Введение к работе
Актуальность проблемы. Микроэволюция - это эволюционные преобразования внутри вида на уровне популяций и демов, ведущие к внутривидовой дивергенции и видообразованию (Воронцов 1999). Микроэволюцию можно определить как систематическое изменение частот гомологичных аллелей, участков хромосом или целых хромосом в локальной популяции. Иначе говоря, микроэволюцией называют любое увеличение или уменьшение частоты в генофонде какой-либо вариантной формы, которая продолжает встречаться в популяции из поколения в поколение (Четвериков 1929, Шмальгаузен 1968, Тимофеев-Ресовский 1958, Грант 1991, Воронцов 1999). Исследованию микроэволюции посвящено много работ, однако природа ее молекулярных механизмов, прдолжает широко дискутироваться.
Дикие пшеницы, как полиплоидные, так и диплоидные, - представляют собой прекрасную модель для исследования микроэволюционных процессов. Немаловажно, что у них крупные хромосомы, и генетика этой группы видов исследована достаточно хорошо. Детальному исследованию пшениц уже больше ста пятидесяти лет, что позволяет проводить сравнительный анализ собственных результатов, полученных экспериментальным путём, и данных, уже имеющихся в литературе.
Данное исследование посвящено изучению микроэволюционных процессов в природных популяциях диких пшениц. В основу были положены несколько гипотез, основанных как на изучении существующей литературы, так и на почти десятилетних полевых наблюдениях над дикими пшеницами Израиля. Первая гипотеза предполагает, что в современных популяциях диких пшениц и в настоящее время продолжается интенсивный процесс формо- и видообразования (Жуковский 1928, Zohary и Imber 1963). В основу второй гипотезы легло предположение о том, что активность мобильных элементов является основной движущей силой изменчивости генома в небольших краевых популяциях диплоидной дикой пшеницы Ае. speltoides. Третья гипотеза предполагает, что активность мобильных элементов и хромосомные перестройки - процессы взаимозависимые, приводящие, в отдельных случаях, к быстрому возникновению репродуктивной изоляции, т. е. к видообразованию по симпатрической модели. Таким образом, настоящее исследование находится на стыке эволюционной биологии, цитогенетики и молекулярной генетики, и послужит ещё* одним шагом к пониманию механизмов микроэволюционных процессов. В работу включён материал, относящийся только к диплоидным видам диких пшениц, и не затрагиваются проблемы видообразования путём полиплоидизации.
Цель работы. Данная работа ставила своей целью дальнейшее изучение механизмов формо- и видообразования на молекулярно-цитогенетическом уровне у Aegilops speltoides.
Основные задачи исследования. Ниже приведён ряд нерешённых
вопросов, которые и послужили отправными точками настоящего исследования:
идёт ли в данный момент процесс видообразования в группе Sitopsis, и если
«да», то по какой модели, чем видообразование вызвано, и какова
эволюционная связь Aegilops speltoides с родственными видами в группе Sitopsis;
каковы цитогенетические и молекулярные механизмы видообразования, и существует ли связь между ними;
какова роль этих механизмов в образовании репродуктивных барьеров;
какова пространственная и временная динамика мобильных элементов в геноме Ае. speltoides;
играют ли мобильные элементы какую-либо роль в образовании новых форм в небольших краевых популяциях растений, где, как известно, прцессы формообразования интенсифицированны (Тимофеев-Ресовский и др. 1977).
Исходя из поставленных вопросов, был разработан алгоритм исследования генома Ае. speltoides. Планировался сбор растений из ряда популяций втечении нескольких лет. В качестве первого шага лабораторных исследований, предполагалось разработать метод выявления на хромосомах консервативных / лабильных районов хроматина. Затем, для лабильных районов предполагалось молекулярно-цитогенетическими методами определить количественное и качественное содержание мобильных элементов (копийность и присутствие хромосомных кластеров элементов определённого типа в геноме). Предполагалось клонирование высококопийных ретротранспозонов и транспозонов с последующим использование полученных клонов в качестве молекулярных проб для in situ гибридизации, а также сравнительное исследование хромосомного распределения различных мобильных элементов в нескольких популяциях Ае. speltoides. Для выявления общих закономерностей предполагалось провести сравнительный анализ хромосомного распределения мобильных элементов у других видов Роасеае. Планировалось также исследовать динамику изменения копийности мобильных элементов во времени путём анализа ряда поколений, а также транспозиционную и транскрипционную активность мобильных элементов в генеративных и вегетативных тканях, особенно у растений с различными хромосомными аберрациями. Для более детального анализа процессов формо- и видообразования на хромосомном уровне и динамики мобильных элементов во времени была выбрана небольшая популяция Ае. speltoides, расположенная рядом с прибрежными дюнами Хайфского залива по берегам реки Кишон. Анализировалась также близлежащая, самая северная, крупная популяция Ае. sharonensis родственного вида, также принадлежащего к группе Sitopsis.
Подобный подход, сочетающий в себе как детальный анализ отдельной популяции, так и сравнение нескольких популяций и видов, предполагал достаточно детально представить вариабельность генома Ае. speltoides на уровне хромосомных перестроек, хромосомного распределения мобильных элементов а также их пространственную и временную динамику.
Научная новизна работы. Данная работа является первым комплексным исследованием процессов формо- и видообразования у диких диплоидных видов пшениц. Применение новейших методов молекулярной цитогенетики и молекулярной генетики позволило впервые описать микроэволюционные процессы на молекулярном уровне, происходящие в небольшой краевой популяции Ае. speltoides. Впервые показана активная роль мобильных элементов, относящихся к различным классам, в изменениях генома растений при видообразовании. Разработан метод молекулярно-цитогенетического разделения районов хромосом по степени их эволюционной стабильности, и показано, что у Ае. speltoides в процессе видообразования
наиболее значимо изменяют свой нуклеотидный состав районы терминального гетерохроматина, обогащенные ретротранстозонами Класса I (элементами родственными ретровирусам, которые могут составлять до 80% генома злаков, и перемещающихся по геному с помощью промежуточной РНК) семейств Tyl-copia и LINE.
Показано, что хромосомное распределение ретротранспозонов семейства ТуЪ-gypsy (Класс I) и Ас транспозонов (Класс II - активных элементов, перемещающихся по геному путём вырезания-вставки) неодинаково в популяциях из различных климатических зон, что предполагает определённую зависимость активности мобильных элементов от факторов внешней среды.
Впервые показана активация En/Spm транспозонов (Класс II) в процессе гаметогенеза у Ае. speltoides. Кластеры мобильных элементов этого типа обнаружены в районах крупных хромосомных перестроек, а также совместно с нерегулярными кластерами 5S рДНК, что свидетельствует об их активной роли как в переносе 5S рРНК генов по геному, так и в процессе изменения структуры хромосом, постоянно происходящего в небольших краевых популяциях злаков.
В той же небольшой краевой популяции Ае. speltoides был отобран ряд генотипов и получены уникальные данные по динамике копийности мобильных элементов во времени. При этом симулировались реальные условия, когда при воздействии неблагоприятных внешних условий перекрёстноопыляемые растения переходят к самоопылению. Была отмечена повышенная активность мобильных элементов, относящихся к разным классам. Периоды подъёма копийности чередовались со снижением в ряду поколений при самоопылении. Активность мобильных элементов сопровождалась морфологическими и хромосомными аберрациями.
На основании комплекса полученных данных выдвинута и частично обоснована гипотеза о том, что в популяциях Ае. speltoides идёт активный процесс формо- и видообразования, и данный вид может являться предаовым для группы видов секции Sitopsis.
Практическая ценность работы. Ещё одним немаловажным аргументом в пользу выбора объекта явилось то, что пшеница - одно из самых древних культивируемых растений. Значение этого растения для Европейской цивилизации трудно переоценить. Интерес к диким пшеницам вызван в первую очередь возможностью обогащения генетического пула культивируемых сортов (Вавилов 1987), и по уровню финансирования научных исследований пшеница стоит на третьем месте после риса и ячменя. Селекционеры постоянно работают над созданием новых сортов пшениц как традиционными методами, так и современными методами генетической и хромосомной инженерии. Однако, очень часто, подобные работы выполняются экстенсивным методом, и пары для скрещиваний подбираются без учёта индивидуальных особенностей геномов родителей. Знание закономерностей формо- и видообразования в естественных популяциях позволит рациональнее планировать селекционные программы, избегая значительных материальных затрат.
Апробация работы. Результаты исследования докладывались на различных международных и всероссийских конгрессах, конференциях и семинарах, в том числе: 3-й Конференции по Кариологии растений (Санкт Петербург, Росси, 1992), Международном семинаре «Организация генома и эволюция» (Хайфа, Израиль, 2001), 4-м Международном Triticeae конгрессе (Кордоба, Испания, 2001), 14-й Международной хромосомной конференции (Вюрсбург, Германия, 2001), Кейстоун конференции С6 «Сравнительная
геномика растений» (Таос, Нью Мексико, США, 2004), 15-й Международной хромосомной конференции (Лондон, Великобритания, 2004), 5-й Международной конференции по кариологии и кариосистематики (Санкт Петербург, Россия, 2005), 8-й Гатерслебенской конференции (Гатерслебен, Германия, 2005), семинаре «Новые горизонты эволюционной биологии» (Хайфа, Израиль, 2007), Международной конференции в честь столетия открытия Ааронсоном популяций дикой тетраплоидной пшеницы (Тверия, Израиль, 2007), 6-й Европейской Цитогенетической конференции (Стамбул, Турция, 2007). Кроме того, по материалам исследований в 2007 году были прочитаны лекции в Хельсинском университете, в МТТ Agrifood Research Finland и в университете Беер-Шевы.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 38 печатных работ в ведущих международных и отечественных научных журналах.
Структура И объём диссертации. Диссертация изложена на 250 страницах, включая 47 рисунков, 13 таблиц, список литературы, содержащий 271 ссылку и приложение, включающее клонированные нуклеотидные последовательности, опубликованные в базе данных GeneBank. Она состоит из введения, четырёх глав, выводов и заключения.
Во введении обосновывается выбор темы и объекта исследования.
