Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Патогенетические основы аллергии 10
1.2. Общие принципы лечения аллергических заболеваний 17
1.3. Сукцинатсодержащие средства и возможности их применения при аллергии 26
2 Материалы и методы исследования 34
2.1. Материалы исследования 34
2.2. Методы исследования 36
2.2.1. Модели экспериментальной аллергии 36
2.2.2. Оценка антигипоксической активности 42
2.2.3. Оценка острой токсичности лекарственных веществ у сенсибилизированных животных 43
2.2.5. Статистические методы исследования 44
3 Исследование влияния метаболических корректоров (препаратов янтарной кислоты, натрия сукцината и дихолина сукцината) на течение экспериментальных аллергических реакций немедленного и замедленного типов 45
3.1. Исследование влияния дихолина сукцината, ремаксола, реамберина и цитофлавина на течение системной анафилаксии у мышей 46
3.2. Исследование влияния дихолина сукцината, реамберина, ремаксола и цитофлавина на выраженность реакции активной кожной анафилаксии у мышей 54
3.3. Исследование влияния дихолина сукцината, ремаксола, реамберина и цитофлавина на уровень спонтанной и антиген-индуцированной дегрануляции базофильных лейкоцитов крови сенсибилизированных кроликов in vitro 60
3.4. Исследование влияния метаболических корректоров на развитие кожной аллергической реакции замедленного типа у мышей 66
4 Исследование антигипоксической активности метаболических корректоров (препаратов янтарной кислоты, натрия сукцината и дихолина сукцината) при экспериментальной анафилаксии 70
4.1. Оценка антигипоксической активности метеболических корректоров в тесте острой гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме у интактных мышей 70
4.2. Оценка антигипоксической активности метеболических корректоров в тесте острой гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме у сенсибилизированных мышей до и во время индукции системной анафилаксии 77
Заключение 82
- Общие принципы лечения аллергических заболеваний
- Оценка антигипоксической активности
- Исследование влияния метаболических корректоров на развитие кожной аллергической реакции замедленного типа у мышей
- Оценка антигипоксической активности метеболических корректоров в тесте острой гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме у сенсибилизированных мышей до и во время индукции системной анафилаксии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем современной медицины является совершенствование фармакотерапии аллергических заболеваний, которые широко распространены во всем мире (Адо В.А., Мокроносова М.А. 1997; Гущин И.С, 1999, 2001; Хаитов P.M., 2002; Гущин И.С, РІльина Н.И., Польнер С.А., 2002; Булина О.В., Горланов И.А., Калинина Н.М., 2004). Так, по данным различных источников (Мюллер В.Д., Йегер Л, 1999; Godfrey К.,1997 Kaliner М., 1997, Cross S., Buck S., Hubbard J., 1998) в настоящее время аллергические нарушения регистрируются в среднем у 10-20% населения развитых стран. Неблагоприятные тенденции в отношении роста заболеваемости аллергией во многом связаны с загрязнением окружающей среды, с широким использованием синтетических вешеств, применением антибиотиков и других лекарственных средств, изменением характера питания (оксидантный стресс), появлением новых аллергенов и др. (Пыцкий В.И. и соавт., 1999; Паттерсон Рой и соавт., 2000; Хаитов Р.М, 2002; Лусс Л.В., 2002).
В лечении атопических заболеваний применяют широкий набор лекарственных средств патогенетической и симптоматической терапии (Гущин И.С, 1997- 2004; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2003). Однако используемые препараты не всегда являются достаточно эффективными, поэтому поиск веществ с высокой антиаллергической активностью сохраняет свою актуальность и сегодня (Ковалева В.Л., 1998; Чучалин А.Г., 2000-2004; Медуницын Н.В., 2001; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2003; Wesk A.L., 2000).
Известно, что при анафилаксии наряду со специфическими иммунологическими изменениями развивается выраженная тканевая гипоксия (Адо А.Д., 1978; Пыцкий В.И., 1991) и происходят существенные метаболические сдвиги (Йегер Л., 1988; Демидова М.А., 1997; Четвериков Г.Н., 1998; Гущин И.С, 2003). В частности, наблюдаются активация реакций свободнорадикального окисления на фоне понижения активности антиоксидантных систем (Митина Т.В., 1991; Кошелевский В.И., 1997; Ракита Д.Р., 1997; Di Giani, 1996 и др.), изменения уровня мембранных липидов, в том
числе фосфоинозитидов и их метаболитов, биогенных аминов, арахидоновой кислоты и эйкозаноидов (Йегер Л., 1988; Пыцкий В.И., 1991; Гущин И.С., 2003; Ковалева В.Л., Чучалин А.Г., 1997; Gibs et al., 1996).
Эти данные свидетельсвуют о целесообразности включения в комплексную терапию анафилактических расстройств лекарственных средств, корригирующих метаболические нарушения и повышающих устойчивость тканей к гипоксии. Перспективным в этом направлении представляется применение сукцинатсодержащих соединений, обладающих целым рядом свойств (Маевский Е.И., Гришина Б.В., Розенфельд А.С., 2000; Федин А.И., Румянцев С.А., Кузнецов О.Р., 2004), которые могут быть ценны для лечения анафилактических состояний. Известно, что при глубокой гипоксии, развивающейся при анафилаксии, дыхательная цепь митохондрий получает водород в основном от янтарной кислоты, т.к. при ее окислении водород поступает на значительно более близкий к кислороду участок дыхательной цепи (Кондрашова М.Н., Хазанов В.А., 2003). При активации митохондрий в условиях гипоксии, когда быстро развивается дефицит НАД-зависимых субстратов, янтарная кислота осуществляет бесперебойный перенос электронов на 3-й и 4-й комплексы дыхательной цепи, обеспечивая стабильность и адекватность энергетического обмена, при этом окисление янтарной кислоты в митохондриях остается одним из немногих источников АТФ. В состояниях, когда организму требуется резко увеличить энергопродукцию, запускается система окисления янтарной кислоты, которая минует медленные стадии цикла Кребса и позволяет значительно ускорить процессы энергообразования (Васильев С.Ц., Сафронов А.Б., 2000). Кроме того, янтарная кислота снижает концентрацию в крови лактата, пирувата и цитрата, накапливающихся в клетках на ранних стадиях гипоксии (Долженко А.В., Козьминых В.О., Колотова Н.В., Сыропятов Б.Я, 2003). Существуют сведения (Митина Т.В., Бидюк М.Н., Лозицкий И.В. и др., 1991), что применение калия сукцината в периоде сенсибилизации ослабляет тяжесть экспериментальной бронхиальной астмы у морских свинок, оказывает корригирующее влияние на активность ферментов (редуктаз, трансфераз и гидролаз). Вместе с тем ислледование
антигипоксической и антианафилактической активности различных
производных 3-оксипиридина показало наибольшую эффективность
сукцинатсодержаших соединений, среди которых особое положение занимает
мексидол (Германова Э.Л., Чернобаева Г.Н., Романова В.Е., Лукьянова Л.Д.,
1991; Базанов Г.А, 1994; Демидова М.А., 1997; Четвериков Г.Н. , 1999). В
настоящее время янтарную кислоту и ее соли достаточно широко используют
при различных патологических состояниях, сопровождающихся активацией
свободнорадикального окисления и развитием гипоксии, в частности при
ишемической болезни сердца (Бульон В.В., Хныченко Л.К., Сапронов Н.С. ,
2002), острых и хронических нарушениях мозгового кровообращения (Суслина
З.А., Танашян М.М., Смирнова И.Н., 2002; Скоромец А.А., Никитина В.В.,
Голиков К.В., 2002), токсической энцефалопатии (Афанасьев В.В., 2005),
сосудистых заболеваниях сетчатки и зрительного нерва (Голубев С, Коваленко
А., 2003). Однако эффекты сукцинатсодержащих соединений при
аллергических состояниях изучены недостаточно. Считается, что прямое
введение янтарной кислоты в организм в качестве антигипоксического средства
малоэффективно из-за его относительно низкой проницаемости через
гистогематические барьеры, поэтому больший интерес для практической
медицины представляют сукцинатсодержащие соединения. Одним из таких
соединений является дихолина сукцинат, синтезированный в ВИЦ БАВ.
Согласно полученным к настоящему времени данным дихолина сукцинат
(лабораторный шифр КХ-11), относится к классу актопротекторов (Митрохин
М.Н., Соколова О.А. и др., 2001), представители которого способствуют
сохранению или повышению деятельности человека в обычных и осложненных
условиях (дефицит кислорода, высокие и низкие температуры, стрессовые
ситуации) (Смирнов А.В., 1997). Известно, что дихолина сукцинат обладает
широким спектром фармакологической активности, в том числе проявляет
антиоксидантную, стресспротективную, антиамнестическую,
анксиолитическую, мембраномодулирующую и антигипоксическую активность (Митрохин М.Н., Соколова О.А. и др., 2001, 2002; Погорелый В.Е., Макарова Л.М., 2002). Предполагается, что антигипоксическое действие этого соединения
обусловлено входящим в его состав сукцинатом, который в условиях гипоксии, поступая во внутриклеточное пространство, способен окисляться дыхательной цепью. Препарат может повышать резистентность организма при экстремальных и кислород зависимых патологических состояниях (шок, гипоксия, нарушения мозгового кровообращения), предупреждать и уменьшать токсические эффекты алкоголя (Погорелый В.Е., 2001). Кроме того, дихолина сукцинат является источником холина, входящего в состав фосфолипидов клеточных мембран, между тем мембранные фосфолипиды имеют существенное значение для реализации эффектов антигенов. Таким образом, известные фармакологические свойства дихолина сукцината дают основания предполагать о возможности его применения при анафилактических нарушениях.
Работа выполнена по плану научно-исследовательской работы Тверской государственной медицинской академии (ТГМА) в рамках научного направления "Фармакология аллергии". Тема исследования утверждена на заседании ученого совета ТГМА.
Цель работы. Повышение эффективности лечения экспериментальной аллергии с помощью сукцинатсодержащих соединений.
Задачи исследования. Для достижения указанной цели было необходимо решить следующие конкретные задачи:
Исследовать влияние дихолина сукцината, препаратов янтарной кислоты (ремаксол, цитафлавин) и натрия сукцината (реамберин) на течение системной и местной анафилактической реакции в эксперименте на животных.
Оценить влияние дихолина сукцината, ремаксола, цитафлавина и реамберина на развитие анафилаксии in vitro (в тесте прямой реакции дегрануляции базофилильных лейкоцитов крови кроликов).
Исследовать влияние дихолина сукцината, ремаксола, цитафлавина и реамберина на течение аллергической реакции замедленного типа у мышей.
Оценить антигипоксическую активность дихолина сукцината, ремаксола, цитафлавина и реамберина при экспериментальной анафилаксии в
сравнении с натрия оксибутиратом и сукцинатсодержащим производным 3-оксипиридина мексидолом.
Провести сравнительный анализ эффектов дихолина сукцината,
ремаксола, цитафлавина и реамберина при экспериментальной аллергии с действием глюкокортикостероидов (преднизолона и гидрокортизона), кромолин-натрия и сукцинатсодержащего производного 3-оксипиридина мексидола.
Научная новизна работы. Впервые экспериментальным путем на различных моделях анафилаксии (общей, местной, in vitro) показано, что новый оригинальный препарат дихолина сукцинат оказывает умеренное антиаллергическое действие. Причем противоаллергические эффекты этого соединения наиболее выражены в отношении кожных проявлений аллергии как немедленного, так и замедленного типов. Отмечено наличие антианафилактической активности у комбинированных сукцинатсодержащих препаратов (реамберина, ремаксола и цитофлавина) и отсутствие противоаллергического действия у холина хлорида. Впервые обнаружено повышение антигипоксической активности дихолина сукцината и других сукцинатсодержащих соединений при анафилаксии.
Научно-практическая значимость. Результаты работы имеют как теоретическое, так и практическое значение. Показана возможность применения дихолина сукцината и других сукцинатсодержащих соединений (в том числе реамберина) в комплексной, патогенетически обоснованной терапии аллергических заболеваний. Обоснована необходимость применения антигипоксантов при анафилаксии и с этой целью предложено использовать сукцинатсодержащие средства (реамбрин, дихолина сукцинат, 3-оксипиридина сукцинат).
По материалам диссертации сделано 4 рационализаторских предложения.
Положения, выносимые на защиту.
1. Наличие умеренной противоаллергической активности у дихолина сукцината.
2. Угнетение антиген-индуцированной дегрануляции базофилов
дихолина сукцинатом.
3. Повышение антигипоксической активности препаратов янтарной
кислоты (ремаксола и цитофлавина), натрия сукцината (реамберина) и
дихолина сукцината при анафилаксии.
Внедрение. Результаты работы используются в учебном процессе при проведении занятий и лекции по следующим темам: "Противоаллергические средства" на кафедре фармации ТГМА, а также в научных исследованиях, проводимых в НИЦ Тверской государственной медицинской академии.
Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждены на XII международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации», на областных научно-практических конференциях (Тверь, 2003, 2004), на совместном заседании кафедр фармации, экспериментальной и клинической фармакологии, патологической физиологии, иммунологии (Тверь, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
Общие принципы лечения аллергических заболеваний
Фармакотерапия аллергических поражений является одним из основных методов лечения этих заболеваний и включает в себя использование средств профилактической, этиотропной, патогенетической и симптоматической терапии (Гущин И.С., 2003; Балаболкин Н.И., 1996; Хаитов P.M. и соавт., 1997; Хаитов Р.М., 1998; Цой А.Н., 1998; Четвериков Г.Н., 1998; Molinari J.A., 1998). Наиболее эффективным методом лечения аллергических расстройств является этиотропная терапия, заключающаяся в устранении контакта организма с аллергеном, что по очевидным причинам не всегда осуществимо (Гущин И.С., 1993, 1998, 2000; Пыцкий В.И., 1999). Наиболее широко используют лекарственные средства, действующие на определенные стадии аллергического ответа, включая иммунологическую, патохимическую и патофизиологическую (Гущин И.С. 1993; Djuric S. et al., 1997; Terr A. et al., 1997; Cross S. et al., 1998), а также симптоматические средства, устраняющие основные проявления аллергии различных нозологических форм (бронхолитики при бронхиальной астме; средства, повышающие артериальное давление при анафилактическом шоке, вазоконстрикторы при конъюнктивите и рините, и т.д.). В последнее время большое внимание уделяется поиску эффективных противоаллергических препаратов среди иммуномодуляторов, которые способны воздействовать на иммунологическую стадию аллергического процесса, угнетая продукцию аллергических IgE антител (Гущин И.С, 1993; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000, 2003), а также средств корригирующих метаболические нарушения, в том числе обладающих антиоксидантной активностью (Митина Т.В., Бидюк М.Н., Лозицкий И.В., 1991; Базанов Г.А., Смирнов Л.Д., 1995; Гущин И.С, 2003). Современные противоаллергические средства подразделяют на 2 основные подгруппы: препараты, применяемые при гиперчувствительности немедленного типа и средства, используемые при гиперчувствительности замедленного типа. По классификации, предложенной И.С.Гущиным (1998), противоаллергические средства разделены на 5 основных групп: 1. Вещества, позволяющие осуществить фармакологическую коррекцию иммунологической стадии аллергического процесса и являющиеся модуляторами антиген-индуцированных IgE и IgG-ответов.
Действие этих средств направлено на торможение продукции аллергических антител либо на усиление образования блокирующих антител. 2. Средства, которые стабилизируют эффекторные клетки аллергии (базофилы, тучные клетки) и тормозят их функцию, направленную на высвобождение медиаторов аллергии. 3. Соединения, являющиеся антагонистами отдельных медиаторов аллергии, например, антигистаминные, антисеротониновые, антиацетилхолиновые вещества. 4. Вещества, которые корригируют неспецифическую тканевую гиперреактивность, обеспечивающие снижение чувствительности тканей к неспецифическим возбуждающим воздействиям. 5. Поли функциональные соединения, которые способны одновременно действовать на различные звенья аллергического процесса. Существует классификация (Четвериков Г.Н., 1987), которая подразделяет лекарственные средства по механизму их действия: 1. Препараты, действующие на адренорецепторы и систему аденилатциклаза-цАМФ- фосфодиэстераза: ингибиторы фосфодиэстеразы, а- и Р-адренореномиметики, простагландины 2. М-холиноблокаторы 3. Антагонисты медиаторов аллергии: антагонисты СРС-А, простагландинов (ПГ), брадикинина, противогистаминные препараты (изменяющие выделение гистамина, влияющие на обмен гистамина, блокирующие гистаминовые рецепторы) 4. Гормональные препараты и другие биоактивные вещества 5. Донаторы серы, сульфгидрильных групп и другие препараты, влияющие на окислительно-восстановительные процессы 6. Иммуномодуляторы (иммуносупрессоры и иммуностимуляторы) 7. Препараты кальция и антагонисты кальция 8. Препараты разных групп, использующиеся с разными целями в медицинской практике Известна интегрированная классификация противоаллергических препаратов (Редькин Ю.В., 1996): 1. Средства, используемые при гиперчувствительности немедленного типа: 1.1. Средства, препятствующие освобождению гистамина и других БАВ из тучных клеток и базофилов (глюкокортикостероиды, (3-адреномиметики, ксантины, кромогликат натрий, гепарин, М-холиноблокаторы). 1.2. Средства, препятствующие взаимодействию свободного гистамина с тканевыми рецепторами (Ш-гистаминоблокаторы). 1.3. Средства, уменьшающие повреждение тканей (глюкокортикостероиды). 1.4. Средства, уменьшающие общие проявления аллергических реакций типа анафилактического шока (адреномиметики, бронхолитики миотропного действия, глюкокортикостероиды). 2. Средства, применяемые при гиперчувствительности замедленного типа: 2.1. Средства, подавляющие иммуногенез, угнетающие преимущественно клеточный иммунитет (иммунодепрессанты): глюкокортикостероиды, цитостатики, антилимфоцитарная сыворотка, антилимфоцитарный глобулин, человеческий антиаллергический иммуноглобулин, противоревматические средства медленного действия (хингамин, пеницилламин), антибиотики (циклоспорин А). Для клинической практики важным является классификация лекарственным препаратов по возможности их применения при различных нозологических формах и стадиях аллергии. Так, например, существуют различные подходы к фармакотерапии для купирования аллергических проявлений и их предупреждения.
Известно (Четвериков Г.Н., 1972-2003), что отдельные вещества, предназначенные для лечения аллергических заболеваний, в период их обострения могут оказывать проаллергическое действие, либо не влиять на аллергизацию при применении в другие периоды аллергии. У больных аллергией при отсутствии клинических проявлений заболевания (например, при поллинозах) эффективным является применение специфической иммунотерапии, изменяющей продукцию IgE и IgG (Гущин И.С., 1997; Хаитов P.M. и соавт., 1997; Fornadley J., 1998). Концепция традиционной иммунотерапии аллергенами с целью снижения аллергической реактивности и общепринятые показания к ней хорошо известны и заключаются во введении изначально малых доз специфического аллергена, затем следует постепенное повышение доз, приводящее к клинической десенсибилизации. Точные механизмы иммунотерапии аллергенами, благодаря которым достигается улучшение клинического состояния, до сих пор не известны (Мюллер В.Д., Йегер Л., 1999; Бабахин А.А. и соавт., 1999). Ключевым звеном, на уровне которого реализуется лечебный эффект большинства противоаллергических препаратов, по современным представлениям, является система внутриклеточных циклических нуклеотидов - циклические аденозинмонофосфат (цАМФ) и гуанозинмонофосфат (цГМФ). Повышение устойчивости клеток-мишеней к повреждающему действию аллергена и неспецифических факторов может быть достигнуто путем увеличения внутриклеточных запасов цАМФ или уменьшения цГМФ, т.е. при увеличении коэффициента цАМФ/цГМФ (Пыцкий В.И., 1990; Чучалин А.Г., 1997; Минеев В.Н. и соавт., 1999; Кусков М.В. и соавт., 1999; Гущин И.С., 2003). Кроме того, рассматриваются вопросы возможности фармакологической коррекции аллергических нарушений воздействием на фосфоинозитидную систему вторичных мессенджеров (Утешев Б.С., 1995; Демидова М.А., 1997; Kurosava et al., 1989). Наиболее изученной группой противоаллергических средств являются блокаторы Н]-рецепторов гистамина, которые по-прежнему остаются наиболее применяемыми в лекарственной терапии больных аллергией (Гущин И.С., 1993, 1997; Тузлукова Е.Б. и соавт., 2002; Павлова К.С., Курбачева О.М., Ильина Н.И., 2004). Широкое применение препаратов этой группы обосновано важнейшей ролью гистамина в патогенезе основных симптомов аллергических заболеваний.
Оценка антигипоксической активности
Известно (Адо А.Д., 1970, Пыцкий В.И., 1985), что при анафилактическом шоке наблюдается выраженная тканевая гипоксия, которая является одной из причин нарушения функций различных органов, в том числе жизненноважных. Так, в опытах на срезах сердца сесибилизированных кроликов при добавлении антигена было отмечено (Четвериков Г.Н., 1998) выраженное уменьшение поглощения кислорода тканями. Экспериментами Бунглера и Бострома таюке было показано значительное угнетение дыхания тканей сердца во время анафилактического шока. Многочисленные исследования, проведенные на кафедре фармакологии Тверской медицинской академии под руководством проф. Четверикова Г.Н. (в период с 1972 по 1998 гг.) позволили выявить связь между снижением интенсивности дыхания тканей и развитием смертельной формы затяжной фазы анафилактического шока у кроликов. Выше сказанное дает основание для изучения возможности использования в комплексной терапии анафилактических нарушений веществ, ослабляющих воздействие на организм кислородной недостаточности. По данным литературы (Маевский Е.И., Гришина Б.В., Розенфельд А.С., 2000; Федин А.И., Румянцев С.А., Кузнецов О.Р., 2004) янтарная кислота и ее соли проявляют выраженную антигипоксическую активность, это свойство сукцинатсодержащих соединений имеет существенное значение для формирования их интегрального терапевтического эффекта. Особый интерес имеет оценка протективного действия сукцинатсодержащих препаратов в условиях гипоксии при анафилаксии. Защитным эффектом при гипоксии обладает целый ряд фармакологических веществ, эталоном для оценки антигипоксической активности является натрия оксибутират, который эффективен при различных моделях гипоксии (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000). Вместе с тем известно (Демидова М.А., 1997), что натрия оксибутират в экспериментах на животных проявляет выраженную антианафилактическую активность, что явилось основанием для выбора натрия оксибутирата в качестве препарата сравнения при изучении антигипоксической активности сукцинатсодержащих препаратов при анафилаксии. Оценка антигипоксической активности дихолина сукцината и других сукцинатсодержащих соединений проводилась в тесте острой гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме.
Тест рекомендован Фармакологическим комитетом в Методических рекомендациях по оценке антигипоксической активности лекарственных веществ. С этой целью мышей с небольшим разбросом массы тела (20,5±0,3 г) помещали по одиночке в герметически закрываемые банки объемом 150 см и 200 см. Регистрировали ряд физиологических параметров (появление одышки, двигательного возбуждения, судорог), время потери позы и продолжительность жизни животных. Исследование антигипоксической активности сукцинатсодержащих соединений проводили у интактных и сенсибилизированных мышей, а также в период индукции системной анафилаксии. 2.2.3. Оценка острой токсичности лекарственных веществ у сенсибилизированных животных Имеются сведения (Демидова М.А., 1993, 1996; Четвериков Г.Н., 1998; Лазорева Д.Н., 1990), что при сенсибилизации и анафилаксии изменяется чувствительность организма подопытных животных ко многим лекарственным средствам. Описаны результаты экспериментов, показывающие повышение токсичности лекарственных веществ в сенсибилизированном организме. В связи с этим перед исследованием влияния лекарственных соединений на течение аллергических реакций проводили оценку острой токсичности этих веществ у сенсибилизированных животных. Острую токсичность лекарственных средств определяли по методу Прозоровского В.Б. и Прозоровской М.П. (1980) для веществ, характеризующихся небольшим наклоном кривых доза-эффект и обнаруживающих небольшую скорость течения токсического процесса. Для оценки токсичности использовали 4 дозы, логарифмы которых отличались на 0,3. Для оценки острой токсичности сукцинатсодержащих препаратов подопытных мышей предварительно иммунизировали овальбумином. Испытания проводили на 14-й день иммунизации. Исследуемые препараты вводили интактным и сенсибилизированным животным однократно в внутрибрюшинно в дозах 50, 100, 200, 400, 800 и 1600 мг/кг (логарифмы значений этих доз отличались на 0,3). Наблюдения за подопытными мышами осуществляли в течение 14 дней, при этом оценивали состояние животных и учитывали число смертельных исходов в каждой группе в течение всего срока наблюдения.По результатам эксперимента рассчитывали LD5o табличным методом. Опасность соединений устанавливали по ГОСТу 12.1.007-76. Результаты исследования показали, что дихолина сукцинат, реамберин, ремаксол и цитофлавин как для и интактных, так и сенсибилизированных животных являются малотоксичными веществами (по классификации, предложенной К.К.Сидоровым "О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения"), что облегчает дозирование и обеспечивает безопасность применения препаратов в широком диапазоне доз. 2.2.5. Статистические методы исследования Результаты исследования были обработаны статистически с применением стандартного пакета программ «Ms Excel 2000».
Для ряда выборок вычисляли среднюю арифметическую и среднюю квадратическую ошибку. Все данные в диссертации представлены в виде М±т. Для оценки достоверности различий выборок применяли параметрический t-критерий Стьюдента. За достоверное принимали различие при уровне вероятности 95% и более (р 0,05). Все цифровые материалы оформлены в виде таблиц и графиков с помощью прикладного пакета "Microsoft Graph" в программном продукте "Microsoft Office 2000". В главе приводятся сведения, характеризующие влияние метаболических корректоров: препаратов янтарной кислоты (ремаксола и цитофлавина), натрия сукцината (реамберина) и дихолина сукцината на течение системной, местной анафилактической реакции и анафилаксии in vitro, а также на развитие кожной аллергической реакции замедленного типа. Показано, что дихолина сукцинат и другие сукцинатсодержащие препараты (натрия сукцинат и 3-оксипиридина сукцинат) обладают умеренной антианафилактической активностью, тогда как у препаратов янтарной кислоты и холина хлорида подобного действия обнаружено не было. Причем эффекты дихолина сукцината и 3-оксипиридина сукцината были сопоставимы, тогда как натрия сукцинат (в составе реамберина) действовал слабее. Одновременно было показано, что дихолина сукцинат и 3-оксипиридина сукцинат уменьшали выраженность антиген- индуцированной дегрануляции базофильных лейкоцитов крови, уступая в этом отношении препарату сравнения кромолин-натрию. Эффекты сукцинатсодержащих препаратов в отношении антиген-индуцированной дегрануляции базофилов in vivo были выражены сильнее, чем in vitro. Ремаксол и цитофлавин при исследованиях как in vitro, так и in vivo достоверного воздействия на выраженность спонтанной и антиген-индуцированной дегрануляции базофилов не оказывали. Исследования были проведены на белых беспородных мышах обоего пола массой 21Д±0,8 г (п=110), сенсибилизированных овальбумином. Исследования проводили на 21-й день латентного периода сенсибилизации. Системную анафилаксию индуцировали внутрибрюшинным введением антигена (1 мкг овальбумина в 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида).
Исследование влияния метаболических корректоров на развитие кожной аллергической реакции замедленного типа у мышей
Эксперименты поставлены на 23 мышах-самцах линии Balb/c массой 24,3+ 0,4 г. Подопытных животных сенсибилизировали однократно путем внутрикожного введения в основание хвоста 60 мкл эмульсии аллергена (1 мкг овальбумина) в полном адъюванте Фрейда. Адъювант Фрейда использовали для усиления аллергиизации, так как известно, что его введение в организм препятствует формированию Т-супрессоров. На 6-й день иммунизации у подопытных мышей измеряли толщину задней правой лапки с помощью инженерного микрометра, после чего внутрибрюшинно вводили исследуемые соединения. Все животные были разделены на 3 группы: подопытные мыши первой группы (п=6) получали внутрибрюшинно дихолина сукцинат (10 мг/кг); животным второй группы (п=6) внутрибрюшинно вводили холин (10 мг/кг); подопытные мыши третьей группы (п=11) получали изотонический раствор натрия хлорида. Через 30 минут после введения исследуемых соединений у всех подопытных животных индуцировали развитие кожной реакции замедленного типа. С этой целью в подушечку задней лапки сенсибилизированных животных внутрикожно вводили 40 мкл аллергена (овальбумина). Эффект реакции оценивали через 6, 24 и 48 часов. О степени выраженности кожной реакции замедленного типа у мышей судили по величине отека лапки. Величину отека определяли по разнице в толщине лапки до и после внутрикожного введения аллергена, измеряя толщину лапки подопытного животного с помощью инженерного микрометра МК-0-25. Результаты исследования приведены в таблице 3.3. Анализ данных проведенного исследования показал, что дихолина сукцинат уменьшал выраженность кожной аллергической реакции замедленного типа у мышей. Так, было обнаружено, что у мышей группы контроля кожная аллергическая реакция замедленного типа развилась уже через 6 часов после внутрикожного введения антигена, что проявлялось увеличением толщины лапы, в подушечку которой вводили антиген, в среднем на 63% (р 0,001) по сравнению с исходным уровнем. Через 24 часа и 48 часов с момента индукции аллергической реакции замедленного типа отек опытной лапы был выражен в той же степени, что и через 6 часов. В серии опытов с введением дихолина сукцината (10 мг/кг) через 6 часов после внутрикожного ведения антигена в подушечку задней лапы достоверных изменений толщины опытной лапы у подопытных животных отмечено не было.
Через 24 часа после индукции кожной аллергической реакции замедленного типа толщина опытной лапы у мышей увеличилась в среднем на 11% (р=0,07) по сравнению с исходным уровнем и была достоверно (р 0,001) меньше, чем у подопытных мышей группы контроля. Обращает на себя внимание тот факт, что в серии опытов с внутрибрюшинным введением холина хлорида выраженность кожной аллергической реакции замедленного типа у мышей достоверно не отличалась от ее интенсивности у животных контрольной группы. Так, через 6 часов и 24 часа после индукции реакции внутрикожным введением антигена в подушечку правой задней лапы ее толщина у подопытных животных была соответственно на 54% (р 0,001) и 65% (р 0,001) больше, чем до введения антигена. Таким образом, результаты эксперимента, проведенного с использованием различных моделей аллергических реакций немедленного и замедленного типов, показали, что среди исследованных метаболических корректоров (препаратов янтарной кислоты и ее солей) имеются вещества, обладающие противоаллергической активностью. Наиболее перспективным соединением этого ряда является дихолина сукцинат. Наибольший эффект дихолина сукцината выявлен в отношении кожных проявлений аллергической реакции как замедленного типа, так и немедленного типа. В отношении других видов аллергической реакции (системная анафилаксия у мышей, анафилаксия in vitro) эффекты дихолина сукцината были менее выражены. В качестве анализаторов действия дихолина сукцината в работе были использованы препараты холина (хлорид и салицилат) и 3-оксипиридина сукцинат (мексидол). Исследования показали, что у холина хлорида полностью отсутствовали противоаллергические свойства, тогда как сукцинатсодержащее производное 3-оксипиридина (мексидол) проявил выраженную противоаллергическую активность. Полученные данные в отношении противоаллергической активности мексидола соответствовали данным других исследователей (Базанов Г.А., 1994; Демидова М.А., 1997). Эти сведения позволяют предположить, что для реализации противоаллергического эффекта дихолина сукцината имеет существенное значение наличие остатка янтарной кислоты в его структуре. Обращает на себя внимание и тот факт, что противоаллергической активности у комбинированных препаратов, содержащих в своем составе янтарную кислоту (ремаксол и цитофлавин), на использованных моделях аллергических реакций немедленного и замедленного типов обнаружено не было. Предполается, что это связано с низкой биодоступностью янтарной кислоты. Слабые противоаллергические свойства у натрия сукцината (в составе реамберина) были обнаружены на моделях системной и местной анафилаксии. Следует отметить, что в исследованиях in vitro при постановке прямой реакции дегрануляции базофилов натрия сукцинат в отличие от дихолина сукцината активности не проявил. Интересным является и тот момент, что при введении in vivo эффекты дихолина сукцината были выражены сильнее.
Полученные факты свидетельствуют о том, что для мембраномодулирующего эффекта имеет значение наличие в структуре дихолина сукцината не только остатка янтарной кислоты, но и холина, который, как известно, входит в состав фосфолипидов клеточных мембран, между тем мембранные фосфолипиды имеют значение для реализации эффектов антигенов. В главе приводятся данные экспериментальных исследований, подтверждающие тот факт, что препараты янтарной кислоты (ремаксол и цитофлавин) и сукцинатсодержащие соединения натрия сукцинат (в составе реамберина), 3-оксипиридина сукцинат (мексидол) и дихолина сукцинат достоверно увеличивают продолжительность жизни мышей в условиях острой гипоксии с гиперкапнией. Показано, что антигипоксическая активность исследованных метаболических корректоров у сенсибилизированных животных в условиях индукции системной анафилаксии существенно выше, чем у интактных животных. Антигипоксической активности у препаратов холина (хлорида и салицилата) при внутрибрюшинном введении интактным и сенсибилизированным животным в исследованных дозах (10 мг/кг) обнаружено не было. 4.1. Оценка антигипоксической активности метаболических корректоров при острой гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме у интактных мышей. Известно (Кондрашова М.Н., Каминский Ю.Г., Маевский Е.В., 1997; Коваленко А.Л., Белякова Н.В.,2000; Хазанов В.А., 2003; Пикуза О. И., Петрова Г. К., Вахитов X. М., Вахитова Л.Ф., 2004; Маевский Е.И., Гришина Б.В., Розенфельд А.С., 2000; Федин А.И., Румянцев С.А., Кузнецов О.Р., 2004), что янтарная кислота и ее соли проявляют выраженную антигипоксическую активность. Так, по данным литературы натрия сукцинат (200 мг/кг) и дихолина сукцинат (10 мг/кг и 20 мг/кг) при внутрибрюшинном введении достоверно увеличивают продолжительность жизни мышей в условиях острой гипоксии с гиперкапнией. Кроме того, антигипоксическая активность этих соединений была доказана в тесте определения продолжительности биоэлектрической активности миокарда при аноксии после перевязки трахеи у наркотизированных этаминалом натрия мышей (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000; Митрохин Н.М., Соколова О.А., Борисова Л.Н., 2002). Следует отметить, что антигипоксическая активность сукцинатсодержащих соединений имеет существенное значение для формирования их интегрального терапевтического эффекта, в частности позволяет с успехом применять эти соединения при нарушениях мозгового кровообращения, ишемической болезни сердца и т.д.
Оценка антигипоксической активности метеболических корректоров в тесте острой гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме у сенсибилизированных мышей до и во время индукции системной анафилаксии
На следующем этапе экспериментального исследования проводили сравнительную оценку антигипоксической активности метаболических корректоров при их внутрибрюшинном введении сенсибилизированным животным (до и во время индукции системной анафилаксии). Было отмечено, что при введении иммунизированным овальбумином мышам препаратов янтарной кислоты (ремаксола и цитофлавина), натрия сукцината (реамберина) и дихолина сукцината достоверно повышалась устойчивость подопытных животных к острой гипоксии с гиперкапнией. При этом продолжительность жизни сенсибилизированных мышей, получавших метаболические корректоры, была в среднем в 1,2 раза (р 0,05) больше, чем в контроле (табл. 4.4). Анализ экспериментальных данных показал, что достоверных различий в антигипоксической активности ремаксола, цитофлавина, реамберина и дихолина сукцината у сенсибилизированных животных также как и у интактных мышей не отмечается. Мексидол в этих условиях был более эффективен. Так, было показано, что продолжительность жизни подопытных мышей, получавших внутрибрюшинно этот препарат увеличилась в среднем в 1,3 раза (р 0,05) по сравнению с продолжительность жизни сенсибилизированных мышей, получавших изотонический раствор натрия хлорида. Следует отметить, что все исследованные метаболические корректоры в этом отношении действовали слабее натрия оксибутирата (р 0,05), при внутрибрюшинном введении которого в дозе 200 мг/кг индекс продолжительности жизни подопытных животных в условиях острой гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме увеличивался в среднем в 2,1 раза (р 0,01) (табл. 4.5). Наибольший интерес представляла оценка антигипоксической активности метаболических корректоров во время индукции системной анафилаксии, так как известно, что одной из причин нарушений функции различных органов, в том числе и жизненно важных при анафилактическом шоке является выраженная тканевая гипоксия. Было выявлено, что при анафилаксии антигипоксическая активность исследованных препаратов янтарной кислоты и сукцинатсодержащих средств была достоверно выше, чем у интактных животных.
Так, было обнаружено, что дихолина сукцинат увеличивал продолжительность жизни подопытных животных при гипоксии во время индукции системной анафилаксии в среднем в 1,4 раза (р 0,05), препараты янтарной кислоты (ремаксол и цитофлавин) и натрия сукцината (реамберин) в среднем в 1,3 раза (р 0,05) по сравнению с контролем (табл. 4.6). Несколько сильнее действовал мексидол, внутрибрюшинное введение, которого в дозе 100 мг/кг за 20 минут до разрешающей инъекции антигена увеличивало продолжительность жизни подопытных животных в 1,47 раза (р 0,05). Антигипоксической активности у препаратов холина (хлорида и салицилата) обнаружено не было. При введении подопытным животным препарата сравнения натрия оксибутирата индекс продолжительности жизни увеличивался в среднем в 2,1 раза (р 0,05) (табл. 4.7). Несмотря на то, что исследованные метаболические корректоры по выраженности актигипоксического действия существенно уступали препарату сравнения натрия оксибутирату, преимуществами препаратов янтарной кислоты и ее солей является низкая токсичность и отсутствие серьезных побочных эффектов. Существенным недостатком натрия оксибутирата в использовании его в комплексной терапии анафилаксии в качестве антигипоксанта является его нежелательное влияние на центральную нервную систему и повышение токсичности при введении в аллергизированный организм. Таким образом, результаты экспериментальных исследований, проведенных на модели острой гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме, показали существенное усиление антигипоксической активности препаратов янтарной кислоты и сукцинатсодержащих средств во время системной анафилаксии, что позволяет рассматривать исследованные соединения в качестве перспективных средств для включения в комплексную терапию анафилактических нарушений в качестве препаратов, повышающих устойчивость организма к анафилактической гипоксии. В отличие от основного препарата сравнения натрия оксибутирата исследованные метаболические корректоры не токсичны и не вызывают серьезных побочных эффектов. Изменений их токсичности при введении в аллергизированный организм обнаружено не было. Проблема лечения аллергических заболеваний до сих пор является актуальной, так как фармакотерапия этой патологии во многом остается эмпирической и не затрагивает многих аспектов ее патогенеза. Между тем известно, что при аллергии наряду со специфическими иммунологическими изменениями происходят существенные метаболические сдвиги (Иегер Л., 1988; Демидова М.А., 1997; Четвериков Г.Н., 1998; Гущин И.С., 2003). В частности наблюдаются изменения уровня мембранных липидов, биогенных аминов, арахидоновой кислоты и эйкозаноидов, происходит активация реакций свободнорадикального окисления на фоне понижения активности антиоксидантных систем (Йегер Л., 1988; Пыцкий В.И., 1991; Гущин И.С., 2003; Ковалева В.Л., Чучалин А.Г., 1997; Gibs et al., 1996; Митина Т.В., 1991; Кошелевский В.И., 1997; Ракита Д.Р., 1997; Di Giani, 1996 и др.).
Согласно современным представлениям, при аллергии патогенетически обоснованным является фармакологическое воздействие на систему циклических нуклеотидов (изменение соотношения цАМФ/цГМФ в пользу цАМФ) и фосфоинозитидную систему вторичных мессенджеров, применение препаратов, повышающих антиоксидантний потенциал, влияющих на обмен гистамина, мембранных липидов и их метаболитов (в том числе арахидоновой кислоты и эйкозаноидов). Обращает на себя внимание и тот факт, что при анафилактическом шоке в результате снижения артериального давления и нарушения микроциркуляции развивается выраженная тканевая гипоксия, которая является одной из причин нарушения функций различных органов, в том числе жизненноважных (Адо А.Д., 1970; Лопатин А.С., 1983; Пыцкий В.И., 1985 и др.). Кроме того, экспериментально доказано, что при анафилаксии происходит существенное угнетение поглощения кислорода тканями (Четвериков Г.Н., 1972-1998; Bungler, Bostrom, 1960). Многочисленные экспериментальные исследования, проведенные на кафедре фармакологии Тверской медицинской академии под руководством проф. Четверикова Г.Н. (в период с 1972 по 1998 гг.) позволили выявить связь между снижением интенсивности дыхания тканей и гибелью кроликов в затяжной фазе анафилактического шока. Все выше сказанное дает основание для изучения возможности использования в комплексной терапии анафилактических нарушений лекарственных средств, корригирующих метаболические изменения и повышающих устойчивость тканей к гипоксии. Внутри большой группы метаболических корректоров перспективным представляется исследование сукцинатсодержащих соединений, обладающих целым рядом свойств (Маевский Е.И., Гришина Б.В., Розенфельд А.С., 2000; Федин А.И., Румянцев С.А., Кузнецов О.Р., 2004), которые могут быть ценны для лечения аллергических состояний. В первую очередь привлекает наличие у янтарной кислоты и ее производных выраженной антигипоксической активности. Именно от янтарной кислоты дыхательная цепь митохондрий получает водород при глубокой гипоксии, развивающейся при анафилаксии, т.к. при окислении янтарной кислоты водород поступает на значительно более близкий к кислороду участок дыхательной цепи (Кондрашова М.Н., Хазанов В.А., 2003). При активации митохондрий в условиях гипоксии, когда быстро развивается дефицит НАД-зависимых субстратов, янтарная кислота осуществляет бесперебойный перенос электронов в дыхательной цепи, обеспечивая стабильность и адекватность энергетического обмена, при этом окисление янтарной кислоты в митохондриях остается одним из немногих источников АТФ.
![Оценка влияния гриппозной инфекции и иммунизации живой реассортантной гриппозной вакциной на возникновение и течение IgE-опосредованных аллергических реакций организма [Электронный ресурс]](/i/i/4338/184223.png "Оценка влияния гриппозной инфекции и иммунизации живой реассортантной гриппозной вакциной на возникновение и течение IgE-опосредованных аллергических реакций организма [Электронный ресурс] Чиркова Татьяна Викторовна")