Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Анализ основных современных концепций вида 9
1.1. Основные концепции вида 10
1.1.1. Концепция вида в классической систематике 12
1.1.2. Биологическая концепция вида 14
1.1.3. Концепция распознавания (recognition species concept, RSC) 19
1.1.4. Концепция сцепления (cohesion species concept, CSC) 20
1.1.5. Эволюционные концепции вида 21
1.1.6. Примеры последствий применения разных концепций вида 27
1.1.7. Некоторые выводы и спорные вопросы 30
Глава 2. Видообразование: проблемы и тенденции изучения 34
2.1. Синтетическая теория эволюции (СТЭ) 35
2.2. Сальтационистские теории эволюции 38
2.2.1. Концепции СИ. Коржинского и Г. де Фриза 39
2.2.2. Концепция Р. Гольдшмидта 43
2.2.3. Концепция Н. Элдриджа и С. Гулда ...45
2.3. Хромосомное видообразование . 46
2.3.1. Понятие кариотипа 46
2.3.2. Хромосомная изменчивость и хромосомное видообразование 47
2.3.3. Структура кариотипа и закономерности его изменений... 49
2.3.4. Концепции хромосомного видообразования 51
2.3.5. Механизмы закрепления генетических изменений 59
2.4. Геномные мутации 71
2.5. Возможные причины возникновения множественных хромосомных перестроек, роль мобильных генетических элементов 75
2.6. Гибридизация и ее значение для видообразования 78
Глава 3. Хромосомные перестройки и структура клеточного ядра 87
Глава 4. Определение пола - общие проблемы 97
4.1 Механизмы определения пола 99
4.1.1. Система определения пола у дрозофилы ...99
4.1.2. Система определения пола у нематоды 100
4.1.3. Определение пола у комнатной мухи 101
4.1.4. Другие способы детерминации пола у насекомых 104
4.1.5. Системы хромосомного определения пола у высших позвоночных 105
4.1.6. Инактивация Х-хромосомы у млекопитающих 108
4.1.7. Молекулярно-генетические механизмы определения
пола у млекопитающих 111
4.2. Эволюция систем определения пола у высших позвоночных 116
Глава 5. Примеры робертсоновских вееров 120
5.1. Робертсоновский веер Mus domesticus 120
5.2. Землеройки Soricidae 124
5.2.1. Бурозубки Sorex araneus 124
5.2.2. Землеройки p. Blarina 127
5.3. Хромосомная изменчивость и необычное определение пола у Tokudaia osimensis (Rodentia: Murinae) 129
5.4. Кустарниковые полевки p. Terricola 131
Глава 6. Слепушонки как модель для изучения закономерностей хромосомного видообразования и системы определения пола 135
6.1. Система рода Ellobius, характеристика кариотипов видов 135
6.2. История изучения робертсоновского веера Е. tancrei... 138
6.3. Изучение системы определения пола у Е. lutescens (Х0-Х0) иЕ. tancrei (ХХ-ХХ).. 139
Глава 7. Материал и методы исследования 145
7.1. Природная выборка 145
7.2. Разведение и гибридизация разных видов и хромосомных форм слепушонок 145
7.3. Номенклатура хромосом Ellobius tancrei 149
7.3.1. Номенклатура метафазных хромосом формы с 2и=54 149
7.3.2. Описание хромосом кариоморфы с 2л=32 152
7.4. Методики исследования 155
7.4.1. Разведение и гибридизация разных видов и хромосомных форм слепушонок 155
7.4.2. Составление базы данных по разведению 157
7.4.3. Приготовление хромосомных препаратов 157
7.4.4. Электронно-микроскопическое изучение синаптонемного комплекса 158
7.4.5. Выявление неактивной Х-хромосомы (методика Канда). 159
7.4.6. Изучение наследования генов Foxl2 и Pirstl и их роли в определении пола у Ellobius lutescens 159
7.4.7. Статистическая обработка результатов 160
Глава 8. Анализ распространения разнохромосомных форм Ellobius tancrei 161
8.1. Картирование зоны робертсоновского веера Е. tancrei на основе дифференциальной G-окраски 164
8.1.1. Распространение низкохромосомных 32- и 34- хромосомных форм 165
8.1.2. Границы веера — зоны контакта с исходной формой 2и=54 166
8.1.3.Распространение хромосомных форм. Правый берег р. Сурхоб 168
8.1.4. Распространение хромосомных форм. Левый берег р. Сурхоб 172
8.1.5. Распространение хромосомных форм. Левый берег р. Вахш : 172
8.1.6. Распространение хромосомных форм. Междуречье рек Сорбог, Сурхоб, Санги-Кар 174
8.2. Анализ структуры кариотипа у слепушонок вне зоны робертсоновского веера 176
8.2.2. 50-хромосомные формы 178
8.3. Изучение распространения алайской слепушонки Е. alaicus и особенностей ее хромосомного набора 181
Глава 9. 185 Экспериментальная гибридизация слепушонок 185
9.1. Плодовитость разных видов p. Ellobius 186
9.2. Гибридизация различных форм Е. tancrei, Е. talpinusuE. alaicus 189
9.2.1. Гибридизация крайних форм 190
9.2.2. Гибридизация форм, отличающихся по одной робертсоновской перестройке 194
9.2.3. Гибридизация низко- и высокохромосомных форм, включая возвратные скрещивания гибридов с родительскими формами 203
9.2.4. Гибридизация других форм 209
Глава 10. Анализ наследования робертсоновских транслокаций у слепушонок в природе и эксперименте 211
10.1. Анализ природной выборки 211
10.2. Анализ экспериментальной выборки 217
10.2.1. Гибридизация высоко- и низкохромосомных форм 217
10.2.2. Гибридизация форм с 2я=34 и 2п=32 219
Глава 11. Особенности определения пола у слепушонок по данным молекулярного и цитогенетического анализа 223
11.1. Попытка выявления полоопределяющего фактора у слепушонок Е. lutescens, система определения полаХ0 223
11.2. Выявление инактивированнойХ-хромосомы у Е. tancrei, система определения пола ХХ-ХХ. 225
Заключение 230
Выводы 248
Список цитированной литературы 251
- Хромосомная изменчивость и хромосомное видообразование
- Системы хромосомного определения пола у высших позвоночных
- Разведение и гибридизация разных видов и хромосомных форм слепушонок
- Гибридизация низко- и высокохромосомных форм, включая возвратные скрещивания гибридов с родительскими формами
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение закономерностей процесса эволюции, несмотря на многовековую историю биологии, остается одним из центральных, основополагающих направлений в биологии. Представления о том, что такое вид и как происходит видообразование, менялись неоднократно (Воронцов, 1999). Невозможно изучать способы видообразования, не определив понятие вида и критерии его выделения. В качестве теоретической основы для наших исследований была выбрана биологическая концепция вида. Именно в этой концепции вид рассматривается в первую очередь как определенное генетическое единство, при этом допускается некоторый поток генов извне и не отрицается творческая роль гибридизации (Мауг, 1996). Сейчас, когда внимание биологов сместилось от эволюции морфологических признаков к эволюции генетических систем, изучение закономерностей хромосомного видообразования, как одного из вариантов генетического, представляется весьма многообещающим для объяснения эволюции ряда групп живых организмов.
Современная концепция эпигенетики, как науки о наследственных изменениях, не связанных с изменением первичной структуры ДНК, большое значение придает различного рода модификациям упаковки ДНК. Исследования структуры ядра, выявление индивидуальности хромосомных территорий и постоянства их взаимного расположения в ядре в интерфазе позволили установить взаимосвязь между положением и функцией (Cremer et al., 2001, Parada & Misteli, 2002; Laat & Grosveld, 2003). В частности, реорганизация хромосомных территорий, изменение локализации хромосом могут вызвать изменения транскрипционной активности, что, в свою очередь, не может не сказаться на функционировании генетических сетей. Эти процессы могут привести к модификации фенотипа (включая не только морфологические, но другие характеристики, например, экологические или этологические). Вероятно, перестройки любого типа нарушают пространственное расположение хромосом, но робертсоновские транслокации, вследствие перемещения целых хромосом, могут приводить к наибольшим изменениям внутриядерной организации. Именно поэтому с точки зрения видообразования представляется интересным изучение случаев широкой робертсоновской изменчивости.
Разнообразие структуры хромосомных наборов, систем определения пола делают слепушонок рода Ellobius уникальной модельной группой для изучения различных аспектов видообразования, в том числе и хромосомного, а также проблем определения пола на хромосомном и генном уровнях.
Цель и задачи исследования. Цель исследования - выявление закономерностей видообразования и эволюции систем определения пола у слепушонок рода Ellobius.
Задачи исследования:
- определение степени дифференциации различных хромосомных форм у Е. tancrei и Е. alaicus на основе изучения природных популяций;
- изучение структуры робертсоновского веера Е. tancrei (Памиро-Алай);
- обоснование роли хромосомных перестроек в процессе видообразования у Е. alaicus; определение уровня репродуктивной изоляции между различными хромосомными формами Е. tancrei, а также Е. alaicus путем экспериментальной гибридизации;
- изучение цитогенетических механизмов снижения плодовитости гибридов разнохромосомных форм Е. tancrei;
- выявление закономерностей наследования робертсоновских
транслокаций у гибридов разных хромосомных форм в природе и эксперименте;
- изучение особенностей изоморфных половых хромосом у Е. tancrei
- тестирование одного из факторов (т.н. PIS) на принадлежность к системе определения пола у Е. lutescens.
Основные положения, выносимые на защиту. Видообразование может начинаться с изменения хромосомного набора, поскольку перестройки хромосом и робертсоновские транслокации, в частности, изменяя внутриядерную организацию, ведут к трансформации генетических сетей и фенотипа. Становление нового хромосомного набора определяется закономерностями, связанными со структурой хромосом.
Гибридизация является одной из движущих сил эволюции, в результате гибридизации возможно возникновение новых форм и видов.
Научная новизна. На уникальной модели - слепушонках рода Ellobius проведено изучение закономерностей эволюции и показана инициирующая роль хромосомных перестроек в видообразовании данной группы. Впервые выполнено комплексное изучение полного робертсоновского веера слепушонок группы Ellobius tancrei в долине рек Сурхоб-Вахш (Памиро-Алай), включающее в себя разработку номенклатуры хромосом исходного набора и низкохромосомной формы, картирование зоны робертсоновского веера на основе дифференциальной G-окраски хромосом и анализ изменения плодовитости у гибридов, полученных в различных типах, скрещивания. Выявлена гибридизация в природе между разными хромосомными формами и видами слепушонок. Описаны негомологичные робертсоновские слияния вне зоны робертсоновского веера, на Памиро-Алае, Тянь-Шане и в Казахстане. Показаны закономерности в наследовании робертсоновских транслокаций на двух модельных системах — при моделировании природного веера в эксперименте путем гибридизации крайних форм в сочетании с возвратными скрещиваниями, и при гибридизации форм, различающихся по одной транслокации. Выявлены цитологические механизмы снижения плодовитости различных гибридов и обнаружена неравнозначность различных робертсоновских транслокаций, что определяет разную эволюционную судьбу соответствующих хромосомных форм. На основе анализа структуры хромосомного набора подтвержден видовой статус Ellobius alaicus и уточнены границы распространения вида, а также описаны новые слияния робертсоновского типа. Определена плодовитость всех видов рода Ellobius и соотношение полов при рождении. У вида Е. tancrei, для которого известна система определения пола XX у обоих полов, выявлен ряд нехарактерных для млекопитающих особенностей поведения половых хромосом в мейозе; в соматических клетках этого вида выявлена одинаковая система инактивации X хромосом у самцов и самок, что не ведет к стерильности самцов.
Теоретическое и практическое значение. Изучение робертсоновских вееров на модельных системах, таких как слепушонки Ellobius tancrei, Е. alaicus предоставляет возможность разработки теоретических проблем становления новых видов, дифференциация которых начинается с изменения структуры хромосомного набора. Исследование роли хромосомных мутаций в возникновении полной или частичной стерильности имеет практическое значение для медицинской генетики, а также для изучения путей преодоления стерильности при отдаленной гибридизации млекопитающих с целью получения новых пород. Изучение необычных генетических механизмов определения пола, включая хромосомное определение пола и каскад генов по детерминации пола, важно для выявления причин стерильности человека и животных.
Хромосомная изменчивость и хромосомное видообразование
Концепция хромосомного видообразования нередко вызывает массу отрицательных эмоций. Многие исследователи полагают, что вариабельность хромосомного набора не может быть основой процесса видообразования, а изменения накапливаются после того, как виды возникли, и их геномы оказались изолированы. Это классический подход популяционных генетиков, который преобладал в работах приверженцев синтетической теории эволюции, включая ее новейшие модификации. Основным аргументом против хромосомного видообразования является тот, что известно довольно много случаев хромосомного полиморфизма разного типа. Существует большое количество работ, посвященных этой проблеме (см., например, обзор В.Н. Орлова и Н.Ш. Булатовой (1983) и, там же, список хромосомных чисел, составленный Е.Ю.Иваницкой, а также монографию Э.А. Гилевой (1990), очень много хромосомных аномалий описано для человека). Нами также были описаны и исследовались различные типы полифоризма, например, у монгольской полевки (Яценко и др., 1980), у обыкновенного слепыша (Пузаченко, Баклушинская, 1997). Аберрации могут наблюдаться и в разных тканях, более того, нормой например, является полиплоидизация печеночной ткани. Может сложиться впечатление, что хромосомный набор — достаточно изменчивый признак, с одной стороны, а с другой, — его изменения не связаны с видообразованием. Полиморфизм возникает и, очевидно, поддерживается благодаря неким механизмам, но при этом не происходит четкого разделения или преобразования группы в нечто новое. Из этой предпосылки делается вывод, что хромосомные перестройки не могут играть инициирующую роль в видообразовании. Действительно, в подавляющем большинстве случаев мы наблюдаем сбалансированный полиморфизм, который удовлетворяет правилу Харди-Вайнберга. Полиморфизм по делециям гетерохроматина, например, может длительное время сохраняться в популяции, поскольку перестройки такого типа не ведут к снижению плодовитости. Некоторые инверсии не оказывают влияния на ход мейоза и этот полиморфизм также может наблюдаться в популяциях с некоторой определенной частотой. Но хромосомные перестройки могут вызывать как изменение количества хромосомного материала (делеции или дупликации, которые могут иметь разное значение в зависимости от того, эу-или гетерохроматин вовлечен в эти перестройки), так и его перераспределение. Изменение положения отдельных блоков при инверсиях разного типа давно уже признано важным событием для изменения структуры генома, как правило, эти перестройки необратимы и имеют эволюционное значение. По-видимому, робертсоновские транслокации, изменяя взаимное расположение хромосом в ядре, тем самым вызывают изменения генетических систем, что может вести к видообразованию. Таким образом, различные перестройки могут вести к становлению стабилизированного полиморфизма или к дивергенции форм вплоть до образования новых видов.
Необходимо остановиться на вопросе о том, случайно или нет возникают хромосомные перестройки. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что существуют закономерности мутационного процесса на уровне реструктуризации кариотипа. Очевидно, что набор с преобладанием акроцентрических хромосом будет предрасположен к слияниям или WARTs, тогда как в «сбалансированном», по определению М.Уайта, наборе с большей вероятностью произойдут инверсии или разделения хромосом. М. Уайтом был также введен термин «кариотипическая ортоселекция» для объяснения неслучайности возникновения хромосомных перестроек одного типа в сходных кариотипах (White, 1978а). М. Уайтом были даны 5 возможных объяснений этого явления:
1) сходные перестройки имеют сходные фенотипические проявления, которые адаптивны для данных условий - весьма спорное утверждение, но поскольку исходно эта концепция развивалась для таксономически близких групп, по-видимому, и делается такой вывод, однако совершенно очевидно, что возможность преобразования акроцентрического набора в метацентрический будет сохраняться и для неродственных групп, наверняка не разделяющих сходные условия обитания;
2) ограничения по размеру и числу хромосом в клетке определяются особенностями цитоплазмы и веретена и механикой клеточного деления — также достаточно спорное утверждение, в первую очередь потому, что нет соответствующих цитологических данных, а некие особенности мейотической системы организмов, о которых говорят Уайт и Кинг, также остаются неопределенными;
3) внутренняя архитектура хромосом и распределение сатДНК, гетерохроматина и рДНК могут налагать ограничения на возможность перестроек — это положение представляется наиболее интересным и перспективным. Далее мы остановимся подробнее и на особенностях сатДНК (на примере Mus, см. Garagna et al., 2001), и в особенности, на данных по структурире ядра;
4) особенности архитектуры интерфазного ядра могут иметь адаптивное значение и таким образом влиять на закрепление перестроек определенного типа - несомненно, это положение нужно рассматривать вместе с 3;
5) локализация хиазм также является ортоселективным процессом, ряд перестроек может быть запрещен именно из-за нарушения их положения.
М. Кинг (King, 1993) полагает, что эти критерии можно свести до двух: предрасположенность кариотипа к определенного типа перестройкам и структурная организация кариотипа, которая может обеспечить закрепление этих перестроек. Такое упрощение не представляется нам логичным. Так, очевидно, что разделение метацентрической хромосомы на две акроцентрические будет затруднено, если утрачены соответствующие перицентромерные области, необходимые для формирования нормальных центромер и, возможно, теломерных участков. Вместе с тем, в такой ситуации возможны инверсии, которые приведут к формированию акроцентриков, а затем, так сказать, на втором этапе, может происходить слияние акроцентриков в метацентрики. Возможны в такой ситуации и WARTs, которые наблюдаются у домовых мышей и бурозубок. Основной вывод ведущих теоретиков хромосомного видообразования состоит в том, что случайные мутации служат основой для неслучайных процессов, ортоселекция обусловлена особенностями генома каждой конкретной группы.
Системы хромосомного определения пола у высших позвоночных
Системы хромосомного определения пола различны и в основных группах высших позвоночных - у млекопитающих, птиц, рептилий. Они включают гетерогаметных самцов (XX самки, XY самцы характерны для млекопитающих), гетерогаметных самок (ZW самки, ZZ самцы у птиц и змей), а также множество других генетических и зависящих от окружающей среды систем определения пола, например, определение пола у аллигаторов зависит от температуры.
Различия в гетерогаметной системе самцов и самок разных групп весьма значительны. Предположение С. Оно (Ohno, 1967) о происхождении половых хромосом и последствиях изменения дозирования X и Y генов позволило понять основные принципы организации половых хромосом, их функции, закономерности эволюции. Его гипотеза о том, что гетероморфные половые хромосомы эволюционировали из аутосомных пар, объясняет гомологию между X и Y в пределах и вне псевдоаутосомальной области. Нарушение этой гомологии и дифференциацию X и Y-хромосом можно проследить у разных видов. С. Оно также предположил, что одним из последствий X и Y дифференциации является различие дозы генов, находящихся на Х-хромосоме у самцов и самок, и что компенсация дозы генов достигается путем инактивации X и регуляции активной X, которая, в свою очередь, закрепляется отбором как высоко консервативная X-хромосома. Как оказалось, «Правило Оно» о консервации Х-хромосомы верно только отчасти, но исключения из него помогли лучше понять само правило. Действительно, X и Y содержат консервативные области, которые встречаются у всех млекопитающих, и недавно добавленные области, которые могли быть аутосомными у отдаленных видов. Для большей части генов Y-хромосомы может быть найдена гомология на X, отражающая общность предковых генов у исходных аутосом — ирото-XY.
У всех плацентарных млекопитающих большая и богатая генами X-хромосома и маленькая гетерохроматиновая Y-хромосома негомологичны за исключением небольшого «псевдоаутосомного региона» ("pseudoautosomal region" - PAR) (Burgoyne, 1982) на одном или обоих концах, которыми они соединяются и где идет рекомбинация в мейозе. Х-хромосома плацентарных млекопитающих составляет 5% гаплоидного генома, у человека она несет от 3 до 4 тысяч генов (Pask & Graves, 1999). Как впервые было отмечено С. Оно (Ohno, 1967) Х-хромосома очень консервативна по размерам и содержанию генов у различных видов, вероятно из-за сильного отбора против разрушения инактивационной системы хромосом. Этот консерватизм продемонстрирован путем сравнительного генного картирования и хромосомного пэинтинга (O Brien et al., 1999). Поскольку у самок в наборе две копии Х-хромосомы, а у самцов — только одна, должно быть значительное нарушение баланса дозы генов между полами. Для компенсации этого нарушения развился механизм инактивации одной из Х-хромосом во всех соматических клетках самок.
У большинства плацентарных млекопитающих Y-хромосома маленькая, гетерохроматиновая, она несет несколько активных генов, затерянных среди повторяющихся последовательностей и псевдогенов. Y-хромосома человека несет до 2% гаплоидного набора, ее дистальная половина состоит из повторяющейся, некодирующей ДНК. В Y-хромосоме человека описано около 20 генов и 12 в коротких псевдоаутосомных участках (PARs). У мыши примерно то же количество охарактеризованных генов сосредоточено в коротком плече, а длинное плечо состоит из повторяющихся последовательностей и терминального PAR.
Полоопределение генеративных клеточных линий связано с тестикулярным окружением и, следовательно, не прямо зависит от сигнала от Y-хромосомы. Например, XY генеративные клетки могут развиться как ооциты, если их выделить из тестикулярной ткани.
Основания считать Y-хромосому у плацентарных млекопитающих ответственной за мужской пол исходно базируются на исследованиях различных отклонений, в первую очередь у человека, а также у других видов (см. сводку, включающую данные по 9 отрядам млекопитающих (Vaiman and Pailhoux, 2000)). Анеуплоиды по половым хромосомам являются самцами, если они сохраняют Y-хромосому, и самками, если они теряют ее, независимо от того, сколько Х-хромосом есть в наборе. Особи с нормальной Y-хромосомой развиваются как самцы, несмотря на присутствие избыточных
Х-хромосом. У человека 47 -хромосомные XXY индивидуумы (синдром Кляйнфельтера) имеют мужской фенотип, тогда как 45-хромосомные ХО и 47-хромосомные XXX имеют женский фенотип. Однако, анеуплоиды по половым хромосомам, на самом деле, с трудом поддаются сравнению, поскольку все Х-хромосомы, за исключением одной, инактивированы. Существует, по крайней мере, один локус на Х-хромосоме, идентифицированный как DAX1 ген, который является геном, изменяющим пол, когда он присутствует в двух экземплярах на активной Х-хромосоме (Muscatelli et al., 1994). Вероятно, те гены, связанные с Х-хромосомой, которые задействованы в дифференциации по полу при определении самки, могут особым образом избегать инактивации так, что они будут присутствовать в соотношении 2:1 самка : самец (дифференциация по дозе). Интерсексуальные фенотипы у сумчатых типа ХО и XXY предполагают, что некоторый половой диморфизм (testis determination) определяется с помощью Y-доминантного механизма, но на другие (scrotum/pouch-mammary gland differentiation) влияет доза половых хромосом (Cooper et al., 1993).
Разведение и гибридизация разных видов и хромосомных форм слепушонок
Для каждого животного велась родословная. Записывались место отлова или время рождения, родители, партнеры, потомство. Отдельные гибридизационные эксперименты ставили по мере поступления животных и получения от них потомства, при этом сначала мы получали потомство от "чистых форм", а затем, по мере увеличения числа особей с одинаковыми хромосомными числами, проводили скрещивания разных кариоморф. Для получения потомства самцы и самки ссаживались попарно в отдельные клетки, за ними велось наблюдение. При агрессивности партнеров их рассаживали и через некоторое время (2-3 дня) заменяли другими. Как правило, наиболее агрессивными были самцы, содержавшиеся в одиночку более месяца, в этих случая наблюдалось несколько случаев гибели подсаженных самок. Детенышей отсаживали от родителей в возрасте 2,5-3 месяцев, когда они уже почти достигали размера родителей, но еще имели ювенильную окраску шерсти, при этом сразу же формировались пары.
При формировании пар исходных (чистых) форм мы старались скрещивать партнеров-потомков первого поколения от разных производителей, а в дальнейшем наименее близкородственных, чтобы уменьшить эффект инбридинга. Для выявления генов, связанных с определением пола у Е. lutescens, напротив, было проведено близкородственное скрещивание (брат-сестра).
К сожалению, не от всех форм было получено потомство, так как часть особей не смогла адаптироваться к условиям вивария и погибла. Именно поэтому не было получено чистой линии 48-хромосомных слепушонок, очень сложно разводить Е. lutescens, так как они очень часто поедают приплод в течение нескольких часов после его рождения.
Хромосомные числа животных, вовлеченных в гибридизационные эксперименты, считались известными заранее, поскольку в природе животные отлавливались в "чистых" демах, но затем мы обязательно проверяли каждую пару по потомству. Кариологический контроль велся в ходе каждого эксперимента. На виварном материале (включая родителей, отловленных в природе) мы проанализировали хромосомные наборы 339 животных.
На основе родословных книг создана база данных в формате Access по плодовитости разных видов и разнохромосомных форм слепушонок, содержащая данные о 1639 особях слепушонок, включая особей-родоначальников из природы и всех животных, полученных в ходе гибридизационных экспериментов. Включены следующие данные: порядковый номер, вид, число хромосом, пол, дата рождения или место отлова в природе, номер и число хромосом родителей, номер и число хромосом партнеров, дата ссаживания, дата и число пометов, число детенышей, их порядковые номера, пол, число хромосом; дата и причина смерти, номер по цитологическому журналу (если сделаны препараты хромосом).
Препараты хромосом приготавливались из костного мозга по стандартной методике, предложенной С. Фордом и Дж. Хамертоном (Ford, Hamerton, 1956).
Дифференциальное G-окрашивание хромосом проводилось по методике М. Сибрайт (Seabright, 1971) через 7 - 10 дней после приготовления препаратов. Для получения дифференциально окраски хромосом препараты сначала выдерживали в 0,25% растворе трипсина (время воздействия 30-90 сек.), затем ополаскивали в растворе 2xSSC, высушивали и окрашивали в 2% растворе Giemsa (Merck) в течение 10-40 минут. Дифференциальное С-окрашивание получено по методике А. Самнера (Sumner, 1972).
Для анализа цитологических механизмов снижения плодовитости мы изучали ход мейоза у гибридов и, для контроля, у исходных форм с помощью электронно-микроскопического метода кариотипирования меиотических клеток на основе тотальных синаптонемных комплексов (СК). Эта часть работы была проведена на базе и совместно с сотрудником Института общей генетики РАН д.б.н. О.Л.Коломиец, на заключительном этапе мы проводили исследования самостоятельно на базе ИБР РАН.
Методика. Использовались только клетки семенников самцов. Для исследования под электронным микроскопом препараты готовились по методу М. Дрессера и М. Мозеса (Dresser, Moses, 1980) с небольшими модификациями.
1. Извлеченный семенник помещали в среду Игла на стекло с лункой, делали надрез и выдавливали канальцы. Измельчали канальцы и гомогенизировали суспензию. Переносили суспензию в пробирку и ставили на лед.
2. 5 мкл суспензии клеток семенника в растворе среды наносили на поверхность выпуклого мениска капли (20 мкл) 0.2 М раствора сахарозы или 0.5% раствора NaCl (гипотонические растворы). При этом клетки набухают, разрываются и распластываются по поверхности гипофазы.
3. Через 1 минуту в случае NaCl или 2 минуты в случае сахарозы к поверхности гипофазы прикасались предметным стеклом, покрытым электронно-прозрачной химически стойкой пленкой (0.6% раствор в хлороформе измельченных чашек Петри фирмы Falkon или Flow).
4. Фиксация клеток проводилась 4% раствором параформальдегида, рН 8.5.
5. Окрашивание осуществлялось 70% р-ром азотнокислого серебра при температуре 55-60 в течение трех-пяти часов.
Затем под световым микроскопом отбирались пластинки, вырезались с помощью алмазного объектива-маркера, переносились на бленды и анализировались под электронным микроскопом JEM-100 В и Tesla. Материал. Получены данные по СК у 13 животных: 3 самца имели 2п=54 (зоологический номер одного животного - 22606, остальным номера не присваивались), 2 самца имели 2п=34 (20641, 22607), 4 гибрида F1 54 на 34 (20642, 21201, 21219, остальным номера не присваивались), 3 гибрида 52 на 50 (21480, 21815, 21818), гибрид 34 на 32 (21470), 2 гибрида от разведения "в себе" 48 на 54 (23573, 23663).
Гибридизация низко- и высокохромосомных форм, включая возвратные скрещивания гибридов с родительскими формами
В ходе многолетних экспериментов был получен большой материал по гибридам разных поколений. Его достаточно трудно анализировать из-за большого количества вариантов скрещивания, поэтому для систематизации нами была создана база данных (см. Главу 7), а также были построены родословные древа, графически представляющие различные фрагменты базы данных (рис. 21). В табл. 6 представлены полученные нами данные о структуре хромосомных наборов части гибридов 2-6 поколений, которые были использованы для статистической обработки.
Построение родословных древ дало возможность составить представление о характере наследования транслокаций. Родословное древо (рис. 21), на котором графически представлен фрагмент базы данных по разведению и гибридизации разных форм слепушонок, отражает родственные связи части изученных нами животных. Это одна из построенных нами родословных для выборки гибридов. Большой разброс хромосомных чисел и вариации сочетаний метацентриков в потомстве гибридов, несущих максимально 9 робертсоновских транслокаций, позволяет говорить об отсутствии жестких цитологических барьеров для распространения Rb-транслокаций при гибридизации. Например, при скрещивании гибридов Fi с 2п=45 среди потомства разброс хромосомных чисел был весьма велик: от 43 до 49 (№№ 272, 305, см. табл. 6). При этом у самца с 2n=43 (F2) наблюдаются 4 метацентрика в гомозиготном состоянии, и три - в гетерозиготном. Удивительно, что в условиях эксперимента уже к 4-6-му поколению наблюдается формирование кариотипов, несущих гомозиготы по нескольким слияниям (рис. 22). При противодействии закреплению робертсоновских транслокаций мы наблюдали бы увеличение числа полностью акроцентрических кариотипов уже во втором поколении, но этого не происходит. В Главе 10 мы приведем результаты сравнительного анализа наследования робертсоновских транслокаций в природе и эксперименте.
Данную серию гибридизационных экспериментов мы ставили с целью выяснить, все ли варианты скрещиваний являются "разрешенными" и, если удастся, оценить существование "запретов" на цитогенетическом уровне при гибридизации разных кариоморф и видов. Нами не было получено потомства при скрещивании кариоморф 50x50 - Ачек-Альма х Войдара. Мы знаем, что эти формы имеют негомологичные робертсоновские метацентрики (глава III): в кариотипе слепушонок из Ачек-Альмы это пары ЕС5 и ЕВ4, а у слепушонок из Войдары (Сурхобская долина) - ЕС5 и F13D6 (рис. 13). Как и в случае Е. alaicus мы не можем быть уверены в гомологичности пар ЕС5 без специальной проверки, а вторые пары метацентриков очевидно не гомологичны. По-видимому, структурные изменения кариотипа такого рода ведут к полной репродуктивной изоляции. При этом вполне вероятно, что возможна та же ситуация, что и у Mus domesticus, когда обмен генами между нескрещивающимися формами может идти через исходную форму (2п=40 у мышей, 2п=54 у слепушонок). Было бы очень интересно проверить эту гипотезу, изучив зону вокруг Ачек-Альмы и Ходжа-Оби-Гарма (где также обнаружены негомологичные слияния, см. Главу 8), и выяснить, есть ли гибриды между этими формами и исходной, есть ли какие-то варианты хромосомных наборов, совмещающих слияния робертсоновского веера и этих 50-хромосомных форм. И, конечно, необходимо проверить гомологичность слияний ЕС5 у данных форм и форм из робертсоновского веера.
Интересно, что нами было получено потомство при скрещивании другого вида, Е. talpinns с 32-хромосомной формой (4 выводка). Кариотипы этих животных различаются не только по числу хромосом, но и по числу плеч хромосом (NF=54 и 56 соответственно), что обусловлено инверсией, и, тем не менее, возможно получение потомства, и даже получение единичного потомства при возвратном скрещивании (к 32-хромосомной форме - 2 выводка по одному детенышу в каждом). Отсутствие гибридов второго поколения подтверждает значительное расхождение геномов, поскольку, как известно, получение потомства первого поколения и возвратных к родительским формам не является показателем отсутствия серьезных репродуктивных барьеров. Невозможность получения второго гибридного поколения четко указывает на значительные различия геномов, препятствующие обмену генами между видами. Следует еще раз подчеркнуть, что в рамках биологической концепции вида получение гибридов первого поколения путем искусственного скрещивания не может являться доказательством конспецифичности аллопатрических видов.
