Содержание к диссертации
Введение
1. Совместимость при межвидовой гибридизации и особенности культивирования in vitro видов рода Hordeum (Обзор литературы) 10
1.1. Современная систематика и геномный состав видов рода Hordeum 10
1.2. Совместимость дикорастущих видов рода Hordeum с возделываемым ячменем Hordeum vuigare при межвидовой гибридизации 14
1.3. Культивирование in vitro видов рода Hordeum и их гибридов. Эмбриокультура видов и межвидовых гибридов злаков 30
1.3.2 Каллусогенез и регенерация в культуре in vitro ячменя 33
1.3.3. Каллусогенез и регенерация в культуре in vitro дикорастущих видов и отдаленных гибридов ячменя. 42
1.3 А Суспензионная культура и протопласты ячменя. 45
2. Материал и методы 50
2.1. Материал 50
2.2. Методы 57
3. Результаты и обсуждение 63
3.1. Гибридизация возделываемого ячменя Hordeum vuigare с дикорастущими видами рода Hordeum 63
3.1.1. Гибридизация Н. vuigare с видами секции Hordeum 64
3.1.2. Гибридизация Н. vuigare с видами секции Anisolepis IS
3.1.3. Гибридизация Н. vuigare с видами секции Critesion 11
3.1.4. Гибридизация Н. vuigare с видами секции Stenostachys 82
3.1.5. Обсуждение 86
3.2. Каллусогенез и регенерация в культуре in vitro видов рода Hordeum и возможности микроклонального размножения межвидовых гибридов ячменя 89
3.2.1 Особенности каллусогенеза и регенерации in vitro из незрелых зародышей различных видов ячменя 90
3.2.1.1 .Каллусогенез из незрелых зародышей у образцов секции Hordeum 91
3.2.1.2.Каллусогенез из незрелых зародышей у образцов секции Anisolepis 95
3.2.1.3. Каллусогенез из незрелых зародышей у образцов секции Critesion 98
3.2.1.4. Каллусогенез из незрелых зародышей у образцов секции Stenostachys 100
3.2.1.5. Обсузкдение 102
3.2.2. Регенерация растений из каллусов, полученных из незрелых зародышей 112
3.2.2.1. Обсуждение 118
3.2.3. Регенерация растений некоторых видов Hordeum в каллусах, полученных из разных типов эксплантов 123
3.2.4. Микроклонирование in vitro дикорастущих видов ячменя и их гибридов с культурным ячменем 125
3.2.4.1. Микроклонирование in vitro образцов секции Hordeum и их гибридов с культурным ячменем 126
3.2.4.2. Микроклонирование in vitro образцов секции Critesion и их гибридов с культурным ячменем 130
3.2.4.3. Микроклонирование in vitro образцов секции Stenostachys, их гаплоидов и гибридов с культурным ячменем 137
3.2.4.4. Микроклонирование in vitro образцов секции Anisolepis 141
3.3. Характеристика цитогенетической стабильности межвидовых гибридов культурного ячменя с дикорастущими видами Hordeum 142
3.3.1. Изменчивость числа хромосом в микроспороцитах межвидовых гибридов ячменя секции Hordeum 143
3.3.2. Изменчивость числа хромосом в микроспороцитах межвидовых гибридов культурного ячменя с видами секции Critesion 145
3.3.3. Изменчивость числа хромосом в микроспороцитах межвидовых гибридов культурного ячменя с видами секции Stenostachys 149
3.3.4. Обсуждение 152
3.3.5. Изменчивость числа хромосом при микроразмножении экспериментальных форм, полученных с участием Н.ргосегшп 154
Заключение 157
Выводы 160
Практические рекомендации 162
Литература 162
Приложение 188
- Культивирование in vitro видов рода Hordeum и их гибридов. Эмбриокультура видов и межвидовых гибридов злаков
- Каллусогенез и регенерация в культуре in vitro видов рода Hordeum и возможности микроклонального размножения межвидовых гибридов ячменя
- Микроклонирование in vitro дикорастущих видов ячменя и их гибридов с культурным ячменем
- Изменчивость числа хромосом в микроспороцитах межвидовых гибридов культурного ячменя с видами секции Stenostachys
Культивирование in vitro видов рода Hordeum и их гибридов. Эмбриокультура видов и межвидовых гибридов злаков
Применительно к решению проблем отдаленной гибридизации злаков эмбриокультура in vitro начала широко использовался после опубликования работ Бринка с соавторами и Ивановской, разработавших эмбриокультуру гибридных зародышей межродовых пшеничных и ячменных гибридов (Brink, Cooper, Ausherman, 1944; Ивановская, 1946).
С течением времени методы эмбриокультуры злаков совершенствовались лишь в направлении оптимизации состава питательных сред, методы вычленения гибридных зародышей, очевидно, универсальные из-за своей простоты, остались неизменными. В работах Ивановской и Бринка с соавторами была показана необходимость применения методов изоляции гибридного зародыша и поддержания его дальнейшей жизнедеятельности в эмбриокультуре на искусственных питательных средах различного состава в связи с деградацией эндосперма в гибридной зерновке после достижения двухнедельного возраста (Brink, Cooper, Ausherman, 1944; Ивановская, 1946). Соматошіастическая стерильность довольно часто наблюдается при отдаленной гибридизации (Поддубная-Арнольда, 1976). Это явление - одна из основных причин несовместимости при межвидовых скрещиваниях внутри рода Hordeum.
При отдаленных скрещиваниях интенсивность роста и развития гибридных зародышей значительно снижена по сравнению с развитием этого процесса у родительских видов (Thompson, Johnston, 1945; Солнцева, Вишнякова, Дунаева, 1992). Химический состав ростовых факторов, в которых нуждается развивающийся гибридный зародыш, может быть неидентифицирован, либо достаточно сложен для воспроизведения в составе искусственных питательных сред. Поэтому метод эмбриокультуры был усовершенствован применением тканей-нянек при культивировании зародышей in vitro. В качестве тканей-нянек использовался обычно развивающийся эндосперм незрелой зерновки одного из родителей (Kruse, 1973,1974). При получении межвидовых гибридов Hordeum с использованием в качестве одного из родителей культурного ячменя для преодоления соматопластической стерильности была использована эмбриокультура с применением 14-16- дневного эндсперма tLvulgare в качестве ткани-няньки (Шумный, Першина, Нумерова и др., І979). Однако, применение тканей-нянек в эмбриокультуре гибридных зародышей при межвидовых скрещиваниях внутри рода Hordeum не привело к повышению эффективности культивирования по сравнению с эксплантацией зародышей непосредственно на обогащенные питательные среды (Лукьянюк, Игнатова, 1983).
Культивирование зародышей проводится, как правило, на плотных питательных средах с макроэлементами и дрожжевым экстрактом без микроэлементов (Ивановская, 1946; Brink, Cooper, Ausherman, 1944).
Аналогичные среды могут содержать только макроэлементы (Бутенко, 1964; Murashige, Skoog, 1962). Больший выход проросших растений от числа эксплантированных зародышей был получен на сбалансированной и обогащенной среде Крузе (Knise, 1973,1974).
Для повышения жизнеспособности в эмбриокультуре гаплоидных зародышей H.vulgare полученных с использованием гаплопродюсера H.bulbosum(2x) применяется среда Р8, разработанная С.ФЛукьянюк и С.А.Игнатовой на основе среды Гамборга (В5) (Лукьянюк, Игнатова, 1983). Среда Р8 может быть эффективно использована при культивировании гибридных зародышей в эмбриокультуре при межродовых скрещиваниях пшеницы с ячменем и рожью, а также при межвидовой гибридизации культурного ячменя с дикорастущими видами Hordeum (Пендинен Г.И., 1989; Суриков, Чернов, Пендинен, 1992). Подобные среды кроме минеральных элементов и сахарозы могут содержать большое количество сложных органических соединений для компенсации нарушений обмена веществ в гибридных клетках. Такие среды разработаны Норстогом, Као и Михайлкжом и рядом других авторов (Norstog, 1973; Као, Michailuk, 1975; Ницше, Венцель, 1980; Калинин, Сарнацкая 1980). Тем не менее, для культивирования гибридных зародышей успешно используются менее сложные среды, такие как В5 Гамборга, Мурасиге-Скуга, N6 Чу, которые позволяют проращивать морфологически дифференцированные зародыши межродовых гибридов ячменя (Суриков, Киссель, 1985; Суриков, Киссель, Орлова, 1986). При более отдаленных скрещиваниях, когда родительские виды не входят в пределы одного рода, могут применяться более сложные способы культивирования, такие как выращивание участков завязей с 5-6- дневными зародышами на двухслойной среде с активированным углем (Mathias, Espinosa, Robbelen, 1990). Поскольку установлено, что даже при гибридизации видов, значительно удаленных систематически, получаются глобулярные зародыши, подобный метод может быть использован для получения гибридных и гаплоидных растений (Zenkteler, Nitzshe, 1984).
Эмбриокультура зернового ячменя может применяться так же в селекции как эффективная система отбора биохимических мутантов и линий, устойчивых к ряду стрессовых факторов. Считают, что преимуществом эмбриокультуры является более высокая регенерационная способность зародышей и их непосредственная реакция на изменение химического состава питательной среды (токсины, тяжелые металлы и т.д.). Поскольку при использовании вместо зародышей целых семян определяющим недостатком является невозможность контроля состава веществ, получаемых зародышем из эндосперма (Брайт, Джаррет, Нельсон и др., 1987).
Каллусогенез и регенерация в культуре in vitro видов рода Hordeum и возможности микроклонального размножения межвидовых гибридов ячменя
Искусственное культивирование тканей растений широко применяется для вегетативного микроклонального размножения растений (Катаева, Бутенко, 1983). Микроклональное размножение служит также основным методом для размножения межвидовых и межродовых гибридов злаков (Chu, Sun, Chen at all, 1984). Дикорастущие виды рода Hordeum L., являющиеся родителями полученных межвидовых гибридов, остаются недостаточно изученными. Имеется лишь небольшое число работ, посвященных проблеме культуры тканей дикорастущих видов этого рода. В большинстве работ число форм, вовлеченных в исследования, ограничено 4-5 видами, произрастающими в северном полушарии, чаще всего это виды, входящие в секцию Hordeum (Исаева, Першина, Шумный, 1983; Бородько, Исаева, Годовикова, Шумный, 1991; Wang, Lortz, 1994), Hordeum jubatum L. из секции Critesion (Orton, 1979) и Hordeum marinum из секции Stenostachys (Rotem-Abarbanell, Breiman, 1988). Кроме того, изучались межвидовые гибриды с участием дикорастущих видов ячменя, относящихся ко всем секциям рода, но при этом родительские виды в культуре in vitro не исследовались (Jorgensen, Jensen, Anderson, Bothmer, 1986). Систематического изучения процессов каллусогенеза и регенерации видов Hordeum не проводилось. В связи с этим была предпринята попытка изучить каллусогенную и регенерационную способность видов ячменя различных секций и дать общую характеристику рода по изучаемым признакам.
Изучение особенностей каллусогенеза и регенерации различных видов рода Hordeum позволит также оптимизировать методы микроклонирования стерильных в F1 межвидовых гибридов ячменя. Изучение этих особенностей позволит заложить методические основы к использованию методов культуры тканей различных видов рода Hordeum в работах по соматической гибридизации и трансформации растений, а так же в разработках современных методов криоконсервации. Изучение культуры тканей видов Hordeum позволит модернизировать методы оценки ряда физиологических показателей при изучении частной физиологии видов рода Hordeum.
Для изучения особенностей каллусообразования у разных видов ячменя на питательных средах различного минерального состава в качестве эксплантов использовали незрелые зародыши. Выбор этого типа экспланта обусловлен тем, что ткани незрелых зародышей обладают высокой пролиферирующей активностью и тотипотентносгью, что отмечено в работах многих исследователей (Deambrogio, Dale, 1979; Goldstein, Kronstad, 1986; Breinman, Rotem-Abarbanell, Karp et al., 1987). В экспериментах были использованы питательные среды, чаще всего применяемые для культивирования тканей злаков; среда Чу N6, Мурасиге - Скуга MS, модифицированная среда Гамборга B5L. Качественный и количественный состав фитогормонов во всех средах был одинаков: 2 мг/л. 2,4 - Д в средах для каллусогенеза и 1 мг/л кинетина в средах для регенерации.
При эксплантации незрелых зародышей на каллусогенные среды во всех вариантах наблюдали индукцию каллусогенеза на 2-3 сутки после эксплантации. Активный видимый рост каллуса наблюдали на 4-7 день с момента эксплантации. У разных видов наблюдались незначительные различия во времени начала индукции каллуса и образовании видимой каллусной ткани.
Однако эти различия были связаны с видовой принадлежностью экспланта и не зависали от минеральной основы среды. Различий во времени индукции каллусогенеза в зависимости от состава среды не наблюдалось ни у одного из исследуемых видов.
При эксплантации на питательные среды незрелых зародышей ряда образцов Н. vulgare наблюдали высокую частоту каллусогенеза. (таблица 12).
У сорта Roland на 3-7 день на средах B5L и N6 наблюдали образование компактного плотного каллуса белого цвета. На среде Мурасиге-Скуга из эксплантов этого сорта образовывался так же компактный плотный каллус, но слабой желтой окраски. Средняя эффективность каллусогенеза у эксплантов этого сорта составляла на среде B5L 77,8%, на среде N6 - 71,7%, на среде Мурасиге-Скуга - 83,3%. Прирост каллусов после двух пассажей (по 30 дней каждый)составил 17,5 мг. на среде B5L, 18,2 мг. на среде Мурасиге-Скуга и более интенсивный прирост сырой биомассы каллуса на среде N6, составивший 62,3 мг. При эксплантации незрелых зародышей сорта Betzes на тех же средах наблюдали образование более рыхлого хорошо растущего каллуса белого или молочно-белого цвета. Наблюдали более высокую, чем у эксплантов сорта Roland, среднюю эффективность каллусогенеза на всех трех средах. Она составляла 85,9% на среде B5L, 85,0% на среду N6 и 96,4 на среде MS. У скороспелых сортов Полярный 14 и Ранний 1 характерны более низкая эффективность каллусогенеза и более высокий прирост сырой биомассы каллуса после двух пассажей. Внешний вид каллуса, сформировавшегося из зародышей ультраскороспелых сортов, был таким же, как у сорта Betzes и отличался от каллусов сорта Roland. На всех средах формировались рыхлые водянистые полупрозрачные каллусы белого цвета. Для этих сортов также было характерно интенсивное накопление сырой биомассы на всех используемых средах.
У дикорастущих подвидов H.vulgare: H.spontaneum и H.agriocrithon наблюдали высокую эффективность индукции каллусной ткани (таблица 12).
Микроклонирование in vitro дикорастущих видов ячменя и их гибридов с культурным ячменем
Значительное разнообразие процессов каллусогенеза и регенерации у различных видов ячменя, и в целом, высокий потенциал регенерации рода Hordeum позволяет применять для поддержания дикорастущих видов различные методы вегетативного размножения in vivo и in vitro. Методы размножения с применением культуры тканей особенно важны при низкой семенной продуктивности образца или наличии у него системы самонесовместимости.
Для всестороннего изучения вновь полученных межвидовых гибридов ячменя необходимо размножение исходных гибридных форм. Как показано ранее, все межвидовые гибриды ячменя стерильны и не воспроизводят поколение F2. Одним из распространенных методов размножения межвидовых и межродовых гибридов злаков является микроклонирование in vitro, заключающееся в индукции каллуса из молодых до мейоза соцветий и последующей регенерации растений из каллусов (Пендинен, 1989; Nakamura, Keller, Fedak, 1984 и др.).
Для оценки потенциала каллусогенеза и регенерации из молодых соцветий у образцов изучаемых видов, а так же особенностей проявления этих признаков у полученных с их участием гибридов, изучали возможности микроклонального размножения межвидовых гибридов и образцов ячменя, использованных в гибридизации в качестве родителей.
Начало каллусообразования из соцветий у всех изучаемых родительских образцов и гибридных форм наблюдали на 7-10 день после эксплантации. Из тканей молодых соцветий развивались каллусы, морфологические характеристики которых были сходны для разных видов в пределах одной секции. Эффективность каллусогенеза у исследованных сортов H.vulgare была значительно ниже, чем у большинства других видов и гибридов (таблица 10 приложения). При эксплантации соцветий на раневой поверхности образовывались мелкие каллусы, к концу третьей недели культивирования на тканях экспланта и каллуса развивался некроз. При пересадке каллусов на органогенную среду некроз каллусов продолжал развиваться.
Микроклонирование гаплоидов H.vulgare и полученных при скрещивании культурного ячменя сортов Bonus и Roland с диплоидным H.bulbosum, было неэффективным, так же как и микроклонирование исходных сортов. Индукции и роста каллусов из молодых соцветий на среде для каллусогенеза у этих форм не наблюдали (таблица 19, таблица 10 приложения).
Для образца дикорастущего подвида H.vulgare ssp.spontaneum W31, как и для культурного ячменя, характерна довольно низкая эффективность каллусогенеза, отсутствие регенерации и развитие некроза каллусов при пересадке на свежие питательные среды (таблица 10 приложения).
При эксплантации соцветий диплоидных образцов H.bulbosttm разных генотипов эффективность каллусообразования была различной у разных клонов. Показатель эффективности каллусогенеза варьировал от 15,0 до 100% в зависимости от генотипа (таблица 10 приложения). После пересадки на среду для органогенеза регенерации из каллусов, полученных из соцветий разных клонов диплоидного луковичного ячменя, не наблюдали.
Для тетраплоидного цитотипа H.bulbosum W4 оценку каллусогенеза и регенерации из соцветий проводили для нескольких растений-клонов внутри этого образца. Показатели эффективности каллусогенеза варьировали от 81,0 до 20,0 % у разных клонов. Образовавшиеся каллусы были крупными и рыхлыми. После пересадки полученных каллусов на органогенную среду регенерации растений не наблюдали, (таблица 10 приложения).
Для гибридов сортов Bonus и Roland с тетраплоидным луковичным ячменем W4 при микроразмножении были характерны сходные с исходным образцом луковичного ячменя характеристики каллусогенеза. Регенерации растений из каллусов, полученных из этих гибридов, на органогенной среде не наблюдали (таблица 19).
Йоргенсен с соавторами так же не наблюдали регенерации в каллусах гибридов культурного ячменя с тетраплоидным H.bulbosum при микроклонировании. Однако, авторы не изучали эти характеристики у гибридных форм (Jorgensen, Jensen, Andersen et al, 1986).
Изменчивость числа хромосом в микроспороцитах межвидовых гибридов культурного ячменя с видами секции Stenostachys
Гибриды культурного ячменя с видами секции Stenostachys были получены лишь в комбинациях с тетраплоидными образцами H.depressum W309 и И-538814 (2п=4х=28) и с H.parodii HI260 (2п=6х=42). Для изученного гибрида H.parodii х H.vulgare (2n=4x=U8) частота анеуплоидных микроспороцитов составляет более половины от числа изученных: число гипоплоидных 22- и 27-хромосомных клеток составляет 55,8%, гиперплоидных 29- и 31-хромосомных клеток - 7,0% (таблица 24).
Для реципрокных гибридов H.depressum с культурным ячменем так же характерна нестабильность числа хромосом в спорогенной ткани. Число эуплоидных клеток у гибридов H.depressum х H.vulgare составляет от 32,3% до 72,7% у различных растений, у реципрокных гибридов число эуплоидных клеток составляет от 28,0% до 66,7 % у отдельных растений.
У гаплоида H.depressum (п=2х=14), полученного при скрещивании образца W309 с культурным ячменем сорта Roland, анеуплоидных микроспороцитов не наблюдали. Все изученные микроспороциты содержали 14 хромосом. Следует отметить, что для гибридов используемых в данном исследовании образцов H.depressum с рожью Secak cereale, так же как и для гаплоида H.depressum изменчивости числа хромосом в спорогенной ткани пыльников не обнаружено (Пендинен, Чернов, 1995). Вероятно, онтогенетическая нестабильность у гибридов H.depressum с H.vulgare обусловлена геномом культурного ячменя. При скрещиваниях H.marinum(4x) с культурным ячменем гибридов получить не удалось из-за элиминации хромосом культурного ячменя в эмбриогенезе гибридных зародышей. Полученные же гаплоиды представляют собой цитогенетически стабильные формы, для которых не отмечена изменчивость в спорогенных тканях пыльников (таблица 25).
В литературе есть сведения только об одном гибриде H.marinum х H.vulgare, полученном с использованием диплоидного образца H.marinum; для этого гибрида отмечена изменчивость числа хромосом в спорогенной ткани пыльников (Bothmer, Flink, Jacobsen et. al, 1983). Таким образом, присутствие в гибридном геноме генома культурного ячменя ведет к нестабильности числа хромосом. Обобщая данные о цитогенетической нестабильности межвидовых гибридов культурного ячменя с дикорастущими видами Hordeum, следует отметить, что для всех гибридных комбинаций характерна значительная изменчивость по числу хромосом в популяции клеток спорогенной ткани пыльников, независимо от родительского дикорастущего вида, его систематического положения в роде Hordeum, а так же независимо от уровня штоидности: цитогенетическая нестабильность характерна как для гибридов культурного ячменя с тетраплоидными видами секций Critesion (H.jubatum) и Stenostachis (Kdepressum), так и для гибридов с гексаплоидными видами секций Hordeum (H.murinum, бх), Critesion (Kprocerum, ШесМегу, H.arizonicum), Stenostachys (H.parodii). Изменчивость по числу хромосом не связана с направлением скрещивания, то есть с влиянием цитоплазмы. Изменчивость хромосомного состава клеток спорогенной ткани пыльников характерна для реципрокных гибридов культурного ячменя с Kdepressum, H.jubatum, ШесЫегу, Karizomcum, Изменчивость хромосомного состава в спорогенных и соматическх тканях межвидовых гибридов культурного ячменя с рядом дикорастущих видов отмечены рядом авторов (Subrahmaniam, 1976; Bothmer, Flink, Jacobsen et al., 1983). Следует отметить, что для межродовых гибридов культурного ячменя с различными видами пшеницы и ржи, так же как для гибридов H.vulgare с дикорастущими видами Hordeumt отмечена значительная изменчивость числа хромосом в спорогенной ткани пыльников. Так, нестабильны по числу хромосом в соматических и спорогенных тканях гибриды культурного ячменя с видами ржи Secale cereaie, S.vavilovii, S.montanum, S.kuprijanovii (Fedak,1978; Tomas, Pickering, 1979; Fedak, Nacamura, 1982; Pohler, Clauss, 1984; Wojciechowska, 1987). Для всех гибридов H.vulgare с различными видами пшеницы: T.aestivum, T.turgidum, T.timopheevii, T.poionicum так же характерна изменчивость хромосомного состава клеток спорогенной ткани пыльников (Орлова, 1986; Суриков, Пендинен, 1994; Thomas, Mujeeb, Rodriques et al., 1977; Fedak, 1980, 1982; Islam, Shephard, Sparrow,!981; Wojciehowska, 1986). Среди гибридов дикорастущих видов ячменя секций Critesion, Anisolepis, Stenostacyis с видами пшеницы лишь у одного: К.depression х T.aestivum отмечена нестабильность числа хромосом в спорогенных тканях пыльников (Jiang, Lui, 1987). Для большинства описанных в литературе гибридов дикорастущих ячменей Н.ршШшп, H.californicum, H.marinum (2n=14), Hjubatum, H.pubiflorum, H.procerum, HAechlery с мягкой пшеницей T.aestivum , H.marinum (2n=28) с твердой пшеницей T.durum: а так же H.bogdanii, H.patagomcum с TMmopheevii нестабильность числа хромосом в соматических и спорогенных тканях не характерна (Kimber, Salli, 1979; Finch, Bennett, 1980; Fedak, 1985 a; Jiang, Liu, 1987; Pendinen, Chernov, 1998). У габридов H.chiiense (2n=14) с различными видами пшеницы: T.turgidum, T.aestivum, T.sphaerococcum, T.polonicum, T.diccocoides, T.georgicum нестабильность числа хромосом так же не обнаружена (Martin, Sanches-Monge Laguma, 1980; PadUla, Martin, 1987; Martin, Padilla, Fernandes, 1987). Для реципрокных гибридов H.chiiense с H.vulgare характерна изменчивость числа хромосом в соматических тканях, наблюдается тенденция к элиминации хромосом, сопровождающаяся снижением жизнеспособности (Thomas, Pickering, 1985). Следует отметить, что стабильные гибриды H.procerwn х T.aestivum, H.lechleryx T.aestivum, Hjubatum x T.aestivum получены с участием образцов дикорастущих ячменных трав, использованных нами также для получения гибридов этих видов с культурным ячменем; у этих гибридов отмечен значительный уровень изменчивости по числу хромосом в спорогенных тканях пыльников.
