Введение к работе
Актуальность проблемы. Нуклеотидные вставки, делеции, а также нуклеотидные замены определяют разнообразие аллелей большинства генов В этой связи главным объектом исследований генетики и прикладной ботаники становится разнообразие генетических ресурсов растений, выявляемое на уровне ДНК Полиморфизм ДНК в масштабе целого генома можно изучать, опираясь на информацию о нуклеотидной последовательности всей геномной ДНК (полное секвенирование геномов) или, используя альтернативную технологию молекулярного маркирования
В большинстве случаев молекулярные маркеры, используемые для анализа внутривидового и межвидового разнообразия у растений (RFLP, RAPD, AFLP, SSR), представляют собой анонимные ДНК-фрагменты, отражающие полиморфизм участков генома, выбранныхг случайным образом (Varshney et al, 2004) Репрезентативное количество идентифицированных с их помощью полиморфных геномных локусов и относительная простота лабораторных процедур позволяют эффективно использовать эти маркеры при оценке геномного сходства близкородственных таксонов культивируемых видов и решении вопросов таксономии. В настоящей работе возможности методов молекулярного маркирования при решении спорных вопросов систематики культурных растений и оптимизации коллекций генных банков проанализированы на примере видов Vicia L, представляющих практический интерес как кормовые травы и зернобобовые культуры
Для целей прикладной генетики и селекции более эффективным является использование не анонимных, а функциональных молекулярных маркеров, которые идентифицируют полиморфизм в транскрибируемых кодирующих последовательностях ДНК - генах (Andersen, Lubberstedt, 2003) Базовым ресурсом для исследований функциональной геномики являются коллекции EST (Expressed Sequence Tags), представляющие собой секвенированные неполные копии генов, точнее фрагменты кодирующих последовательностей ДНК длиной 500-700 н п. (Сойфер, 2000) Создание коллекций EST обусловило также развитие чип-технологий, основной задачей которых является сравнительный мониторинг уровня генных транскриптов в экспериментальных образцах Анализ экспрессии генов с использованием чип-технологий, называют также транскриптомным анализом По аналогии с геномом, подразумевающим совокупность всех генов организма, говоря о транскриптоме, имеют ввиду совокупность всех генов, которые транскрибируются в данной ткани, на данном этапе развития организма (Spellman et al, 1998). Потенциальное значение транскриптомного анализа для генетико-селекционных
исследований очевидно транскрипция генов является ключевым этапом для последующего белкового синтеза, поэтому изменения в генной экспрессии могут непосредственно влиять на биохимические и физиологические процессы и, как следствие, отражаться на фенотипе
Среди объектов современных транскриптомных исследований особое место принадлежит ячменю Усилиями лабораторий разных стран к концу 2002 года были созданы 84 библиотеки кДНК из разных тканей растений ячменя на разных этапах онтогенеза, в результате чего было подучено около 350 тысяч EST (Close et al, 2004) На этой базе был создан геночип яменя (Affymetrix 22К Barley GeneChip), позволяющий анализировать экспрессию практически всех известных на сегодняшний день кодирующих последовательностей ячменя Накопленная обширная научная информация и современные исследовательские ресурсы позволяют перейти к разработке новых методологических подходов для выявления генетических факторов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков, на основе новых технологий функциональной геномики
Цель исследования. Выявить возможные пути использования достижений современной структурной и функциональной геномики для решения прикладных проблем генетики и ботаники, на примере представителей родов Vieia и Hordeum
Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи
Изучить возможности методов молекулярного маркирования для систематики культурных растений, оценив с их помощью геномное сходство видов Vicia subgenus View и, сравнив полученные результаты с существующими версиями филогенетической системы подрода
Разработать метод оптимизации обширных коллекций ex situ с применением молекулярных маркеров на примере генофонда культурного вида Vsativa
3. Разработать метод идентификации генов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных фенотипических признаков, на примере признаков пивоваренного качества у ячменя, с помощью транскриптомного анализа Для этого
а) в качестве первого этапа создать экспериментальную базу для транскриптомного анализа генотипов ячменя различного пивоваренного качества, сконструировав библиотеки кДНК из тканей прорастающего ячменного семени и, создав на их основе кДНК-макрочип (EST на нейлоновом фильтре),
б) изучить ткане- и стадийно-специфичную активность генов в прорастающем семени
ячменя, используя кДНК-макрочип В ходе исследований получить экспериментальное
подтверждение воспроизводимости результатов применяемой кДНК-чип технологии,
путем использования альтернативных молекулярно-биологических методов (Нозерн-
блоттинг)
в) используя кДНК-макрочип, осуществить транскриптомный анализ генотипов ячменя,
различающихся по параметрам солодования и протестировать гипотезу о том, что
наблюдаемые различия по пивоваренному качеству могут обуславливаться
изменчивостью уровня экспрессии определенных генов-кандидатов
4 Разработать метод картирования генетических локусов, регулирующих уровень
экспрессии возможных генов-кандидатов с использованием техники Real-Time PCR
Разработать стратегию создания функциональных молекулярных маркеров-помощников селекции, выявляющих желательную повышенную или пониженную экспрессию гена-кандидата, детерминирующего изменчивость хозяйственно-ценного признака, для использования селекционной практике
Проанализировать общегеномные закономерности регуляции экспрессии генов ячменя, картировав генетические факторы (eQTL), влияющие на уровень транскрипции генов, используя Afrymetnx 22К Barley GeneChip
Научная новизна. Предложен оригинальный метод классификации внутривидового разнообразия возделываемого вида, сохраняемого ex situ, по результатам молекулярного маркирования генома путем расчета коэффициентов генетической оригинальности образцов (КТО) по Смирнову (1969)
Впервые предложен метод, позволяющий на основе кДНК-чип технологий идентифицировать спектр генов-кандидатов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков В качестве примера идентифицированы возможные гены-кандидаты, влияющие на формирование пивоваренного качества у ячменя
Разработана методика поиска молекулярного маркера-помощника селекции, выявляющего желательную повышенную или пониженную экспрессию гена-кандидата
Создана коллекция 27512 EST (секвенированных фрагментов кодирующих последовательностей ДНК), выделенных из тканей семени ячменя на разных этапах прорастания Нуклеотидные последовательности созданных EST и их функциональные аннотации доступны для пользователей через Интернет (http //pgrc ipk-gatersleben de/cr-est/mdex php).
Впервые с использованием микрочипа Affymetnx 22К Barley GeneChip на генетической карте ячменя установлено местоположение 3029 транскрибируемых генов, а также картированы регуляторные локусы для 12987 генов
Впервые экспериментально показано, что естественный нуклеотидный полиморфизм, существующий между двумя генотипами ячменя, может достоверно влиять на уровень экспрессии более 80% транскрибируемых генов
Получено экспериментальное подтверждение наличия в геноме ячменя транс-регуляторных локусов, влияющих на транскрипцию не одного, а целого кластера генов Установлено, что позиции этих транс-регуляторных локусов на генетической карте совпадают с позициями некоторых QTL для параметров пивоваренного качества
Впервые на примере генома ячменя экспериментально показано, что эффект унаследованных цис-регуляторных мутаций, заключающийся в активировании или ингибировании транскрипции гена, может быть ограничен конкретной тканью или проявляться у потомства по достижении организмом определенной физиологической стадии
Теоретическая и практическая значимость. Предложенный метод расчета КГО применим к анализу генетического разнообразия возделываемых видов растений, генофонд которых представлен преимущественно местными сортами, сорнополевыми и дикорастущими популяциями, с привлечением любого типа молекулярных маркеров Практическим результатом его применения является классификация образцов коллекций генбанков по 5-балльной шкале, которая может быть отражена в дескрипторах паспортных баз данных и использована для оптимизации коллекций ex sttu
Метод выявления генов-кандидатов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков, основан на гипотезе, что наблюдаемые различия в фенотипе могут обуславливаться вариациями в уровне экспрессии определенных генов Метод приложим к анализу любого количественного признака, не требует создания экспериментальных популяций, необходимых для рекомбинационного анализа Метод лишь анализирует генетическое разнообразие, выявляемое среди существующих селекционных линий и сортов, используя возможности кДНК-чип технологий.
Экспериментально показано, что повышенная/пониженная экспрессия гена-кандидата в результате цис-регуляторной мутации, может быть ассоциирована с присутствием определенных аллелей в структурной части гена Это дает возможность упростить работу селекционера, создав молекулярный маркер, выявляющий желательную повышенную или пониженную экспрессию
гена-кандидата для диагностики и скрининга генетического разнообразия, а также маркерной помощи отбору
Созданная коллекция EST была использована при разработке микрочипа Afrymetrix 22К. Barley GeneChip, позволяющего анализировать экспрессию практически всех известных на сегодняшний день кодирующих последовательностей ячменя По результатам экспериментов с Affymetrix 22К Barley GeneChip создан каталог, содержащий информацию о линейной последовательности 3029 транскрибируемых генов на хромосомах ячменя и генетических расстояниях между ними. Полученная генетическая карта Hordeum vulgare является самой насыщенной на сегодняшний день, она позволяет детально изучить синтению хромосом ячменя и риса - вида с секвенированным геномом Информация о последовательностях генов в соответствующем блоке на физической карте генома риса значительно облегчает задачу клонирования генов у ячменя
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Классификацию внутривидового разнообразия возделываемого вида, сохраняемого ех situ, можно осуществлять при помощи коэффициентов генетической оригинальности образцов по Смирнову, рассчитанными по результатам молекулярного маркирования генома
Используя современные методы функциональной геномики (кДНК-чип технологии), можно идентифицировать спектр генов-кандидатов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков
Желательную с точки зрения селекционной практики повышенную или пониженную экспрессию гена-кандидата в результате цис-регуляторной мутации можно маркировать с помощью полиморфных сайтов в структурной части гена
Используя подход «генетической геномики» с применением микрочипа Affymetrix 22К Barley GeneChip, можно локализовать на генетической карте ячменя более 15% генов, транскрибируемых в конкретной ткани Одновременно, в рамках того же эксперимента можно картировать регуляторные локусы для 80% транскрибируемых генов
5 Общегеномное картирование регуляторов экспрессии генов ячменя с помощью
Afrymetrix позволяет локализовать транс-регуляторные локусы, регулирующих транскрипцию
целого кластера генов, среди которых могут оказаться также гены, определяющие важные
фенотипические характеристики.
Конкурсная поддержка работы Исследования были поддержаны международными грантами Vavilov-Frankel Fellowship, 1999 (IPGRI, Италия), Science and Technology Agency of
Japan, 1999 (Цукуба, Япония), BMBF, №0312282, 2001 (GABI-SEED, Германия), BBC5030971, 2005 (BBSRC, Англия)
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Х-ой, ХП-ой и XV-ой Международных Конференциях "Plant & Animal Genomes" (San-Diego, 2002, 2004, 2007), 3rd UK Cereal Genetics and Genomics Workshop (Norwich, 2006), ПІ-м Съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004), 9th International Barley Genetics Symposium (Kromenz, 2004), Plant Genomics European Meetings (Lyon, 2004, Berlin, 2002); 9th Internationa) Symposium on Plant Seeds Seeds in the -omics Era (Meisdorf, 2004), VIII European Society for Agronomy Congress (Copenhagen, 2004), ХІ-ом Делегатском Съезде Русского Ботанического Общества (Барнаул, 2003), XI-ой Международной конференции "Plant Reproduction- From Mendel to Molecular Biology" (Brno, 2003), 6th Gatersleben Research Conference (Gatersleben, 2002), XVIth EUCARPIA Congress (Edinburgh, 2001), International Symposium "Rudolf Mansfeld and Plant Genetic Resources" (Gatersleben, 2001), 3rd International Crop Science Congress (Hamburg, 2000), 7th MAFF International Workshop on Genetic Resources (Tsukuba, 2000) Результаты диссертации обсуждались на заседании кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского Государственного Университета, на семинаре лаборатории кариологии и молекулярной систематики Ботанического института им В Л Комарова РАН, а также на Вавиловском семинаре ВНИИ растениеводства им Н И Вавилова
Публикации По теме диссертации опубликованы 32 работы, в том числе в зарубежных изданиях - 25
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 265 страницах, содержит 35 таблиц и 57 рисунков и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), 4-х глав экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы, включающего 285 источников, и приложения
