Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1 Роль тромбоцитов в гемостазе и фармакологическая регуляция их гиперактивности
1.2 Фармакологическая регуляция повышенной функциональной активности тромбоцитов 23
1.3 Производные пиридин-3-карбоновой кислоты и ее дериватов. Свойства и применение в медицинской практике 27
1.4 Производные пиридин-3-карбоновой кислоты и ее дериватов. Свойства и применение в медицинской практике 32
2. Материалы и методы исследования 33
2.1 Характеристика используемого материала 34
2.2 Методы исследования 39
2.2.1 Изучение агрегации тромбоцитов 39
2.2.2 Регистрация образования активных форм кислорода «Дыхательный взрыв» 41
2.2.3 Определение базального уровня кальция [Са+2 ]і в цитоплазме лимфоцитов человека 42
2.2.4 Определение острой токсичности потенциального антиагреганта 44
3. Результаты собственных исследований 43
3.1 Способность новых производных пиридин-3- карбоновой кислоты угнетать агрегацию тромбоцитов 44
3.1.1 Эксперименты в условиях in vitro 44
3.1.2 Эксперименты в условиях in vivo 51
3.2 Влияние ИФК-366 на образование радикалов кислорода фагоцитами крови здоровых доноров и больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями (инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь Ист.) 57
3.3 Влияние ИФК-366 на образование радикалов кислорода фагоцитами крови здоровых доноров и больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями (инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь Пет.) 67
3.4 Определение острой токсичности ИФК-3 66 74
Заключение 83
Выводы 82
Практические рекомендации 84
Список используемой литературы 85
- Фармакологическая регуляция повышенной функциональной активности тромбоцитов
- Производные пиридин-3-карбоновой кислоты и ее дериватов. Свойства и применение в медицинской практике
- Изучение агрегации тромбоцитов
- Влияние ИФК-366 на образование радикалов кислорода фагоцитами крови здоровых доноров и больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями (инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь Ист.)
Введение к работе
Активация гемостаза, вызванная агрегацией тромбоцитов, сопровождается развитием острого коронарного синдрома, нарушением мозгового кровообращения, эмболиями и др., приводящими к высокой смертности населения [16, 33, 38, 84, 88, 138].
Перспективным путем в лечении этих заболеваний, является применение лекарственных препаратов, изменяющих соотношение между продуктами метаболизма арахидоновой кислоты, т.е. простациклина' и, тромбоксана А2, в сторону увеличения первого, и вызывающих, антиагрегационный эффект. Такой возможностью регулировать баланс между указанными простаноидами обладают ацетилсалициловая кислота, пентоксифиллин, тиклопидин, клопидогрел, абциксимаб и др. В то же время их применение не всегда- достаточно эффективно и' может спровоцировать различные осложнения [3, 5, 19, 24, 25, 42, 97].
Избирательным влиянием на систему метаболизма арахидоновой
кислоты, способствующим антиагрегационному действию, обладает
пиридинкарбоновая кислота, котораяі угнетает активность
тромбоксансинтетазы и снижает уровень тромбогенного фактора — ТхАг, не влияя на синтез простациклина [132^ 133, 134].
Однако, необходимо отметить, что выраженный эффект достигался применением достаточно высоких доз этого лекарства, способного вызвать нежелательные эффекты [30]'.
В тоже время имеются публикации, которые свидетельствуют, что по силе и продолжительности антиагрегационного эффекта, пиридин-3-карбоновую кислоту превосходили-ее дериваты [21, 22].
Все выше изложенное, послужило основанием для проведения наших экспериментов, связанных с поиском новых, перспективных противотромботических лекарственных препаратов из выше указанного класса соединений, а так же изучению некоторых аспектов механизма их действия.
Таким образом, успешное решение создания высокоэффективного и малотоксичного антиагреганта среди производных пиридин-3-карбоновой кислоты, позволит предложить для клинической практики медикаментозное средство, предназначенное для борьбы с тромбозами и различными сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Данная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по проблеме «Лекарственная регуляция гемостаза», № Госрегистрации 01200100390.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель исследования^ - скрининг новых производных пиридин-3 -карбоновой кислоты для последующего отбора и создания перспективного противотромботического лекарственного препарата.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Для достижения намеченной цели были поставлены задачи:4
Изучить влияние 13 новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты (в сравнении с эталонной субстанцией) на агрегацию тромбоцитов, индуцируемую аденозиндифосфорной кислотой в условиях in vitro.
Определить наиболее активное соединение, подавляющее агрегацию тромбоцитов, в условиях hrvivo.
Исследовать- влияние перспективного антиагреганта на уровень свободного кальция [Са ]і в цитоплазме лимфоцитов доноров.
Оценить возможность регуляции данным соединением активности нейтрофилов доноров и больных, страдающих сердечно-сосудистой патологией.
Определить острую токсичность (LD5o) наиболее активного антиагрегационного соединения — деривата пиридин-3-карбоновой кислоты.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЙ
Впервые проведен скрининг антиагрегационной активности ' 13 новых дериватов пиридин-3-карбонвой кислоты. Отобрано вещество, способное угнетать активность тромбоцитов, как в условиях in vitro, так и при пероральном введении.
Наиболее выраженным эффектом при данном пути введения обладает гидрохлорид диэтилового эфира ]чГ-(5-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты с условным шифром ИФК-366.
Доказано, что это вещество подавляет обмен ионов Са в лимфоцитах здорового человека, за счет снижения выхода этих ионов из внутриклеточных депо, угнетает транспорт данного катиона через кальциевые каналы плазматических мембран клеток, по-видимому, через ингибирование активности Са -АТФ-азы.
Установлено, что ИФК-366 не только в образцах крови доноров, но и у больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями* (острый инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь II ст.), подавляет образование нейтрофилами человека супероксид анион радикалов, не уступая по выявленному антиоксидантному эффекту индапамиду.
Результаты исследований, изложенные в диссертации, существенную теоретическую значимость: они могут быть использованы при поиске новых противотромботических средств среди новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты.
Еще одним доказательством, подтверждающим необходимость внедрения потенциального антиагреганта в клиническую практику, является его низкая острая токсичность, позволяющая отнести данное вещество к IV классу токсичности.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ Полученные данные позволили выявить среди новых дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты вещества с антиагрегационными свойствами.
измерения уровня концентрации внутриклеточного кальция и метод изучения острой токсичности.
Апробация диссертации
Основные положения диссертации были обсуждены на совместном заседании кафедр фармакологии и клинической фармакологии Московского Государственного медико-стоматологического университета (протокол № 7 от 04.05.2007г. 2007г.)
Публикации Результаты исследований по теме диссертации изложены в 7 печатных научных работах, в том числе 1 работа в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 103 страницах машинописного текста и состоит из введения, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения и выводов, содержит 21 рисунок, 7 таблиц. Список используемой литературы включает 59 отечественных и 106 зарубежных источников.
Материалы и методы исследования
В ходе опытов использовались 78 кроликов, 72 мыши, кровь здоровых доноров и кровь больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Было исследовано 16 химических веществ - производных пиридин-3-карбоновой кислоты. Данные химически чистые вещества были синтезированы старшим научным сотрудником НИИ Фармакологии РАМН Е.А. Кузнецовой и любезно предоставлены для исследований. 13 из них растворимы в Н20 (ИБХФ-21, ИБХФ-22, ИБХФ-24, ИБХФ-20, ИФК-393, ИФК-309, ИФК-367, ИФК-321, ИФК-472, ИФК-366, ЛБК-10, ЛБК-78, ЛБК-
исследования, трех глав собственных исследований, заключения и выводов, содержит 21 рисунок, 7 таблиц. Список используемой литературы включает 54 отечественных и 109 зарубежных источников. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
Выявлено антиагрегационное действие новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты в условиях in vitro;
Доказана высокая специфическая активность наиболее перспективного соединения в условиях перорального введения;
Установлены некоторые аспекты механизма действия нового активного производного пиридин-3-карбоновой кислоты (снижение уровня [Са2+]і в лимфоцитах доноров и подавление активности нейтрофилов как у доноров, так и у больных с острым инфарктом миокарда и гипертонической болезнью II ст.);
Определена высокая острая токсичность (LD50) перспективного антиагрегационного средства.
ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА Для оценки антиагрегационной активности было использовано достаточное количество лабораторных животных. Автором самостоятельно освоены и лично проводились современные методики исследования: метод Борна для исследования агрегации тромбоцитов; метод хемилюминесценции для оценки активности нейтрофилов; метод спетрофлуометрии для измерения уровня концентрации внутриклеточного кальция и метод изучения острой токсичности.
Фармакологическая регуляция повышенной функциональной активности тромбоцитов
К фармакологическим соединениям, ингибирующим образование тромбогенных продуктов метаболизма АА, относятся: Ингибиторы» циклооксигеназы (ЦОГ), которые в зависимости от механизма- действия, делятся на препараты необратимого типа действия; — ацетилсалициловая кислота и обратимые ингибиторы циклооксигеназы [84]: Свойством обратимо, ингибировать тромбоцитарную ЦОГ обладают нестероидные противовоспалительные средства — фенилбутазон,. индометацин, индобуфен; фенопрофен, напроксен. Ингибиторы тромбоксансинтетазы - производные имидазрла дазоксибен, бензидамин, гидроксипростаноевая кислота, препараты: U-51605 Ь-8027. : .: В частности; прием; 500? мг аспирина приводит к инактивации ЦОГ всех циркулирующих тромбоцитов крови. Аспирин инактивирует фермент путем ацетилирования серинового остатка (ser 229); содержащегося; в активном центре ЦОГ [79]!; Поскольку отсутствие ядра не позволяет тромбоцитам ресинтезировать новый фермент, они теряют способность продуцировать эйкозаноиды и прежде всего ТхАг. аспирин также угнетает активность ЦОГ эндотелиальных клеток, но они способны регенирировать новый; фермент в течение нескольких часові, Поэтому идеальная!терапия; аспирином предполагает использование низких доз, при которых ингибируется синтез, ТхАг в тромбоцитах и быстро восстанавливается; первоначальный уровень,ПГІ2 в эндотелии [67, 79-159]. . . . Свойством обратимо ингибировать тромбоцитарную ЦОГ обладают нестероидные противовоспалительные средства - фенилбутазон,. индометацин, индобуфен, фенопрофен, напроксен и др. [102]. К ингибиторам тромбоксансинтетазы относятся производные имидазола: дезоксибен, бензидамин, гидроксипростаноевая кислота, препараты U-51606, L-8027 [49].
Фармакологическая регуляция активности тромбоцитов при мобилизации ионов кальция из внутриклеточных депо включает воздействие на рецепторы ФАТ, ТхАг и внутриклеточный обмен ионов кальция. Этими лекарственными препаратами являются: Антагонисты ФАТ - препараты CV-3988, AG-6-C, AG-10-G -структурные аналоги этого соединения, вещество BN-52021 и кадсуренон -угнетают связывание меченого ФАТ с соответствующим рецептором. Агонисты рецепторов ТхА2 — (З-пиридинил)алканоевые и (арилсульфониламино)алканоевые кислоты, препараты ридогрел, вапипрост, изопростан. Проведенные клинические испытания продемонстрировали эффективность этих классов соединений in vivo при ангиопластике, сахарном диабете, беременности, гипертензии, кардио- и цереброваскулярных заболеваниях, сопровождающихся увеличением продукции тромбоксана. Ингибиторы фосфоинозитидного обмена — соединения лития. rj і Хелаторы внутриклеточного Са" - ВАРТА и ее флуоресцирующие производные Quin-2, Fura-2. Особенно выражены комплексообразующщие свойства у ВАРТА — структурного аналога кальциевого комплексона ЭДТА [50].
Еще одна группа соединений угнетающих агрегацию тромбоцитов -антагонисты кальмодулина - производные 1,4-дигидропиридина, фенотиазина (трифтазин), нафтилсульфонамидов (наиболее активный препарат W-7) - вызывают конформационные изменения в молекуле кальмодулина, нарушая его способность связывать Са . Угнетение функциональной активности тромбоцитов у этих соединений соответствует степени сродства к кальмодулину [29]. Подавлять основную функцию тромбоцитов так же способны следующие лекарственные препараты: Активаторы аденилатциклазы - стабильный аналог простациклина эпопростенол, аденозин, форсколин, ІІГЕь nrD2 [25, 26]. Дипиридамол,. который по механизму действия относится к конкурентным блокаторам захвата аденозина различными типами клеток; он пролонгирует антиагрегационное действие аденозина [42]. ,- . , Активаторы ГЦ - органические нитраты и нитратсодержащие . препараты, такие как нитроглицерин, изосорбид мононитрат, нитропруссид натрия, молсидомин. Этот класс соединений успешно используется- при кардиоваскулярных расстройствах, но концентрация этих препаратов, в, которых они способны ингибировать активность активность тромбоцитов , существенно выше терапевтических и их положительный эффект объясняется скорее вазодилятацией[25, 26, 52]; Для повышения уровня ц АМФ-и подавления активности ФДЭ-цАМФ;. используются; ингибиторы этого фермента - циклостамин, производные ксантина (пентоксифиллин, кофеин, теофиллин) [26, 42]. Конечные этапы активации тромбоцитов, связанные с экспозицией на поверхности тромбоцитов рецепторов фибриногена — гликопротеинового комплекса IIb-ІПа, могут угнетаться тиклопидином . (тиклидом), который ингибирует экспрессию ГИ IIb-ІПа и блокирует . . трансформацию г этого комплексам высокоаффинный 5:лигандсвязывающий: сайт. Действие этого препарата длительно, максимальный эффект достигается через3-7 дней. Кишечные кровотечения, кожные геморрагии и лейкопения ограничивают его применение в клинической практике [125].
К фармакологическим соединениям, ингибирующим дегрануляцию тромбоцитов относятся: Препараты вызывающие деструкцию сократительного аппарата тромбоцитов — винкристин, колхицин, цитохолазин: Селективный антагонист пуриновых рецепторов — ANAAPP3. Блокаторы кальциевых каналов - верапамил, нифедепин, дилтиазем, прениламин [42]. Еще одной группой перспективных антиагрегационных лекарственных препаратов являются блокаторы GP Пв/Ша рецепторов. Учитывая, что конечным этапом агрегации тромбоцитов является активация гликопротеиновых Пв/Ша рецепторов на их ЦПМ, следует отметить, что данные медикаментозные средства ингибируют агрегацию, опосредованную не только ТхА2 или АДФ, но и другими факторами, в частности тромбином. С целью подавления GP ПвЯПа рецепторов используют моноклональные антитела, пептидные и непептидные блокаторы. К первым относят абциксимаб (РеоПро), ко вторым эптифибатид (Интегрилин) и ряд других препаратов, которые не зарегистрированы в России (например, тирофибан) [3, 4, 5, 28, 37, 76,77,78,98, 105, 140,97, 114].
Производные пиридин-3-карбоновой кислоты и ее дериватов. Свойства и применение в медицинской практике
Кроме перечисленных выше препаратов, влияющих на агрегационную активность тромбоцитов, в практической медицине используются комплексные соединения, в состав которых входит пиридин-3-карбоновая кислота [7, 8, 104].
Создание новых лекарственных препаратов, способных восстанавливать нарушенный баланс ТхА2/ПГ12 до нормы, явилось бы значительным достижением в лечении сердечно-сосудистых заболеваний. В этом плане определенный интерес представляет не только пиридин-3-карбоновая кислота, но и ее производные [7, 17, 21, 51, 108].
Рядом исследователей было установлено, что по продолжительности и эффективности антиагрегационного эффекта, пиридин-3-карбоновую-кислоту превосходили два ее производных (никоморфолин и ацетилникотинат). Подавление агрегации тромбоцитов сопровождалось не. только снижением концентрации; малонового диальдегида и» содержания-ТхВ2, но и падением концентрации как внутриклеточного, так и мембраносвязанного кальция. Наряду с этим, возрастало количество циклических нуклеотидов [8].
Так же глубокому изучению подверглось новое производное пиридин-3-карбоновой кислоты 2-метил-З-( 1,4:,5:,6 тетрогидроникотиноил)-пиразоло(1,5-а)пиридин с условным шифром КС-764 [72]. Было выяснено, что в, условиях in vitro по способности ингибировать коллаген-индуцированную агрегацию; его активность превосходила ацетилсалициловую кислоту. КС-764 так же подавлял агрегацию вызываемую арахидоновой кислотой. Данное соединение селективнее, чем АСК, тормозило выработку ТхА2, без влияния на продукцию ПГ12. Дополнительно поведенные исследования КС-764 на модели экспериментального инфаркта миокарда у кролика, вызванного коронарной окклюзией с последующей реперфузией, позволили получить аналогичные данные [103]. Так же снижалась миграция лимфоцитов и уменьшилась зона некроза миокарда [89].
Антиагрегационный эффект был найден еще у одного производного пиридин-3-карбоновой кислоты — ницеритрола, при применении которого угнетались АДФ-, коллаген-, и адреналин-индуцированные агрегации тромбоцитов. Отмечалась значительная коррекция между скоростью-изменения агрегации и уровнем общего холестерола или плазменного LDL-холестерола до и после лечения этим препаратом. Было высказано предположение, что способность ницеритрола подавлять функцию кровяных пластинок, обусловлена не только прямым- воздействием на данные форменные элементы крови, но и за счет снижения атерогенных липопротеидов.
Свойством препятствовать агрегации тромбоцитов так же обладают 3 новых производных дигидропиридина из класса клонистов кальция: (-)-5 Bay К 8644, (+/-)-Bay-W5035 и (+/-)-Вау T500G. Их эффект был связан с 9-І изменением концентрации Са , но не зависел от активности Са-каналов [91]. Публикации в доступной нам литературе свидетельствуют об антиагрегационных свойствах производных пиридин-3-карбоновой кислоты, и позволяют говорить о целесообразности дальнейшего поиска перспективных лекарственных препаратов среди данного класса химических соединений, способных эффективно подавлять функцию тромбоцитов.
Таким образом, создание высокоспецифичных и малотоксичных лекарственных препаратов с использованием производных пиридин-3-карбоновой кислоты является перспективным направлением для создания новых противотромботических медикаментозных средств.
Изучение агрегации тромбоцитов
Исследование агрегации тромбоцитов проводили по методу Born GVR [80, 81, 85]. Принцип этого метода заключается в измерении степени изменения оптической плотности плазмы, богатой тромбоцитами, при добавлении к ней индуктора агрегации. Для получения плазмы, богатой тромбоцитами, кровь брали путем надреза из краевой вены уха кролика, стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9 : 1 и центрифугировали при 200g (1000 об/мин) в течение 10 минут. Верхний надсадочный слой, обогащенный тромбоцитами, отбирали пипеткой с пластиковым наконечником и хранили во время-эксперимента при37 Є в закрытой силиконовой пробирке. Плазма, богатая тромбоцитами, должна содержать, в среднем, 3x10 кровяных пластинок в Л мл . До опыта и в конце его, в каждом образце плазмы подсчитывали количество тромбоцитов. Если она содержала большее количество тромбоцитов, ее разводили до- нужной концентрации плазмой, бедной тромбоцитами, которую получали центрифугированием крови при 650g (3000 об./мин) в течение 10 минут.
Исследование агрегации тромбоцитов проводилось на агрегометре фирмы «Chrono-log» (США). В ходе эксперимента в кювету агрегометра с помощью автоматической пипетки, вводили 490 мкл плазмы, богатой тромбоцитами. Кювету помещали в агрегометр, опускали в нее магнитную мешалку, покрытую тефлоном, и апплицировали одно из изучаемых веществ. Запись агрегатограммы начинали после добавления 10 мкл раствора, содержащего индуктор агрегации (АДФ 10"5 М).
При графической регистрации процесса агрегации тромбоцитов получали кривые, отражающие изменения оптической плотности богатой тромбоцитами плазмы (принимали за 100%), по сравнению с оптической плотностью бестромбоцитарной плазмы (0%).
Изучаемые вещества в различных концентрациях добавляли к плазме за 5 минут до внесения индуцирующего агента (in vitro) или через определенные промежутки времени (30, 60, 120, 180 и 240 минут) после перорального введения животным (in vivo). При анализе кривых учитывали степень изменения оптической плотности плазмы. Результаты выражали в процентах изменения оптической плотности плазмы по отношению к таковым, полученным в опытах без предварительного инкубирования с веществом, или до перорального его введения.
В течение одного эксперимента тестировались два вещества в трех концентрациях или трех дозах на двух образцах плазмы, полученных от двух кроликов каждой серии. Под серией-животных понимается»группа-из трех (in vitro) или- шести (in vivo) особей, на которых исследовалась одна концентрация или доза веществ. Количество использованных кроликов-приведено в таблицах 2 и 3. Контрольные замеры степени агрегации проводили на каждом образце плазмы в начале и. конце эксперимента. В дальнейшем полученные результаты, для каждой концентрации дозы суммировались для нивелирования возможных отклонений активности, вызываемых изменением влажности, температуры окружающей среды и наличием циркадных ритмов у животных [47].
В качестве индуктора агрегации была выбрана АДФ - НПО «Ренам», Россия-(серийный № 0902) - в концентрации 10"-5 М. АДФ является одним из мощных индукторов активации фосфоинозитольного пути освобождения кальция; циклических мононуклеотидов, метаболизма каскада арахидоновой кислоты, вовлечения кальмодулина в процесс реакции высвобождения из тромбоцита, приводящего к агрегации и образованию тромба.
Полученные данные обработаны методами вариационной статистики. Достоверность полученных результатов оценивалась с применением критерия Стьюдента-Фишера. В работе; принят уровень вероятности р 0,05.
Как известно, одной; из главных функций нейтрофилов является фагоцитоз чужеродных, главным образом микробных, и собственных видоизмененных клеток. Для. осуществления завешенного- фагоцитоза, сопровождающегося полным уничтожением патогенных микроорганизмов; фагоциты, в. том:числе нейтрофилы, образуют так называемые активные формы; кислорода: (АФК), к: которым относятся, радикалы кислорода и соединения,, легко превращающиеся в такие радикалы. К радикалам, кислорода относятся супероксид анион (Рі У, гидроксилрадикал (0Н") и-гидроперекиси липидов (R0?); Все эти соединения: имеют на внешней молекулярнойшрбйталиіодин неспаренньїйіэлектрон, что и.определяет их: высокую реакционную способность, приводящую? к: взаимодействию: с: молекулами: клетки: белком; РНК, ДНК и др: В- результате такого1 взаимодействиящроисходит нарушение структуры. макромолекул w потеря их.биологической активности.
Для определения активных радикалов кислорода разработаны чувствительные методы, В: том; числе в наших экспериментах метод, хемилюминисценцииг люминофоров: - соединений-, возбуждающихся в результате взаимодействия; с: радикалами кислорода: и; затем?, люминесцирующих в более длинноволновой области- спектра: при? их рекомбинации; В качестве люминофора использовался: люцигенин-(конечная концентрация люцигенина в пробе составила 20 мкМ). Хемилюмининсценция регистрировалась в виде количества импульсов в минуту на люминометре «Биотокс-7», присоединенном к персональному компьютеру. Запись интегрального сигнала от образца производилась каждые 8 сек. Измеренияпроводятсяпри 25 С. Объем пробы составил 100 мкл, количество нейтрофилов в суспензии - Г млн/мл. В-течение первых пяти минут регистрировалась интенсивность спонтанной хемилюмининсценции, затем к пробе добавлялись исследуемые вещества. Эксперимент проводился на образцах неразведенной периферической цельной- крови здоровых доноров1 и больных, перенесших инфаркт миокарда (3-5 лет заболевания).или гипертоническуюіболезньЛст., взятой? непосредственно перед экспериментом: в шприц; стенки которого предварительно обрабатывались гепарином (500 МЕ/мл): Лимфоциты кровш здоровых донорові выделяли, из обогащенной плазмы, с помощью дифференциального центрифугирования в градиенте плотности феккол-гепак; (удельная плотность 1 ,078 гр/мл) в; течение. 30; минут ;прж 300« об/миш (650» g). Затем? отмытые: дважды;, лимфоциты; с помощью центрифугирования1 помещали; в среду Хенкса; содержащую 10 MMHEPESipH=7,3::
Влияние ИФК-366 на образование радикалов кислорода фагоцитами крови здоровых доноров и больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями (инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь Ист.)
В настоящее время доказано, что окислительный стресс играет важную роль при различных типах патологий, в том числе сердечнососудистой системы. Под окислительным стрессом понимают нарушение динамического равновесия между количеством образовавшихся радикалов кислорода и уровнем элиминированных радикалов, которые образуются в многочисленных реакциях, катализируемых разнообразными ферментами, в том. числе в митохондриях, а так же в цитоплазме почти всех видов клеток человека. Необходимо отметить, что в организме человека существуют высокоспециализированные клетки — фагоциты, которые образуют существенно большие количества активных форм- кислорода (АФК) в процессе «дыхательного взрыва», индуцированного воздействиями внеклеточных агентов. Имея на внешней электронной орбитали один не спаренный электрон, АФК обладают высокой реакционной активностью, и способны изменять активность и структуру практически всех видов макромолекул в і клетках. За нейтрализацию АФК ответственны многочисленные внутри- и внеклеточные защитные, системы, такие как супероксид дисмутаза, каталаза, восстановленный, глютатион, а так же разнообразные антиоксиданты. Поиск веществ, увеличивающих или снижающих содержание АФК, является актуальной-медико-биологической задачей, поскольку позволяет создавать новые лекарственные препараты, регулирующие окислительный стресс при разных типах патологий.
Целью данного раздела работы было изучение влияния ИФК-3 66 на базальный уровень АФК, которые образуются в результате активации нейтрофилов крови, наступающей вследствие их взаимодействия со стенками измерительной кюветы (адгезия), а так же на образование этих радикалов, индуцированное стандартными активаторами таких клеток. В качестве таких агентов применяли формил пептид и форболовый эфир.
Бактериальный трипептид - фрмил пептид (FMKP) и форболовый эфир (РМА) были выбраны в качестве стандартных соединений т.к. они являются одними из сильнейших стимуляторов активности фагоцитирующих клеток (нейтрофилов), и действуют по двум разным механизмам. FMLP может влиять на специфические: рецепторы, экспрессированные в- плазматической мембране фагоцитов, которые функционально сопряжены.с:G-белками, передающими;сигнал:активацит от рецептора на эффекторный фермент-мишень. В- качестве: такого фермента выступает фосфолипаза? С-(3 (PLC-p1); гидролизующая? мембранный? фосфолипид — фосфатидил инозитол дифосфат. В: результате этого процесса в фагоцитах, в, том, числе нейтрофилах образуются:, два-вторичных: мессенджера?— инозитол: трифосфат. (Ins Рз); Яг диацилглицерит (DAG):- Ins Р3 действующий на внутриклеточные кальциевые депо, связано эндоплазматическим ретикулумом; (ER-депо), и вызывает выход ионов Са"+ из депо в цитоплазму клеток.
В отличии от Ins Рз, DAG не выходит из.плазматической мембраны, а влияет на ключевой фермент, ответственный за регуляцию различных клеточных процессов — протеинкиназу Є (PKG). "Этот фермент осуществляет фосфорилирование разнообразных: клеточных белков, .по? остаткам; серина, вследствии чего происходит изменение их структуры, конформации и функциональной: активности. Таким образом, DAG является физиологическим регулятором- PGK. Следует отметить, что в настоящее время описано существование более 10 изоформ PGK, отличающихся по своим свойствам. В том числе по механизмам активации. РМА - универсальный жирорастворимый активатор различных изоформ РСК. Благодаря своей гидрофобности, это соединение проходит через плазматическую мембрану и взаимодействует на ее внутренней поверхности с РСК.
В ряде работ было опубликовано, что максимальное образование радикалов кислорода NAD(P)H оксидазным комплексом фагоцитов происходит при увеличении внутриклеточной концентрации свободных ионов Са2+ ([Ca2+]i) и одновременной активации РСК.
На рис. 12 показано действие ИФК-366 (50 мкМ) на уровень супероксид анион радикалов, индуцированный стандартным стимулятором фагоцитов - форболовым эфиром (РМА, 1 мкМ). В, этой концентрации, ИФК-366 эффективно-снижает содержание АФК в образце цельной крови здорового донора на максимуме ответа клеток на РМА. Такой ингибиторный эффект может быть обусловлен тем, что ИФК-366 возможно обладает антиоксидантными свойствами, или влияет на НАДФН-оксидазный комплекс, встроенный в плазматическую мембрану фагоцитов, подавляя его активность и, тем самым, препятствуя образованию супероксид анионов.
Следует отметить, что ИФК-366 снижает уровень супероксид анион радикалов не только в образцах крови доноров, но и больных сердечнососудистыми заболеваниями. На рис. 13. представлено действие ИФК-366 на фоне активации фагоцитов крови больного острым инфарктом миокарда FMLP (3 мкМ) и РМА (1 мкМ). Базальный уровень, АФК и ответная реакция на стандартные агенты в этом случае были более чем в 20-30 раз выше по сравнению с таковыми клеток донора (рис. 12 и 17): На фоне постоянного увеличения исходного образования радикалов кислорода, обусловленного адгезией фагоцитов крове в кювете, FMLP вызвал достоверное усиление «дыхательного взрыва». Последующее добавление РМА в еще большей степени индуцировало ответную реакцию фагоцитов. После FMLP и РМА, ИФК-366 (50мкМ) провоцировал выраженное снижение уровня АФК. Этот ингибиторный эффект, был сопоставим по амплитуде с действием супероксид дисмутазы.
Таким образом, было установлено, что в концентрациях 50 мкМ и выше ИФК-366 эффективно снижал образование АФК, индуцированное оптимальными дозами стандартных агентов - FMLP и РМА, вызывающими максимально возможный эффект, как у здоровых людей (доноры), так и у больных острым инфарктоммиокарда.
В качестве иллюстрации приводится рис. 14, на котором показано влияние ИФК-366 на спонтанное образование АФК в; образце, цельной крови-больного острым инфарктом миокарда. В этой серии экспериментов ИФК-366 использовали: в. диапазоне концентраций от 1 до 10 мкМ. Установлено, что ИФК-366 (1-2 мкМ) первоначально увеличивало образование супероксид анионов, а затем: вызывало их; выраженное снижение. В; этих условиях происходило подавление ответа: на FMLP и, РМА Для? сравнения ингибиторный эффект ЕК-366 в» отношении последующих добавок РМА и ЕМЬР был более выражен! иог сравнению с действием более низких его;концентрациш
Влияние: ИФК-366 на спонтанный-- уровень супероксид анион-радикалов ;вкрови, больных гипертонической болезнью-II ст., показано на рис. 15. Видно, что и;: в этом случае происходило снижение содержания АФК и подавлялось образование этих: радикалов в ответ на влияние FMLP и РМА. Следует отметить, что индапамид; в этой? серии экспериментов оказывал сходное: ингибйторное: действие на образование АФК, т.е. антиоксидантный;эффект которого уже доказан.
![Поиск новых потенциальных противотромботических средств на экспериментальных моделях с метаболическими нарушениями [Электронный ресурс]](/i/i/4309/204252.png "Поиск новых потенциальных противотромботических средств на экспериментальных моделях с метаболическими нарушениями [Электронный ресурс] Бочарникова Наталья Владимировна")
