Содержание к диссертации
Введение
I. Литературный обзор 12
Методы исследования 105
II. 1. Объект исследования 105
П.2. Синтез пептидов 105
П.З. Методы исследования терморегуляторной активности 105
11,3.1. Стационарное температурное воздействие 106
И.3.2. Нестационарное температурное воздействие 107
IL4. Ход эксперимента 108
И.5. Определение уровня потребления кислорода 110
11.6. Метод поведенческой терморегуляции "термопреферендум" 110
11.7. Инъекция пептидов 111
11.8. Статистическая обработка экспериментов 111
III. Результаты исследований 113
Поиск средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза на основе изучения структурно-функциональных отношений в ряду эндогенного опиоидного пептида 113
III. 1.1. Влияние дерморфина на систему терморегуляции 115
111.1.1.1. Терморегуляторная активность дерморфина 115
111.1.1.2. Механизм терморегуляторной активности дерморфина 123
1.1.3. Терморегуляторная активность дерморфина при интраназалыюм введении 129
III. 1.1.4. Влияние дерморфина на уровень метаболизма 130
III.1.2. Влияние структурных изменений в молекуле дерморфина на
функциональное состояние системы терморегуляции 131
III. 1.2.1. Укорочение молекулы дерморфина с С-конца 131
III. 1.2.2. Роль второго аминокислотного остатка в молекуле дерморфина 135
111.1.2.3. Роль третьего аминокислотного остатка в молекуле дерморфина 138
111.1.2.4. Роль четвертого аминокислотного остатка в молекуле дерморфина 145
III. 1.2.5. Терморегуляторная активность, удлиненных с N-конца аналогов дерморфина 156
111.1,2.6. Роль аминокислотных остатков в последовательности N-концевого тетрапептида 168
III. 1.2.7. Роль шестого аминокислотного остатка в молекуле дерморфина 173 III.
1.2.8. Терморегуляторная активность гибридов дерморфина и бомбезина 197
Поиск- средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза на основе изучения закономерностей зависимости между структурой и терморегуляторной активностью эндогенного опиоидного пептида Leu-энкефалина, его фрагментов и аналогов 200
Ш.2.1. Терморегуляторная активность Leu-энкефалина 201
ІІІ.2.2. Терморегуляторная активность фрагментов Leu-энкефалина 201
Ш.2.3. Терморегуляторная активность аналогов Leu-энкефалина 201
Ш.З. Поиск средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза на основе изучения структурно-функциональных отношений в ряду эндогенного пептида дельта-сна (DSIP) 206
Ш.3.1. Терморегуляторная активность пептида DSIP и его фрагментов 207
111.3.2. Терморегуляторная активность аналогов DSIP 207
Ш.4. Изучение гипотермической активности теоретически предсказанных фрагментов деградации эндогенного пептида бомбезина и его модифицированного фрагмента-литорина 215
III.4.1. Терморегуляторная активность бомбезина 215
Ш.4.1.1. Терморегуляторная активность бомбезина при внутримозговом введении 215
Ш.4.1.2. Терморегуляторная активность бомбезина при интраназальном введении 221
Ш.4.2. Прогнозирование процесса деградации литорина и терморегуляторная активность его фрагментов 221
111.4.3. Терморегуляторная активность литорина и его фрагментов 229
ІІІ.5. Изучение новых пептидов, выделенных из мозга гибернирующих животных, в качестве средств
фармакологической регуляции температурного гомеостаза 242
111.5.1. Терморегуляторная активность неокиоторфина 243
ПІ.5.2. Терморегуляторная активность киоторфина 248
111.5.3. Терморегуляторная активность новых пептидов, выделенных из мозга Citellus undulatus 251
111.5.4. Терморегуляторная активность новых пептидов, выделенных из мозга Yakutian horse 261
Ш.6. Новая концепция фармакологической регуляции температурного гомеостаза 267
Ш.6.1. Влияние дерморфина и его аналогов на развитие компенсаторных сосудистых реакций в условиях нестационарного температурного воздействия 268
111.6.2. Влияние аналога и фрагмента энкефалина на развитие компенсаторных сосудистых реакций в условиях нестационарного температурного воздействия 276
Ш.6.3. Влияние литорина и его фрагментов деградации на развитие " компенсаторных сосудистых реакций в условиях нестационарного температурного воздействия 277
Ш.6.4. Влияние пептидов, выделенных из мозга зимоспящих, на развитие компенсаторных сосудистых реакций в условиях нестационарного температурного воздействия 278
IIL6.5. Влияние пептидов на поведенческую терморегуляцию в тесте "Термопреферендум" 280
Обсуждение результатов 282
Выводы 312
Список литературы
- Методы исследования терморегуляторной активности
- Механизм терморегуляторной активности дерморфина
- Терморегуляторная активность фрагментов Leu-энкефалина
- Терморегуляторная активность бомбезина при внутримозговом введении
Введение к работе
В последнее время гипотермия находит все большее применение в клинических условиях. Гипотермию используют в нейрохирургии: для снижения внутричерепного давления при некоторых видах травм и гипоксических-ишемнческих инсультах, при операциях на магистральных сосудах мозга, церебральных аневризмах, врожденных пороках артерио-венозных сосудов, злокачественной опухоли основания черепа (Hachimi-Idrissi, Huyghens, 2004; Mohammad, et al., 2004; Smrcka, et al., 2005) и в кардиологии: при операциях на открытом сердце (Hearse, 1980; Barner, 1980), при внезапной остановке сердца (Friberg, et al., 2004), ишемических инфарктах (Mohammad, et al., 2004). Возрастающий интерес к патофизиологии апоптоза и другим процессам гибели клеток, а также к механизмам, лежащим в основе защитных эффектов гипотермии, привел к расширению диапазона клинического применения гипотермии (Brux, et al., 2005). Во многих зарубежных медицинских центрах гипотермия стала частью стандартной терапии. Данные Европейского и Австралийского Испытательных Центров продемонстрировали снижение смертности и тяжести неврологических нарушений после применения гипотермии. В 2003 году International Liaison Committee on esuscitation (ILCOR) включил терапевтическую умеренную гипотермию (32-34° С) в протокол необходимых реанимационных мероприятий при внезапной остановке сердца (Рорр, et al., 2005).
Традиционные способы принудительного охлаждения с применением физических методов понижения температуры тела и известная медикаментозная гипотермия весьма отрицательно влияют не только на больной, но и на здоровый организм. При охлаждении гомойотермов происходит активация компенсаторных защитных механизмов терморегуляции, преодолеть которые крайне трудно. Основные исследования по разработке фармакологических гипотермических средств были направлены на создание соединений, препятствующих развитию специфических компенсаторных терморегуляторных реакций и подавляющих сократительный и не сократительный термогенез. В качестве попытки создания комплексного средства для подавления термогенеза можно привести нейроплегический коктейль (промедол, морфин, аминазин, атропин, димедрол, гексоний и т.д.) (Тимофеев, 1983), который, однако, не вышел за пределы экспериментального изучения.
В природе примером регулируемой гипотермии является гибернация -физиологическое состояние, при котором происходит минимизация уровня физиологических функций организма, позволяющая в течение многих месяцев переживать неблагоприятные условия внешней среды. Искусственное получение гипобиоза по аналогии с естественным, имеет вековую историю (Бахметьев, 1902). Многие ведущие научные центры, как за рубежом, так и в нашей стране, проводят исследования по изучению естественного и созданию искусственного гипобиоза. В основе процессов гипобиоза лежит регулируемое обратимое снижение температуры тела, связанное не только с угнетением термогенеза, но и с изменением центрального уровня регуляции (смещением "set point"). На протяжении последних 15 лет в ИБОХ РАН под руководством академика В.Т. Иванова проводятся исследования по выделению и идентификации новых биологически активных соединений пептидной природы из мозга гибернирующих животных (Зиганшин, и др. 1994).
В настоящее время общепризнанна ведущая роль эндогенных пептидов в регулировании различных систем организма. Большинство природных пептидных соединений обладает полифункциональным действием, что затрудняет создание на их основе лекарственных препаратов с избирательной активностью. Поэтому изучение и создание на основе структурно-функциональных взаимосвязей новых пептидных соединений, вызывающих регулируемое изменение температуры тела, является актуальной проблемой современной фармакологии. Исследование структурно-функциональных взаимоотношений позволяет не только определить пептидную последовательность, обладающую заданными свойствами, но на основе направленной модификации усилить или ослабить эти свойства.
Изыскание новых терморегуляторно-активных пептидных соединений и создание на их основе пептидов-терморегуляторов (в частности пептидов, вызывающих мягкую обратимую гипотермию) является актуальным и имеет большое значение для решения широкого круга задач клинической медицины.
Работа поддержана грантами РФФИ №00-04-48272 , №03-04-48404 и офи_а №04-04-08009. Целью настоящего исследования явилась разработка средств фармакологической регуляции процессов температурного гомеостаза на основе исследований структурно-функциональных взаимоотношений в рядах эндогенных пептидов (дерморфинов, Leu-энкефалинов, DSIP, бомбезинов и новых соединений, выделенных из мозга гибернирующих животных), оказывающих влияние на функциональное состояние системы терморегуляции, и создание на этой основе базы данных новых веществ - пептидов-терморегуляторов.
В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:
1. Поиск средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза на основе структурно-функциональных исследований в ряду эндогенного опиоидного пептида дерморфина (ДМ).
2. Поиск средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза на основе изучения закономерностей зависимости между структурой и терморегуляторной активностью эндогенного опиоидного пептида Leu-энкефалина (Leu-ЭНК), его фрагментов и аналогов.
3. Поиск средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза на основе структурно-функциональных отношений в ряду эндогенного пептида DSIP.
4. Изучение гипотермической активности теоретически предсказанных фрагментов деградации эндогенного пептида бомбезина и его модифицированного фрагмента - литорина.
5. Изучение новых пептидов, выделенных из мозга гибернирующих животных, в качестве средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза.
6. Разработка новой концепции фармакологической регуляции температурного гомеостаза.
Научная новизна. Выявлен новый класс пептидных соединений и создана база данных - пептидов-терморегуляторов.
Разработан новый оригинальный комплексный методологический подход для выявления и изучения веществ, вызывающих изменения в системе терморегуляции не только на уровне изменения температуры тела и развития компенсаторных реакций, но и на уровне температурной чувствительности и центральной регуляции температурного гомеостаза in vivo.
Разработана новая концепция фармакологической пептидной регуляции температурного гомеостаза, основанная на изменении центрального уровня регуляции, относительно которого развиваются защитные компенсаторные реакции. Предложенная концепция фармакологической регуляции температурного гомеостаза позволяет существенно снизить активность защитных компенсаторных реакций, вызывающих негативные последствия при клиническом применении гипотермии.
Впервые установлено, что дерморфин, вызывает обратимую температуро-зависимую гипотермию и двухфазную вазомоторную реакцию (вазодилятация сменяется вазоконстрикцией). Гипотермия и реакция вазоконстрикции опосредуется через налоксон-чувствительные, а реакция вазодилятации - через налоксон-нечувствительные рецепторы.
На основе структурно-функциональных исследований пептидов семейства дерморфина впервые показано, что разные фрагменты молекулы дерморфина ответственны за разные виды физиологической активности. Гипотермическим действием обладает только N-концевой тетрапептид. Реакцию вазодилятации вызывает N-концевой гексапептид. Для проявления двухфазной сосудистой реакции необходима целая молекула дерморфина. Модификация в молекуле дерморфина аминокислотных остатков в первом, во втором, третьем, четвертом и шестом положениях показала, что возможна замена DAla на DArg , Phe на Тгр , Gly4 на DAla4, Pro6 на Hyp6, dHPro6 и DdHPro6. Модификация N-концевого тетрапептида (замена DAla2 на DArg2) позволила увеличить длительность гипотермического эффекта более чем в 2 раза. Удлинение молекулы ДМ с N-конца на один аминокислотный остаток позволило разделить гипотермическую активность, а также реакцию вазодилятации и реакцию вазоконстрикции. Добавление Arg к молекуле с N-конца в 2 раза увеличило налоксон-нечувствительную реакцию вазодилятации, a 4Amino-Pro - в 3 раза налоксои-чувствительную реакцию вазоконстрикции.
Впервые показано, что бомбезин вызывает гипотермию при интраназалыюм введении. N-коицевые дипептиды - фрагменты-метаболиты деградации литорина и бомбезина, обладают самостоятельной гипотермической активностью. Установлено, что аналог N-концевого трипептида Glp-GIn-Glu(YOMe)-OH превышает гипотермический эффект бомбезина.
Впервые установлено, что пептиды (неокиоторфин (НКТ) и киоторфин (КТ)), выделенные из фракций мозга зимоспящих животных, оказывают влияние на температуру тела и вазомоторные реакции. НКТ вызывает гипертермию только в условиях термонейтральной среды. КТ - С-концевой фрагмент НКТ, снижает температуру тела только в холодной среде. Пептид RZ-13 вызывает температуро-зависимые изменения температуры тела и реакцию расширения периферических сосудов.
Методы исследования терморегуляторной активности
TRPM8 каналы активируются холодной температурой (Patapoutian, et al., 2003; Peier, et ah, 2002), изменением потенциала и ментолом (Peier, et al., 2002; Brauchi, et al., 2004). Каналы открываются при 28 С и их активность повышается до 10 С (McKemy, et al, 2002). Уменьшение уровня Са2+ (0,5 ммоль), как правило, активирует, а повышение уровня Са2+ (5,0 ммоль) - подавляет активность афферентов Холодовых рецепторов. Ментол (10" моль) полностью симулирует снижение кальция Холодовых рецепторов. Адреналин и норадреналин (10 6 моль) также подавляют активность Холодовых рецепторов (Brauchi, et al., 2004). В холодовых рецепторах средний разряд определяется частотой колебания рецептора и, вероятно, каждый цикл этого процесса инициируется афферентным импульсом. Все измерения в основном влияют на генерацию импульсов, а не на частоту колебаний. Оубаин (Ю -Ю"7 моль) (блокатор Na+/K+-Hacoca) вызывает возбуждение в афферентных волокнах холодовых рецепторов языка (Schaffer, Braun, 1990).
TRPV3 и TRPV4 каналы расположены в сенсорных нейронах и кератиноцитах, которые в настоящее время предположительно рассматриваются, как термочувствительные клетки (Chung, et al., 2004), TRPV4, ранее были описаны как гипо-осмолярно-активные ионные каналы. Активация TRPV4 каналов, вызванная теплом, больше в гипоосмотическом растворе и меньше в гиперосмотическом растоворе. В ответ на высокую температуру TRPV4 инициирует внутренний ток на ооцитах Xenopus oocytes и внутренний ток с увеличением Са2+ в клетках эмбриона человека 293. Изменение внутреннего тока наблюдается при температуре более низкой, чем необходимо для активации TRPV1, и обратимо подавляется красным рутением (Guler, et ah, 2002).
TRPV1 каналы, или ванилоидный рецептор подтипа 1 (VR1), или капсаициновыи рецептор экспрессируется в первичных сенсорных нейронах и блуждающем нерве. В первичных сенсорных нейронах грызунов TRPV1 экспрессируются вместе с Холодовыми рецепторами TRPA1, но не TRPM8 (Peier, et ah, 2002; McKemy, et ah, 2002; Story, et ah, 2003). TRPV1 активируется температурой (Liu, et ah, 2003), протонами (зависит от pH) (Ryu, et ah, 2003) и капсаицином (Jordt, Julius, 2002; Hui, et ah, 2003), стимулируя вход Ca2+ и Na+ (Sasamura, Kuraishi, 1999). Ресинифератоксин-чувствительные (ресинифератоксин - агонист ванилоидных рецепторов) ванилоидные рецепторы потенциал независимы и катион-неселективны (Biro, et ah, 1997). Острое введение ресинифератоксина вызывает дозо-независимую гипотермию у хорьков, крыс и мышей при температуре окружающей среды 20 С, но не в термонейтралыюй среде (29 С) (Woods et ah, 1994). Капсаицин вызывает сенситизацию после однократного введения и десенсибилизацию сенсорных нейронов после введения больших доз и длительного лечения (Sasamura, Kuraishi, 1999). Субпопуляция сенсорных нейронов, чувствительных к капсаицину, включает С-полимодальные ноцицепторы, А6 механотепловые ноцицепторы, тепловые рецепторы кожи, энтероцепторы на афферентных волокнах (Szallasi, Blumberg, 1990). Капсаицин в больших дозах на длительное время десенситизирует С-волокна сенсорных афферентных нейронов, содержащих нейропептиды, включая КГРП, вещество Р, и активирующих множество физиологических функций, включая термогенную боль, терморегуляцию, нейрогенное воспаление (Biro, et ah, 1997). Через TRPV1 каналы опосредуется термальная ноцицепция, что подтверждено экспериментальными данными на мышах, лишенных гена TRPV1. По всей вероятности, TRPA1, TRPM8 и TRPV2 каналы также имеют отношение к тепловой или холодовой ноцицепции (Tominaga, Caterina, 2004). Уменьшение температурного порога активации TRPV1 оказывает влияние на механизмы противовоспалительной боли (Tominaga, 2004). Брадикинин, пептид воспаления, действуя через рецепторы, связанные с G-белками активирует TRPA1 каналы. Показано, что важным сигнальным компонентом активации является фосфолипаза С (Bandell, et о/., 2004). Кроме восприятия боли и термочувствительности TRP катионные селективные каналы участвуют в механорегуляции и вазорелаксации (Lee, et ah, 2003).
У человека термическая . чувствительность обеспечивается спиноталамическим трактом: первый заднекорешковый нейрон контактирует со вторым нейроном в задних рогах спинного мозга. Аксон этого нейрона переходит на уровне того же или смежных сегментов на противоположную сторону и направляется краниально, заканчиваясь в передних ядрах таламуса.
Центральные термочувствительные структуры Центр регуляции температурного гомеостаза расположен в гипоталамусе. За регуляцию теплоотдачи ответственна его передняя область, а ядра заднего отдела осуществляют регуляцию теплообразования. На границе между передним и задним гипоталамусом обнаружены нейроны, реагирующие на изменения температуры кожи в различных областях тела. Информация от терморецепторов поступает в интегративный центр терморегуляции, где происходит установление заданного значения или "set point". Заданное значение можно рассматривать как суммарную стационарную температуру тела, пребывающего в состоянии покоя, когда не работают ни механизмы выделения излишков тепла, ни механизмы защиты от холода.
К переднему отделу гипоталамуса относятся парные паравентрикулярные супраоптические и супрахиазматические ядра, а также медиальные преоптические ядра. К заднему отделу гипоталамуса - области мамиллярных тел, медиальные, латеральные и промежуточные ядра.
Существуют две точки зрения относительно принципа взаимоотношений двух центров терморегуляции: а) нейроны гипоталамуса избирательно возбуждаются изменениями мозговой температуры при ее отклонении от заданного уровня ("set point"); б) центры терморегуляции реагируют рефлекторно на притекающие к ним импульсы от периферических терморецепторов.
Механизм терморегуляторной активности дерморфина
ДМ является селективным агонистом ц-опиоидных рецепторов. Было сделано предположение, что, терморегуляторная активность ДМ может быть связана с активацией опиоидных рецепторов. В качестве блокатора опиатных рецепторов был выбран налоксон -агонист опиоидных рецепторов. Налоксон (NL) вводили в/б в дозе 1 мг/кг за 15 минут до введения пептида. Налоксон в дозе 1 мг/кг блокирует анальгетическую активность ДМ (собственные экспериментальные данные). ДМ вводили в/б в дозе 0.5 и 5 мг/кг.
Введение налоксона крысам, находящимся при Тк = 4-6 С вызывало медленное снижение Тт, которое к 120 минуте в среднем опускалась на -0.74 ± 0.12 С. Тхв также снижалась, но на меньшую величину, чем у контрольной группы животных (рис. 9).
Предварительное введение налоксона уменьшало вызываемую ДМ гипотермию и не изменяло развитие вазомоторной реакции (рис. 9).
Таким образом, в условиях действия холода налоксон устранял гипотермию, вызываемую ДМ, но не оказывал влияния на реакцию периферических сосудов.
Введение налоксона крысам, находящимся при Тк = 20-2 Г С вызывало снижение Тт, достигавшее минимума (-0.54 ± 0.11 С) на 40-50 мин после введения. Тхв также снижалась, однако была выше, чем у контрольной группы животных. Предварительное введение налоксона устраняло вызываемую ДМ гипотермию, однако не только не оказывало влияния, а даже наоборот усиливало развитие вазомоторной реакции (рис. 10).
На фоне налоксона ДМ вызывал двухфазную вазомоторную реакцию, тогда как при введении ДМ наблюдалась только реакция вазоконстрикции. Повышение Тхв (0.28 ± 0.07 С) сменялось снижением Тхв (-0.4 ± 0.1 Г С), однако снижение
Влияние ДМ, вводимого в/б в дозе 0.5 мг/кг, на фоне предварительно введенного налоксона (в/б, 1 мг/кг), на динамику температуры тела (а) и температуры кожи хвоста (б) крыс, находящихся в холодной среде (Тк = 4-6 С). Отличия достоверны от контроля ( ), от ДМ (&) и от NL (#) при Р 0.05.
Влияние ДМ, вводимого в/б в дозе 0.5 МГ/КГ, на фоне предварительно введенного налоксона (в/б, 1 мг/кг), на динамику температуры тела (а) и температуры кожи хвоста (б) крыс, находящихся в комнатной температуре (Тк = 20-21 С). Отличия достоверны от контроля ( ), от ДМ (&) и от NL (#) при Р О.05.
Тхв было достоверно меньше, чем при действии ДМ, и не отличалось от снижения Тхв при действии только налоксона.
Таким образом, в условиях комнатной температуры налоксон предотвращал снижение Тт, вызываемое ДМ, усиливал его сосудорасширяющее и уменьшал сосудосуживающее действие.
Введение налоксона крысам, находящимся при Тк = 27-28 С, вызывало снижение Тт, достигавшее минимума (ДТт = -03 ± 0.06 С) на 30-40 мин после введения, Тхв достоверно снижалась и к 120 мин в среднем достигала значения -1.97 ± 0.36 С, Предварительное введение налоксона устраняло вызываемую ДМ гипотермию. Двухфазный эффект действия ДМ на фоне налоксона сохранялся, при этом реакция вазодилятации было несколько снижена (ДТхв = 1.48 ± 0.26 С), а реакция вазоконстрикции - усилена (ДТхв = -2.3 ± 0.28 С). Реакция вазоконстрикции ДМ+NL достоверно не отличалась от реакции вазоконстрикции, вызываемой налоксоном (рис. 11),
Таким образом, в условиях термонейтральной среды налоксон предотвращал снижение Тт, вызываемое ДМ. При этом сохранялся его двухфазный вазомоторный эффект, причем вторая фаза совпадала с действием самого налоксона.
Введение налоксона крысам, находящимся при Тк = 31-32 С вызывало медленное снижение Тт, которое к 120 мин достигало в среднем -0.35 ± 0.05 С. Тхв также снижалась и к 120 мин в среднем достигала значения -0.43 ± 0.06 С. Предварительное введение налоксона уменьшало гипертермию, вызванную ДМ при введении 5 мг/кг, и полностью устраняло гипотермию пептида в дозе 0.5 мг/кг. Реакция вазоконстрикции, вызываемая ДМ в дозе 5 мг/кг, на фоне предварительно введенного налоксона усиливалась (ДТхв = -2.38 ± 0.36 С) и сохранялась до конца эксперимента (120 мин) (рис. 12).
Таким образом, в условиях жаркой среды налоксон уменьшал, но полностью не предотвращал повышение Тт, вызванное ДМ в дозе 5 мг/кг, и усиливал реакцию вазоконстрикции.
Результаты проведенных экспериментов показали, что ДМ вызывает дозо-зависимые изменения температуры тела, характерные для пойкилотермных организмов, в частности, снижение температуры тела в холодной среде и повышение в жаркой.
Терморегуляторная активность фрагментов Leu-энкефалина
Таким образом, результаты проведенных экспериментов показали, что при замене Gly2 на DAla в молекуле Leu-ЭНК наблюдалось увеличение продолжительности гипотермического эффекта. Однако добавление Arg с С-конца привело к полному исчезновению его терморегуляторной активности (табл. 9).
Таким образом, можно заключить, что Leu-ЭНК, а также ни один из его фрагментов или аналогов не вызывали температуро-зависимой гипотермии и поэтому не представляют интереса для разработки их в качестве регуляторов температурного гомеостаза.
Используя ресурсы банка пептидных соединений EROP-Moscow (http//erop.inb Lras.ru), созданного сотрудником Института биохимии им. А.С.Баха РАН А.А.Замятниным (Zamyatnin, 1991), было установлено (Kovalzon, 1999) структурное сходство нонапептида DSIP (Trp-Ala-Gly-Gly-Asn-Ala-Ser-Gly-GIu) и декапептидного аналога дерморфина (Tyr-AIa-Phe-Glyyr-Pro-Ser-Gly-GIu-AIa), образующегося после ферментативного расщепления продерморфина, экспрессированного в культуре ткани млекопитающих in vitro (Seethaler, et ah, 1993). Было показано, что в условиях низких температур DSIP вызывает гипотермию, тогда как в комнатных условиях - гипертермию (Clark, et aL, 1983).
Целью данной серии исследований явилось изучение влияния пептида дельта-сна (DSIP), его фрагментов и аналогов на систему терморегуляции крыс, находящихся в холодной среде (Тк = 4-6 С), как зоны, в которой наиболее ярко проявляется активность пептидов, и определение путем замены роли отдельных аминокислотных остатков в молекуле DSIP в реализации терморегуляторних эффектов.
В данной серии экспериментов использовали пептиды, синтезированные в лаборатории синтеза пептидов (рук. акад. В.Т. Иванов) Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН:
Внутрибрюшинное введение DSIP в дозе 1 и 0.5 мг/кг крысам, находящимся в камере при Тк = 4-6 С вызывало расширение периферических сосудов на протяжении всего эксперимента, однако, при этом Тт сохранялась на исходном уровне (рис. 56). Выраженной концентрационной зависимости не наблюдалось.
Укорочение пептида на один аминокислотный остаток с С-конца приводило к исчезновению вазомоторной реакции (рис. 56).
Введение гексапептида с замещенным Ala2 на DAIa2 вызывало снижение Тт, которое с 70 минуты после введения достоверно отличалось от контрольной группы животных (рис. 56).
Таким образом, результаты проведенных экспериментов показали, что DSIP обладал сосудорасширяющим действием, однако при укорочении его на три аминокислотных остатка с С-конца или замене Ala2 на DAIa2 исчезала вазомоторная активность и возникала гипотермическая (табл. 10).
Терморегуляторная активность аналогов DSIP. Роль первого аминокислотного остатка в молекуле DSIP. Введение крысам [DTyr ]-DSIP не оказывало влияния на динамику Тт и Тхв (рис. 57). Введение [Туг1, Pro2]-DSIP вызывало снижение Тт, усиливающееся к концу эксперимента (ДТт = -0.43 ± 0.05 С) (рис. 57а). Падению Тт предшествовало повышение Тхв (ДТхв = 0.73 ± 0.4 С) (рис. 576), характеризующее расширение периферических сосудов, способствующее снижению Тт.
Введение крысам [DVal ]-DSIP приводило к снижению Тт. К концу эксперимента изменение Тт достигало ДТт = -0.48 ± 0.07 С (рис.58а). Одновременно наблюдалось снижение Тхв, которое предшествовало изменению Тт (рис.586). Инъекция [DTyi J-DSIP и [MeAIa2]-DSIP также вызывала снижение Тт, но не влияла на тонус периферических сосудов (рис. 58). [DLeu2]-DSIP и [DAIa2, Pro6]-DSIP не проявляли терморегуляторной активности (рис. 58).
Одновременная замена Ala на DAIa и Ala6 на Туг6 в молекуле DSIP приводила к появлению гипотермической активности. Так, введение [DAIa2, Туг6]-DSIP вызывало снижение Тт, с максимумом на 20-й минуте после введения (ДТт = -0.32 ± 0.05 С) (рис. 59а). При этом, вазомоторной активностью пептид не обладал (рис. 596).
Таким образом, результаты проведенных экспериментов показали, что замена Ala во втором положении в молекуле DSIP приводила к изменению его терморегуляторной активности. Так, [DVal2]-DSIP вызывал сужение периферических сосудов и одновременно снижал Тт. [MeAla J-DSIP, [DTyr J-DSIP и [DAIa2, Tyr6]-DSIP снижали Тт и не изменяли тонус периферических сосудов. [DLeu2]-DSIP и [DAIa2, Pro6]-DSIP вообще были не активны (табл. 10). Влияние ID-6 на систему терморегуляции.
При введении крысам ID-6 наблюдались изменения Тт и Тхв, сходные с [DAIa2, Tyr6]-DSIP (рис, 59).
Удлинение молекулы DSIP дипептидом Gty-Pro с N-конца. Введение Gly-Pro-DSIP вызывало повышение Тт (ДТт = 0.58 ± 0.05 С), на протяжении всего эксперимента (рис. 60а). Изменений в динамике Тхв не наблюдалось (рис. 606). Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что существует структурно-функциональная зависимость наблюдаемых температурных и вазомоторных эффектов.
Терморегуляторная активность бомбезина при внутримозговом введении
Целью данной серии исследований явилось изучение влияния НКТ и его аналога [DSer -HKT на систему терморегуляции крыс (температуру тела, компенсаторные вазомоторные реакции), находящихся при разной температуре окружающей среды.
Пептиды вводили в/б в дозе 0.5 мг/кгиі.п. -в дозе 0.15 мг/кг. Внутрибрюшинное введение НКТ крысам, находящимся в камере при Тк = 4-6 С не вызывало изменений Тт и Тхв (рис. 72).
Введение НКТ крысам, находящимся в термонейтралыюй среде (Тк = 27-28 С) приводило к повышению Тт, с максимумом (ДТт = 0.3 ± 0.05 С) на 30 мин, и сохранявшемуся в течение 40 мин. Затем наблюдалось снижение Тт (рис. 72а). Повышение Тт сопровождалось изменением динамики Тхв. Так, при введении пептида наблюдалось достоверное повышение Тхв (ДТхв = 2.19 ± 0.3 С),
Влияние НКТ, вводимого в/б в дозе 0.5 мг/кг, на динамику температуры тела (а) и температуры кожи хвоста (б) крыс, находящихся в холодной (Тк=4-6 С), термонейтральной (Тк = 27-28 С) и жаркой средах (Тк - 31-32 С). Отличия от контроля достоверны: - Р 0.05. 245 характеризующее реакцию расширения периферических сосудов (рис. 726). Через 70 мин наблюдалось снижение Тхв (рис. 726).
Введение пептида крысам, находящимся в условиях жаркой среды (Тк = 31-32 С), также как и в условиях холодной среды (Тк = 4-6 С) не приводило к каким-либо изменениям динамики Тт и Тхв (рис, 72).
Интраназальное введение НКТ, как и в/б инъекция во всех температурных режимах вызывала похожие изменения Тт и Тхв (рис. 73).
Таким образом результаты проведенных исследований показали, что только в условиях термонейтральной среды НКТ, независимо от способа введения, вызывает повышение Тт, которое сопровождается компенсаторным повышением Тхв, характеризующем реакцию вазодилятации, что в свою очередь и обеспечивает предотвращение дальнейшего роста Тт.
Влияние замены Set2 на DSePe молекуле неокиоторфина. Действие [DSer J-HKT изучали на крысах, находящихся только в комфортной среде, поскольку именно в этих условиях НКТ проявлял терморегуляторную активность.
Внугрибрюшинное введение [DSer J-HKT крысам, находящимся в термонейтральной среде (Тк = 27-28 С) приводило также к повышению Тт, достигавшему максимума (ДТт = 0.2 ± 0.05 С) через 30 мин, сохранявшееся до конца эксперимента (рис. 74а). Повышение Тт сопровождалось изменением динамики Тхв. Так при введении пептида вслед за увеличением Тт наблюдалось достоверное повышение Тхв (ДТхв = 0.9 ± 0.3 С), характеризующее реакцию расширения периферических сосудов (рис. 746).
Интраназальное введение [DSer -HKT в дозе 0.15 мг/кг вызывало сходные изменения Тт и Тхв, как и внугрибрюшинное (рис. 74).
Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что в условиях термонейтральной среды [DSer2]-HKT, независимо от способа введения, вызывает повышение Тт, которое сопровождается повышением Тхв, характеризующем реакцию вазодилятации, что в свою очередь и обеспечивает предотвращение дальнейшего роста Тт.
Влияние НКТ и [DSerlHKT, вводимых Ілі. в дозе 0.15 мг/кг и в/б в дозе 0.5 мг/кг, на динамику температуры тела (а) и температуры кожи хвоста (б) крыс, находящихся в термонейтральной среде (Тк = 27-28 С). Отличия от контроля достоверны: - Р 0.05.
Терморегуляторная активность киоторфина. В данной серии исследований изучали влияния КТ и его аналога [DArg2J-KT на систему терморегуляции крыс (температуру тела, компенсаторные вазомоторные реакции), находящихся при разной температуре окружающей среды.
Пептиды вводили в/б в дозах 0.5 мг/кг и i.n. в дозе 0.05 мг/кг. Введение КТ в дозе 0.5 мг/кг (в/б) крысам, находящимся в камере при Тк = 4-6 С, вызывало снижение Тт. К концу эксперимента ДТт = -0.75 ± 0.07 С (рис. 75а). Тхв была достоверно выше, чем у контрольной группы животных (рис. 756).
Введение этой же дозы КТ крысам, находящимся в термонейтральной (Тк = 27-28 С) и жаркой (Тк = 31-32 С) средах, не вызывало изменений динамики Тт и Тхв (рис. 75). I.n. введение КТ в дозе 0.05 мг/кг во всех температурных режимах вызывало такие же изменения Тт и Тхв, как и в/б.
Таким образом результаты проведенных исследований показали, что только в условиях холодной среды КТ, независимо от способа введения, вызывает снижение Тт, которое сопровождается повышением Тхв, характеризующем неполное компенсаторное сужение периферических сосудов, что в свою очередь и способствует дальнейшему снижению Тт.
Влияние замены Arg2 на DArg в молекуле киоторфина. Внутрибрюшинное введение [DArg2]-KT в дозе 0.5 мг/кг крысам, находящимся в камере при Тк = 4-6 С, приводило к большему по сравнению с КТ снижению Тт. К концу эксперимента ДТт = -1.22 ± 0.07 С (рис. 76а). Тхв была также достоверно выше, чем у контрольной группы животных (рис. 766).
Инъекция этой же дозе [DArg -KT крысам, находящимся в термонейтральной (Тк = 27-28 С) и жаркой (Тк = 31-32 С) средах не вызывало изменений динамики Тт и Тхв. I.n. введение [DArg2]-KT в дозе 0.05 мг/кг во всех температурных режимах вызывало такие же изменения Тт и Тхв, как и внутрибрюшинное (рис. 76).
![Поиск новых потенциальных противотромботических средств на экспериментальных моделях с метаболическими нарушениями [Электронный ресурс]](/i/i/4309/204252.png "Поиск новых потенциальных противотромботических средств на экспериментальных моделях с метаболическими нарушениями [Электронный ресурс] Бочарникова Наталья Владимировна")
