оказываются тождественными друг другу и родительской клетке. Мейотическое деление связано с редукцией количества ДНК вдвое, и после этого деления в общем образуются четыре клетки гаметы, каждая из ко -торых обладает половинным количеством генетической информации и не тождественна остальным.
Митотическое деление клетки протекает в несколько стадий, характеризующихся специфическими изменениями клеточной морфологии, в особенности в строении клеточного ядра. Первая стадия митоза - профаза на микроскопическом уровне характеризуется тем, что ранее тонкая хроматиновая сеть ядра сначала огрубляется, а затем распадается на клубок нитей. По мере протекания профазы эти нити становятся все более короткими и толстыми, визуально постепенно обособляясь друг от друга. Наконец, эти нити - хромосомы становятся доступными для прослеживания по всей своей длине. Далее становится видно, что каждая хромосома является двойной структурой, состоящей из пары параллельных субъединиц - хрома -тид, разделяемых редукционной щелью. По мере сокращения хромосом продолжается обособление хроматид, и к концу профазы хроматиды становятся видными как обособленные, частично разошедшиеся структуры, соединенные друг с другом лишь в единственной точке -центромере. В этом месте на теле хроматиды видно сужение - пер -вичная перетяжка, и район центромеры часто , характеризуется существенно более слабым окрашиванием, нежели остальные участки хромосом. Завершается профаза распаданием ядерной оболочки и, следовательно, исчезновением ядра как отдельной структуры.
Следующая стадия митоза - метафаза, характеризуется тем , что достигшие максимальной степени сокращения хромосомы выстраиваются в одной плоскости (экваториальной), образуя метафазную пластинку. При этом каждая центромера оказывается соединенной при помощи специальных нитей ранее сформировавшегося в профазе веретена деления с двумя полюсами клетки. Метафаза является очень непродолжительной стадией деления, и далее наступает анафаза - стадия расхождения хромосом.
Анафаза начинается с того, что соединяющие две хроматиды одной хромосомы центромеры также претерпевают продольное деле -ниє, в результате чего две сестринские хроматиды окончательно теряют связь друг с другом. С этого момента ранее имевшая дву .-хроматидное строение хромосома прекращает свое существование, превращаясь в две идентичные друг другу хромосомы однохроматид-ного состава. Однохроматидные сестринские хромосомы начинают расхождение к противоположным полюсам клетки. Этот процесс возникает и протекает почти синхронно для разных хромосом клетки. Собравшиеся около каждого полюса деления группы хромосом далее образуют два новых (дочерних) ядра. Этот этап деления - тело -фаза по характеру и последовательности событий является противоположностью профазе и завершается формированием нормальных интерфазных ядер.
Общая кариотипическая характеристика видов вики
Хромосомы вики на стадии метафазы митоза сильно варьируют у разных видов. Длина хромосом, согласно литературным данным и нашим исследованиям, колеблется от 2 до 16 мкм. На основании морфометрических параметров построены идиограммы, рисунки 4-32, где даны средние значения каадой пары гомологов по 15 пластинкам.
Диплоидные виды (2 n = 10) -v.sriocan,» Hausskin Кариотип представлен одной карио-типической группой, субакроцентрическими хромосомами небольших размеров - 2-3 мкм (рис. 4). v.iathyroides L. t Кариотип представлен одной кариотипичв-ской группой, субакроцентрическими хромосомами небольших размеров - 2-3 мкм (рис. 5).
link4 Морфометрические исследования хромосом вики link4 \
Основная трудность в осуществлении работы по кариологиче -ской номенклатуре связана с установлением достоверных различий между признаками хромосом в наборе. Доказано, что абсолютные размеры хромосом довольно значительно варьируют в зависимости от степени их спирализации, что вносит существенные систематические ошибки в результаты измерений (Гиндилис, 1967). Особенно большой разброс данных отмечен в отношении абсолютных зна -чений морфометрических параметров хромосом, причем наибольшее варьирование имеет место в отношении более крупных хромосом , нежели хромосом мелких (Павулсоне и др., 1970).
Вместе с тем, наряду с данными об абсолютных размерах хромосом в целом и соотношении их плеч, мы использовали для целей идентификации индивидуальных хромосом данные об относительной длине хромосом; а также сведения о величине центромерного ин -декса хромосом, как это принято в литературе.
Однако чтобы снизить в еще большей степени вариабельность морфометрических параметров хромосом, мы выбирали для количе -отвенного анализа те пластинки, в которых степень спирализации хромосом в наборе была бы достаточно близкой.
Абсолютные размеры хромосом различных видов вики
Детальное изучение морфометрических показателей хромосом различных видов вики позволило нам критически пересмотреть имевшиеся на этот счет разрозненные данные и дать впервые сведения о размерах хромосом у ряда видов. Обобщенные данные мор-фометрического изучения абсолютных размеров хромосом вики представлены в табл. 4.
При анализе данных абсолбтных размеров отдельных хромо -сом и всего набора, представленных в табл. 4, обнаружено, что имеется совпадение колебаний длины отдельных хромосом и суммарной длины хромосом в наборах у отдельных видов синони MOB - V.toenghalensis » V.atropurpurea і V.villosa t Y.dasycarpa У ВИДОВ СИНОНИМОВ V.articulata І V.monanthos обнаружено полное несовпадение колебаний длины отдельных хромосом и суммарной длины хромосом в наборах.
Поликариограммный анализ кариотипов вики
Дальнейшие исследования по изучению кариотипов вики были основаны на использовании метода поликариограммного анализа ( Patau , 1964; Їїрокофьева-Бельговская, Гиндилис, 1965), основанного на одновременном учете величины центромерного индекса для каждой из изученных хромосом и их относительной длины.
Все полученные морфометрические данные в отношении каждой из изученных хромосом наносились на двухмерный график: по оси абсцисс откладывали значение центромерного индекса, по оси ординат - относительную длину этой же хромосомы; точка пере -сечения координат обоих значений отмечалась точкой. Скопление точек характеризует спектр изменчивости морфометрических данных для каждого вида и. позволяет получать новую информацию, ускользающую при анализе одного из параметров. Поликариограммный ме -тод позволяет на основании распределения точек на двухмерном графике более строго выявлять закономерности распределения хромосом на типы метацентриков, субметацентриков и акроцентриков . Кроме того, в ряде случаев по хорошо различимым скоплениям точек можно идентифицировать индивидуальные хромосомы в каждом из типов и тем самым расширить границы числа идентифицированных хромосом.
Метод поликариограммного анализа удалось успешно применить в изучении отдельных видов вики.
В отличие от данных идиограмм, число кариотипических групп на поликариограммах больше, так как при поликариограммном ана -лизе берутся не средние значения групп хромосом, а учитываются на графике морфометрические параметры каждой пары гомологов. На рисунках 56, 57, 58 представлены поликариограммы разных видов вики.
