Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1 .Современные представления о патогенезе мигрени 14
1.2.Состояние проблемы фармакотерапии больных мигренью 39
ГЛАВА 2.Материалы и методы исследования 59
2.1. Методы оценки мозгового кровообращения 59
2.1.1 . Регистрация изометрического напряжения изолированных сегментов базилярной артерии кролика 60
2.1.2. Регистрация мозгового кровотока с помощью электромагнитного и ультразвукового флоуметров 62
2.1.3. Оценка состояния микроциркуляции с помощью лазерного допплеровского флоуметра 63
2.1.4.Измерение локального мозгового кровотока с помощью методики водородного клиренса 64
2.1.5. Регистрация тонуса сосудов мозга методом раздельной двухсторонней перфузии каротидных и позвоночных артерий 65
2.1.6. Изучение диаметра пиальных артериол в бассейне средней мозговой артерии 66
2.2. Изучение нервной регуляции мозгового кровообращения 67
2.3. Определение напряжения углекислоты в артериальной крови животных 68
2.4. Метод радиолигандного связывания 69
2.5. Методы изучения нейропсихотропных свойств 70
2.5.1. Изучение двигательной активности 70
2.5.2. Методика изучения ориентировочно-исследовательского поведения мышей в «открытом поле» 71
2.5.3. Методика изучения условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) 71
2.5.4. Изучение поведения мышей в условиях модифицированного плавательного теста по Porsolt 72
2.5.5. Методы изучения антигипоксических свойств 72
2.5.6. Методика изучения поведения крыс в условиях конфликтной ситуации с питьевой депривацией 73 2.6. Методы изучения анальгетической активности 73
2.6.1. Изучение болевого порога у мышей с помощью теста tail flick- отдергивание хвоста 73
2.6.2. Изучение болевого порога у мышей с помощью теста - hot plate -горячая пластинка 74
2.6.3. Изучение болевого порога у крыс при электрической стимуляции хвоста животного 74
ГЛАВА 3. Влияние серотонина на мозговое кровообращение 75
3.1.Моделирование спазмов сосудов мозга с помощью серотонина 75
3.2. Влияние серотонина на вазомоторные и сомато- симпатические рефлексы 84
3.3. Неодинаковая чувствительность артериальных систем мозга к серотонину 86
3.4.Влияние серотонина на микроциркуляцию интактного и ишемизированного мозга 88
3.5 .Влияние серотонина на диаметр пиальных артериол 93
ГЛАВА 4. Изучение цереброваскулярных антисеротониновых свойств противомигреневых препаратов 96
4.1. Метисергид 96
4.2. Дигидроэрготамин 100
4.3. Ницерголин 103
4.4. Пропранолол 110
4.5.Толфенамовая кислота 112
ГЛАВА 5. Скрининг антагонистов серотонина среди производных сложных эфиров оксима тропинона 116
ГЛАВА 6. Антисеротониновые и цереброваскулярные эффекты тропоксина в сравнении с другими противомигреневыми препаратами 121
6.1. Изучение антисеротониновых свойств тропоксина 121
6.2. Цереброваскулярные эффекты тропоксина 130
6.3. Изучение влияния тропоксина на частоту сердечных сокращений и дыхание у наркотизированных кошек 133
ГЛАВА 7. Изучение нейромедиаторных механизмов действия тропоксина 134
7.1. Кетансерин 134
7.2.Трописетрон 135
7.3 .Нейрохимический анализ антисеротонинового действия тропоксина 138
7.4.Изучение адреноблокирующих и антигистаминных свойств тропоксина 139
7.3.Влияние тропоксина на реакцию артериального давления, вызванную ацетилхолином 140
ГЛАВА 8. Неиропсихотропные свойства тропоксина
ГЛАВА 9. Изучение фармакокинетики и безопасности тропоксина 155
Заключение 177
Выводы 192
Список литературы
- Регистрация изометрического напряжения изолированных сегментов базилярной артерии кролика
- Влияние серотонина на вазомоторные и сомато- симпатические рефлексы
- Дигидроэрготамин
- Цереброваскулярные эффекты тропоксина
Введение к работе
Актуальность темы. Мигрень является одним из наиболее распространенных и социально значимых заболеваний среди населения. Согласно данным, представленным на 7-м Международном конгрессе по головным болям, в развитых странах Европы и Америки мигренью страдает от 3 до 16% населения, а по некоторым данным и до 30%. Среди женщин мигренью болеют 18% , среди мужчин - 6% и среди детей - 4 % (Silberstein S.D. et al., 1998; Яхно H.H. и соавт., 2001; Черняк З.В. и соавт, 2003). У женщин приступы мигренью возникают в 2 -3 раза чаще, чем у мужчин (Вейн А.М.и соавт., 1995; Rasmussen В.К., 1994; Stewart W.F. et al., 1994; Амелин А.В. и соавт., 2001). Наиболее часто мигренью болеют лица трудоспособного возраста - 35-40 лет. Эпидемиологические исследования последних лет выявили тенденцию к увеличению числа больных мигренью (Stewart W.F. et al., 1994; Амелин А.В. и соавт., 2001 Яхно Н.Н. и соавт., 2001; Яхно Н.Н., Штульман Д.Р., 2003).
Многочисленные клинические и молекулярно-биологические исследования свидетельствуют о важной роли генетического фактора в возникновении мигрени (Вейн A.M. и соавт., 1995; Амелин А.В. и соавт., 2001). Мигрень считают заболеванием, обусловленным наследственно детерминированной дисфункцией вазомоторной регуляции, проявляющейся пароксизмальными приступами головной боли пульсирующего характера чаще в одной половине головы (Алексеев В.В., Яхно Н.Н., 1997). Несмотря на значительный прогресс в изучении патогенеза приступа мигрени, многие аспекты этой проблемы остаются невыясненными (Pietrobon D., Stressing J. 2003). В настоящее время очевидно, что одну из существенных ролей в генезе этого заболевания играет нейромедиатор - серотонин. Важно отметить, что
серотонин, с одной стороны, оказывает выраженное влияние на
мозговые сосуды, с другой - участвует в проведении болевых импульсов
(Прусинский А., 1979). В литературе широко обсуждаются гипотезы
формирования приступа мигрени. Так, в середине прошлого столетия
Wolff H.G. и сотрудники (1963) предложили сосудистую гипотезу
развития приступа мигрени, которая не потеряла актуальность и в
настоящее время. Согласно этой гипотезе приступ мигрени
сопровождается повышением тонуса мозговых сосудов с последующим
их расслаблением. Далее Olesen J. В. и соавторы (1981) предложили
нейрогенную гипотезу, основанную на обнаруженной ими корреляции
изменений мозгового кровообращения с распространяющейся
кортикальной депрессией Leao. В последние годы широко обсуждается
значение тройничного нерва в механизмах формирования головной боли
при мигрени. Эта гипотеза, получившая название
тригеминоваскулярной, предложена Moskowitz М.А. (1984), согласно которой система тройничного нерва является ответственной за взаимодействие между центральной нервной системой и сосудами головного мозга во время приступа мигрени. Следует подчеркнуть, что, несмотря на различия в представлениях формирования приступа мигрени, представители всех гипотез признают, что серотонин и цереброваскулярный компонент являются существенными факторами в этом процессе. Открытым остается вопрос о первичности или вторичности реакции сосудов мозга, наблюдаемой во время приступа мигрени.
Для лечения больных мигренью используются лекарственные препараты, относящиеся к различным группам фармакологических веществ: адреноблокаторы, антидепрессанты, блокаторы кальциевых каналов, противосудорожные, ненаркотические анальгетики и другие. Среди них особое место занимают препараты, воздействующие на
серотониновые рецепторы - агонисты 5HTib/id~ и антагонисты 5НТ2-рецепторов. Имеющиеся в наличии у клиницистов лекарственные средства для лечения мигрени не всегда отличаются достаточной эффективностью и обладают выраженными нежелательными побочными свойствами. Поэтому поиск новых препаратов для профилактики и лечения приступа мигрени является одной из наиболее актуальных задач современной фармакологии и медицины.
В соответствии с современными представлениями о патогенезе приступа мигрени необходимо совершенствовать методологию поиска новых средств для лечения этого заболевания. При этом следует учитывать как факторы, определяющие генез приступа мигрени, так и располагать сведениями о механизме действия известных препаратов, применяемых для лечения этого заболевания.
В соответствии с важной ролью цереброваскулярного компонента и серотонина в генезе приступа мигрени при поиске новых противомигреневых препаратов необходимо, чтобы вещество проявляло антисеротониновую активность по отношению к церебральным сосудам.
При выборе химического ряда наше внимание привлекли производные тропана, к которым относятся обладающий антисеротониновой активностью а - адреноблокатор - тропафен (Машковский М.Д., Шварц Г.Я., 1979) и антагонист 5НТ3 типа рецепторов - трописетрон (Richardson В.Р. et al., 1985).
Цель исследования: разработка методологии поиска противомигреневых препаратов с учетом основных патогенетических факторов развития приступа мигрени, изыскание нового препарата с антисеротониновой цереброваскулярной активностью среди производных тропана, изучение механизма его действия и проведение расширенных доклинических испытаний.
Задачи исследования:
провести систематическое изучение влияния серотонина на тонус сосудов различных артериальных систем мозга, состояние микроциркуляции в коре головного мозга и разработать модель серотонинового спазма церебральных сосудов;
изучить роль серотонина в реализации цереброваскулярных эффектов известных противомигреневых препаратов: метисергида, дигидроэрготамина, ницерголина, пропранолола, толфенамовой кислоты;
провести скрининг среди производных тропана (в опытах in vitro, in vivo) с целью выявления соединения с наиболее выраженной антисеротониновой цереброваскулярной активностью и наименьшей токсичностью и сопоставить его эффекты с эталонными препаратами;
провести анализ антисеротонинового эффекта нового соединения для определения типа серотониновых рецепторов-мишеней с использованием метода радиолигандного связывания;
провести нейромедиаторный анализ механизма действия наиболее активного соединения;
изучить влияние наиболее активного соединения на центральные и периферические механизмы регуляции сосудистого тонуса;
изучить нейротропные свойства наиболее активного соединения с использованием комплекса общепризнанных методик;
определить анальгетическую активность нового соединения;
изучить фармакокинетику и хроническую токсичность нового противомигреневого препарата.
Научная новизна работы. Разработана методология поиска новых противомигреневых препаратов на основе современных представлений о существенной роли серотонина и цереброваскулярного компонента в патогенезе приступа мигрени.
Установлена существенная роль серотонина в реализации констрикторных реакций сосудов каротиднои артериальной системы мозга по сравнению с вертебробазилярной системой. Показано, что в условиях ишемического поражения мозга реакция микрососудов мозга на серотонин возрастает.
Систематическое изучение механизма действия
противомигреневых препаратов позволило установить
антисеротониновую цереброваскулярную активность у ницерголина, пропранолола и толфенамовой кислоты.
Скрининг среди производных оксима тропинона выявил новое оригинальное соединение, получившее название тропоксин, обладающее выраженной антисеротониновой цереброваскулярной активностью и низкой токсичностью.
Тропоксин блокирует реакции сосудов мозга на серотонин как у интактных животных, так и в условиях локальной перманентной ишемии мозга. По силе антисеротониновой активности тропоксин превосходит метисергид, ницерголин, пропранолол, толфенамовую кислоту и не уступает дигидроэрготамину.
С использованием методики радиолигандного связывания выявлена способность тропоксина блокировать 5НТ2 - рецепторы коры головного мозга. Тропоксин не влияет на адрено- холино- и гистаминергические рецепторы.
Тропоксин обладает умеренно выраженным стимулирующим действием и не проявляет анальгетическую активность.
Установлено, что тропоксин преодолевает гемато-энцефалический барьер и в течение полутора часов уровень концентрации препарата в ткани мозга выше, чем в крови.
Тропоксин по данным изучения шестимесячной «хронической» токсичности не оказывает отрицательного влияния на строение внутренних органов, не вызывает изменений электрокардиограммы, поведенческих реакций, гематологических и клинико-биохимических параметров крови и мочи. Он не обладает местноанестезирующим, иммунотоксическим, тератогенным, мутагенным действием.
Научно-практическое значение работы. Предложенная методология скрининга противомигреневых препаратов, проведенный анализ роли серотонина в регуляции тонуса мозговых сосудов и в механизме действия известных средств для лечения мигрени, создают основу для направленного поиска потенциальных препаратов для лечения больных мигренью.
Научные положения, разработанные в настоящем исследовании, явились основой для составления изданных Фармакологическим государственным комитетом РФ «Методических указаний по экспериментальному изучению препаратов для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени», которые вошли в «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» 2000 года.
Выявленное впервые среди производных тропана новое соединение с выраженной цереброваскулярной антсеротониновой активностью (патент РФ №1832683, 1994) позволяет считать целесообразным поиск потенциальных противомигреневых препаратов в указанном ряду химических соединений.
Полученные в результате настоящего исследования данные составили основу представленных в Фармакологический государственный комитет МЗ РФ материалов доклинического изучения препарата тропоксин, на который получено разрешение на проведение клинических испытаний препарата в качестве средства для лечения мигрени.
Результаты проведенного экспериментального изучения препарата тропоксин получили клиническое подтверждение на кафедре неврологии и нейрохирургии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. И.П.Павлова, где выявлена высокая эффективность тропоксина при межприступном лечении частых тяжелых приступов мигрени.
Регистрация изометрического напряжения изолированных сегментов базилярной артерии кролика
Для измерения сократительной способности сосудов регистрировали изометрическое напряжение кольцевых сегментов сосудов (Hogestatt E.D.et al.,1981; Hongok К. et al. ,1988; Vinall P.E., Simeone F.A., 1988).
В работе эксперименты проводили на сегментах основной артерии головного мозга самцов-кроликов весом два-три килограмма. Животных умерщвляли введением в ушную артерию воздуха, декапитировали, выделяли головной мозг, который помещали в холодный раствор Кребса-Хенселяйта (состав см. ниже). Выделение базилярной артерии проводили под операционным микроскопом.
Кольцевые сегменты основной артерии (3-5 мм шириной) укрепляли между двумя нихромовыми держателями и помещали в ванночки, объемом 10 мл с раствором Кребса-Хенселяйта. В ванночках поддерживалась термостатически температура (37 С) и рН на уровне 7.3 - 7.4 посредством насыщения карбогеном. Состав раствора (в мМ/л): NaCl - 118; КС1 - 4.7; КН2Р04- 1.18; MgS04 - 1.16; NaHC03 -5.36; СаС12-2.52; ЭДТА—натривая соль — 0.025; глюкоза -11.0; пируват натрия — 2.0 (Vedernikov Y.P. et al., 1989).
Пассивная (оптимальная) нагрузка напряжения на сегменты базилярной артерии составляла 300мг. Изменения изометрического напряжения сегментов регистрировали преобразователем UC-2 на димографе R-7U (Бекман, США). После стабилизации пассивного напряжения проводили 2-3 контрольные реакции на гиперкалиевый раствор (60 мМ) с целью стабилизации сократительного ответа.
Эксперименты проводили на сегментах с неповрежденным эндотелием. Наличие эндотелия проверяли при помощи реакции сегментов на ацетилхолин (10"6 М). Эксперименты проводились по схемам:
1. влияние исследуемого препарата (соединения) на напряжение, вызванное предварительно введенным норадреналином (Зх10"5М), с последующим введением кумулятивно возрастающих концентраций препарата (соединения) (10"9- 10"4 М);
2. влияние исследуемого препарата (соединения) на дозозависимую реакцию изолированных сегментов основной артерии на норадреналин (Ю -КИМ);
3. влияние исследуемого препарата (соединения) на напряжение, вызванное предварительно введенным серотонином (10 6М), с последующим введением суммарно возрастающих концентраций препарата (соединения) (10"9 — 10"4 М); 4. влияние исследуемого препарата (соединения) на дозозависимую реакцию изолированных сегментов базилярной артерии на серотонин (10"9- КҐ М).
Мозговой кровоток регистрировали с помощью электромагнитных измерителей фирмы Нихон - Коден (Япония), РКЭ-2-БИ, ультразвукового флоуметра фирмы "Transonic System Іпс."(США). Использовали датчики с диаметром просвета 1.0; 1,5 или 2.0 мм, которые устанавливали на общей сонной артерии. При этом у наркотизированных кошек перевязывали все артерии, питающие кровью экстракраниальные ткани головы, а именно, каудальную и краниальную артерии, мышечные ветви, затылочную артерию, язычную артерию, наружную челюстную, большую ушную, поверхностную височную и зубную артерии.
Принцип действия ультразвукового флоуметра заключается в измерении времени прохождения ультразвука в движущейся среде для определения скорости потока крови от 0,05 мл/мин до 200 мл/мин. Датчик для измерения объемного расхода жидкости состоит из контактной измерительной головки, содержащей приемный и излучающий пьезопреобразователи, размещенные с одной стороны сосуда и акустического отражателя, закрепленного с противоположной стороны на одинаковом расстоянии от обоих преобразователей. Электронная схема прибора управляет датчиком в прямом и обратном режиме. Ультразвуковая волна проходит сквозь сосуд, отражается от акустического экрана, снова проходит через сосуд и принимается приемным пьезопреобразователем, который преобразовывает полученные акустические вибрации в электрические сигналы. Расходомер анализирует принятый сигнал и регистрирует точно измеренное время прохождения акустической волны от излучающего до приемного преобразователя. Это прямой цикл. При обратном цикле последовательность передачи-приема сигнала предыдущего цикла повторяется, но функции излучающего и приемного преобразователей меняются местами. Прибор регистрирует точное время прохождения ультразвуковой волны в противоположном направлении после пересечения жидкости. Разница между временем прямого и обратного прохождения, измеренная прибором, пропорциональна потоку жидкости в части сосуда, расположенной под пьезопреобразователями. Полученный результат масштабируется в соответствии со значением предела измерений по шкале прибора для датчика и выводится на дисплей как абсолютный объемный расход потока через датчик в мл/мин (Рябцева Е.Н , 1998). Параллельно с регистрацией мозгового кровотока в бедренной артерии регистрировали артериальное давление и электрокардиограмму во втором стандартном отведении.
Влияние серотонина на вазомоторные и сомато- симпатические рефлексы
Было изучено влияние серотонина на биоэлектрическую активность в симпатических нервах и прессорный вазомоторный рефлекс, т. е. на адренергические механизмы регуляции кровообращения. В опытах с изучением влияния серотонина при внутривенном введении в дозе 20 мкг/ кг на тоническую активность в симпатических нервах была выявлена его способность оказывать депримирующее влияние на биоэлектрические процессы. В большинстве экспериментов под влиянием серотонина отмечается угнетение тонической активности, которое развивается сразу же после введения серотонина и продолжается в течение 3-5 минут (рис.2).
Депримирующее влияние серотонина на биоэлектрическую активность в симпатических нервах выражено в большей степени при введении моноамина в боковой желудочек мозга. Под влиянием серотонина в дозах 20 мкг/ кг, 0,5 и 1 мг/кг при введении в боковой желудочек мозга отмечается нарастающее угнетение как тонической активности, так и рефлекторных ответов в симпатических нервах почки.
Угнетающий эффект серотонина начинает развиваться на 3-20 минутах после введения вещества и продолжается до конца экспериментов (60-90 минут). В этих же опытах наблюдается выраженное угнетение прессорного вазомоторного рефлекса. Депримирующий эффект серотонина при введении в дозе 20 мкг/кг в боковой желудочек мозга составил 57,0 ± 7,2% . При увеличении дозы серотонина до 1 мг/кг этот эффект увеличивался до 79,0 ± 4,8% (рис.7). Полученные данные указывают на способность серотонина взаимодействовать с центральными норадренергическими структурами и оказывать депримирующее влияние на соматосимпатические и вазомоторные рефлексы. Наши данные согласуются с результатами других исследователей, которые показали, что серотонин при введении в боковой желудочек мозга или в структуры шва вентро-медиального сетчатого образования продолговатого мозга уменьшает интенсивность вазомоторных рефлексов, тонической и рефлекторной активности в нижнем сердечном нерве, вызванных стимуляцией афферентных волокон С-типа (Закусов В.В., Каверина Н.В., 1967; Розанов Ю.Б., 1968; Бутузов В.Г., 1970).
В отдельной серии опытов исследовали влияние серотонина на тонус сосудов в системах каротидных и вертебробазилярных артерий. Эксперименты с использованием методики раздельной двухсторонней перфузии каротидных и вертебробазилярных артерий позволили выявить неодинаковую чувствительность артериальных систем мозга в опытах in vivo. Оказалось, что серотонин в дозе 20 мкг/кг при внутривенном введении в значительно большей степени повышает тонус в каротидной артериальной системе на 37,0 ± 10,0%, тогда как в вертебробазилярной системе увеличение сопротивления сосудов значительно меньше (10,0 ± 3,1%). Разница статистически значима при р 0,05 (рис.8). Полученные нами данные не согласуются с результатами Young и соавт. (1986), свидетельствующими о более высокой чувствительности изолированной базилярной артерии по сравнению со средней мозговой артерией у кошек. Выявленное различие, по-видимому, обусловлено неодинаковыми условиями экспериментов in vitro и in vivo.
Полученные нами данные о более высокой чувствительности каротидной артериальной системы к серотонину согласуются с наблюдениями Р. С. Мирзояна (1976), свидетельствующими о неодинаковой чувствительности артериальных систем мозга к норадреналину. Норадреналин повышает тонус сосудов в бассейне каротидных артерий на 35,0 ± 5,2%, тогда как повышение перфузионного давления в вертебробазилярной системе составляет 20,0 ± 3,2% (разница статистически значима при р 0,05).
Следовательно, оба нейромедиатора - серотонин и норадреналин оказывают более выраженное влияние на сосуды каротидного бассейна. Вопрос о механизме, лежащем в основе этого явления, остается открытым и является предметом дальнейших исследований. Эти данные следует учитывать как при обсуждении патогенеза мигрени, так и при поиске противомигреневых и цереброваскулярных средств.
Согласно литературным данным, некоторые антагонисты серотонина проявляют нейропротекторный эффект в условиях глобальной ишемии мозга. Так Fujikura Н. и соавторы (1994) показали, что у песчанок нафтидрофурил и кетансерин - антагонисты 5НТ2-рецепторов устраняют нейрональное поражение после глобальной ишемии мозга, вследствие улучшения мозгового кровоснабжения. Nakayama Н. И соавторы (1988) и Morikawa Е. и соавторы (1991), изучая ( Б)-эмопомил - 5НТ2-антагонист и блокатор кальциевых каналов на модели локальной ишемии мозга обнаружили, что он проявляет выраженную нейропротекторную активность в этих условиях.
В условиях локальной ишемии мозга многими авторами изучены эффекты не только антагонистов, но и агонистов серотониновых рецепторов. Так, Prehn J.H.M. и соавторы (1991) считают, что агонисты 5НТіл-рецепторов эффективно защищают мозг как при локальной, так и при глобальной ишемии. Этими же авторами показано, что уранидил и новый агонист 5НТІА -рецепторов - СМ 57493 на модели окклюзии средней мозговой артерии приводят к уменьшению объема инфаркта, а через 7 дней после лечения этими препаратами ослабляются и нейрональные нарушения в секторе СА1 гиппокампа при переднемозговой ишемии. Авторы полагают, что агонисты 5HTiA-рецепторов подавляют нейрональную активность гиппокампа и коры, вследствие угнетающего действия на нейроны указанных зон мозга. Приведенные данные не оставляют сомнений в важности серотонинергической системы в развитии ишемических поражений и возможной их коррекции с помощью средств, воздействующих на эту систему.
Дигидроэрготамин
Одновременно отмечалось понижение уровня артериального давления в среднем на 31,0 ±4,6% (рис. 12). Метисергид оказывал выраженное депримирующее влияние на нервную регуляцию артериального давления. Под его воздействием наблюдалось угнетение прессорного вазомоторного рефлекса в среднем на 62,0±9,8%. Максимальное угнетение отмечалось на 15-30 минуте эксперимента, затем в большинстве опытов через 40-60 минут после введения препарата имело место восстановление указанного рефлекса.
Анализ нейрограмм показал, что метисергид в большинстве экспериментов (4 из 5) вызывал небольшое угнетение биоэлектрической активности в симпатических нервах, которое начинало развиваться на 2-15 минуте после введения препарата и наблюдалось до конца эксперимента (30-60 минут). Одновременно в трех экспериментах отмечено небольшое угнетение рефлекторных разрядов в симпатических нервах (рис.13).
Учитывая данные о применении дигидроэрготамина в лечении мигрени представлялось, важным провести сравнительное изучение антисеротониновой и антиадренергической активности препарата. В литературе имеются сообщения о том, что дигидроэрготамин наряду с альфа-адреноблокирующими свойствами обладает и антисеротониновыми.
Исследование было начато с изучения влияния препарата на констрикторные реакции изолированных сегментов базилярной артерии кролика, вызванные норадреналином и серотонином. Результаты экспериментов показали, что препарат снимает напряжение мозговых
Сверху вниз: отметка времени, ЭКГ во II стандартном отведении, биоэлектрическая и рефлекторная .активность в симпатическом нерве почки, артериальное давление в бедренной артерии, кровоток в каротидной артерии, параметры стимуляции большеберцового нерва. В верхней части рисунка - контрольные изменения. В нижней - через 20 минут после введения метисергида. сосудов, вызванное норадреналином: ЕД50 дигидроэрготамина на фоне норадреналина равно 2,7 ±0,5x10"8М, а также снижает тонус сосудов мозга, повышенный серотонином: ЕД50 дигидроэрготамина на фоне серотонина равно 8,9 ±0,66x10"7М.
Таким образом, проведенные опыты показали, что дигидроэрготамин наряду с антиадренергической цереброваскулярной активностью обладает также и антисеротониновыми свойствами, при этом альфа-блокирующие свойства дигидроэрготамина выражены в большей степени, чем антисеротониновые..
Далее было показано, что препарат не только ослабляет констрикторные реакции сосудов мозга, вызванные как норадреналином, так и серотонином, но может их и предупреждать. В следующей серии экспериментов было изучено влияние дигидроэрготамина при предварительном введении его на констрикторные реакции сосудов мозга, вызванные норадреналином и серотонином. В этой серии экспериментов была выбрана концентрация дигидроэрготамина 5х10 9М, при которой препарат практически в одинаковой степени ослаблял тонус сегментов основной артерии кроликов, предварительно введенными, как норадреналином, так и серотонином. Оказалось, что на фоне действия дигидроэрготамина дозо-зависимые (Ю М-Ю М) констрикторные реакции мозговых сосудов, вызванные норадреналином, не развиваются. Эксперименты показали, что дигидроэрготамин (10"8М) полностью блокирует дозо-зависимые реакции изолированных сегментов базилярной артерии кролика, вызванные серотонином. Таким образом, проведенное исследование показало, что дигидроэрготамин способен устранять и предупреждать констрикторные реакции церебральных сосудов, вызванные как норадреналином, так и серотонином.
Опыты, проведенные in vivo, также показали, что дигидроэрготамин в дозе 1 мг/кг при внутривенном введении в значительной степени ослабляет уменьшение мозгового кровотока, наблюдаемое под влиянием серотонина. Полученные данные согласуются с данными Машковского М.Д. и Ланского В.П. (1968), которые в опытах на кошках обнаружили способность дигидроэрготамина предупреждать или ослаблять повышение тонуса сонной артерии, вызванное серотонином.
Ницерголин является производным эрголина - 10-метокси-1,6 диметил-эрголин-8-альфа-метанол-5-бромо-3-пиридин карбоксилат (сермион). Установлено, что ницерголин обладает альфа-адреноблокирующей активностью (Heitz Ch. et al., 1986). Это выявлено как в экспериментах in vivo, так и in vitro с использованием различных лигандов (Huchet A.M. et al., 1981; Caillard C.G. et al.,1981; Huguet F. et al., 1980).
Антиадренергические свойства ницерголина изучались на изолированных сегментах базилярной артерии кролика. Результаты экспериментов показали, что препарат снимает напряжение мозговых сосудов, вызванное норадреналином: ЕД50 ницерголина на фоне норадреналина=4,25±0,32х10"6М. Препарат уменьшает дозозависимые реакции изолированных сегментов базилярной артерии кролика на норадреналин по сравнению с контролем. Так ЕД норадреналина = 1,01±0,74х10 7М, а ЕД5онорадреналина на фоне ницерголина = 5,82±0,82х10"5М. Если антиадренергические свойства ницерголина известны, об антисеротониновых цереброваскулярных эффектах данных мы не обнаружили. Поэтому было изучено влияние ницерголина на констрикторные реакции изолированных сегментов базилярной артерии, вызванные серотонином.
Цереброваскулярные эффекты тропоксина
Фармакокинетические исследования проводились на двух видах животных: на беспородных крысах-самцах массой тела 240-250г и кошках весом 4-4,5кг. Животные содержались в стандартных клетках при 12-часовом режиме освещения и были лишены доступа к корму.
Фармакокинетику тропоксина изучали в течение 4-х часов после однократного введения препарата животным в дозе 10 мг/кг внутривенно или внутрибрюшинно и при введении в желудок в дозе 20 мг/кг. После введения препарата кровь в объеме 2 мл отбирали из хвостовой вены крысы или из яремной вены у кошек через дискретные интервалы времени (15 мин; 30 мин; 45мин; 1час; 1,5 часа и 2 часа).
Пробы крови центрифугировали в течение Юмин при g = 3500 об/мин и отбирали по 0,5 мл плазмы. До анализа пробы хранили при температуре минус 18С.
Для изучения процессов распределения препарата по органам и тканям в опытах на мелких животных была разработана методика количественного определения тропоксина с использованием твердофазного иммуноферментного анализа. Определение тропоксина в биологических образцах
Количественное определение тропоксина осуществлялось с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием кроличьих антител. В качестве твердофазного антигена был взят коньюгат сывороточного альбумина с а-аминотропаном.
Специально полученные антитела позволяют с высокой степенью селективности распознавать в биопробах химические соединения, имеющие в своей молекуле а-аминотропановую часть тропоксина.
Для анализа отбирали 100 мкл плазмы, разведенной в 100 раз фосфатносолевым буферным раствором с рН 7,4, содержащим 0,05% твина-20 и 18% сывороточного бычьего альбумина. Степень взаимодействия антител с тропоксином в твердой фазе оценивали при помощи коньюгата антивидовых антител с пероксидазой хрена. Субстрактная смесь представлена раствором о-фенилендиамина в цитратно-фосфатном буфере с рН 5, содержащим 0,015 % перекиси водорода. Чувствительность метода позволяет определить в биологическом материале тропоксин и его метаболиты, содержащие тропановую структуру, в концентрации от 10 нг/мл.
Калибровочная кривая была построена при измерении оптической плотности известного количества тропоксина (в диапазоне от 10 нг до 200 нг /мл тропоксина) в плазме крови крыс (таб.31).
Построенный калибровочный график (рис. 30) представляет кривую зависимости оптической плотности от концентрации тропоксина в диапазоне от 10 до 200 нг/мл.
Для более точного определения уровня концентрации тропоксина и его метаболитов, рассчитанных как эквивалент к тропоксину в биологическом материале его разбавляли физиологическим раствором для возможности попадания в линейный диапазон концентраций от 5 до 100 нг/мл.
Анализ фармакокинетических данных Анализ экспериментальных данных проводили с использованием пакета программ COMSTAT, статистический анализ производился пакетом программ EXCEL, при этом рассчитывались следующие фармакокинетические параметры: AUCo-7 (нг/ч/мл)- площадь под фармакокинетической кривой от 0 до 7 часов;
Были получены данные по распределению тропоксина по органам и тканям и экскреции тропоксина с мочой после однократного введения внутрибрюшинно крысам; даггые по фармакокинетике тропоксина после введения внутривенно и в желудок в опытах на кошках. Распределение тропоксина по органам и тканям у крыс
Препарат вводили крысам внутрибрюшинно, в определенные временные интервалы животных декапитировали, отбирали кровь. Выбор ткани органов осуществлялся с учетом степени их васкуляризации. В качестве сильно васкуляризированной ткани были взяты селезенка, легкое. Кроме того, проведено исследование препарата по распределению его по органам, обеспечивающим его элиминацию: печень, почки и в зоне потенциального действия - мозг. Весь орган или ткань взвешивали, гомогенизировали в физиологическом растворе в соотношении 1:4. Гомогенат использовали для анализа. Подготовка крови для количественного определения проводилась следующим образом: кровь центрифугировали при g = 3000 об/мин., отбирали плазму, которую использовали для количественного анализа.
В нулевой точке (перед введением препарата) исследование проб крови у всех животных не выявило присутствия в сыворотке тропоксина. В последующие сроки наблюдения в пробах крови и органов было обнаружено достаточное для анализа количество препарата.
![Поиск новых потенциальных противотромботических средств на экспериментальных моделях с метаболическими нарушениями [Электронный ресурс]](/i/i/4309/204252.png "Поиск новых потенциальных противотромботических средств на экспериментальных моделях с метаболическими нарушениями [Электронный ресурс] Бочарникова Наталья Владимировна")
