Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Актуальность курсового приёма ацетилсалициловой кислоты в клинической медицине 12
1.2. Побочные эффекты ацетилсалициловой кислоты 19
1.3. Перспективы повышения дезагрегантной терапии и коррекции побочных эффектов АСК 28
1.4. Обоснование выбора препарата 33
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Краткая характеристика препаратов 40
2.2. Характеристика экспериментального исследования 40
2.3 Характеристика доклинического исследования 41
2.4. Характеристика клинического исследования 42
2.5. Характеристика лабораторных методов исследования: 43
2.6. Статистическая обработка полученных результатов 46
Глава 3. Влияние курсового введения ацетилсалициловой кислоты и комбинированного введения ацетилсалициловой кислоты и 3-оксипиридина сукцината на динамику показателей гемостаза и некоторых метаболических показателей в эксперименте
3.1. Влияние курсового введения ацетилсалициловой кислоты в дозе 4 мг/кг на некоторые биохимические показатели 49
3.2. Влияние курсового введения ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг на некоторые биохимические показатели 52
3.3. Влияние курсового введения ацетилсалициловой кислоты на некоторые показатели свёртывающей системы крови 57
3.3.1. Влияние курсового введения ацетилсалициловой кислоты в дозе 4 мг/кг на некоторые показатели свёртывающей системы крови 57
3.3.2. Влияние курсового введения ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг на некоторые показатели свёртывающей системы крови 60
3.4. Влияние курсового введения ацетилсалициловой кислоты в дозе 4 мг/кг на некоторые показатели перекисного окисления липидов 62
3.5. Влияние курсового введения ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг на некоторые показатели перекисного окисления липндов 64
3.6. Влияние курсового комбинированного применения ацетилсалициловой кислоты в дозе 4 мг/кг и 3-оксипириднна сукцината в дозе 5 мг/кг на некоторые показатели свёртывающей системы крови 70
3.7. Влияние курсового комбинированного применения ацетил салициловой кислоты в дозе 4 мг/кг и 3-оксипиридина сукцината в дозе 5 мг/кг на некоторые показатели перекисного окисления липидов 72
3.8. Влияние курсового комбинированного применения ацетилсалициловой кислоты в дозе 4 мг/кг и 3-оксипиридина сукцината в дозе 10 мг/кг на некоторые показатели свёртывающей системы крови 74
3.9. Влияние курсового комбинированного применения ацетилсалициловой кислоты в дозе 4 мг/кг и 3-оксипиридина сукцината в дозе 10 мг/кг на некоторые показатели перекисного окисления липидов 76
3.10. Влияние курсового комбинированного применения ацетил салициловой кислоты в дозе 4 мг/кг и 3-оксипиридина сукцината в дозе 10 мг/кг на некоторые биохимические показатели 80
3.11. Влияние курсового комбинированного применения ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг и 3-оксипиридина сукцината в дозе 5 мг/кг на некоторые показатели свёртывающей системы крови 82
3.12. Влияние курсового комбинированного применения ацетил салициловой кислоты в дозе 8 мг/кг и 3-оксипиридина сукцината в дозе 5 мг/кг на некоторые показатели перекисного окисления липидов 83
3.13. Влияние курсового комбинированного применения ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг и 3-оксипиридина сукцината в дозе 5 мг/кг па некоторые биохимические показатели 86
3.14. Влияние курсового комбинированного применения ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг и 3-оксипиридина сукцината в дозе 10 мг/кг на некоторые показатели свёртывающей системы крови 87
3.15. Влияние курсового комбинированного применения ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг и 3-оксипиридина сукцината в дозе 10 мг/кг на некоторые показатели перекисного окисления липидов 90
3.16. Влияние курсового комбинированного применения ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг и 3-оксипиридина сукцината в дозе 10 мг/кг на некоторые биохимические показатели 92
Глава 4. Влияние применения ацетилсалициловой кислоты и комбинации ацетилсалициловой кислоты с 3-оксипиридина сукцинатом на некоторые показатели гемостаза и перекисного окисления липидов условно здоровых добровольцев
4.1. Влияние приёма ацетилсалициловой кислоты в дозе 125 мг/сут на некоторые показатели свёртывающей системы крови 94
4.2. Влияние приёма ацетилсалициловой кислоты в дозе 125 мг/сут на процессы перекисного окисления липидов 96
4.3. Влияние комбинированного приёма ацетилсалициловой кислоты в дозе 125 мг/сут и 3-оксипиридина сукцината в дозе 250 мг/сут на некоторые показатели свертывающей системы крови 99
4.4. Влияние комбинированного приёма ацетилсалициловой кислоты в дозе 125 мг/сут и 3-оксипиридина сукцината в дозе 250 мг/сут на процессы перекисного окисления липидов 103
Глава 5. Влияние дополнительного применения 3-оксипиридина сукцината в комплексной стандартной терапии больных ишемической болезнью сердца на стационарном этапе лечения на некоторые показатели гомеостаза 107
5.1.Влияние комплексной стандартной терапии на некоторые биохимические показатели у больных ишемической болезнью сердца 108
5.2.Влияние комплексной стандартной терапии на некоторые пока затели перекисного окисления липидов крови у больных ишемической болезнью сердца 109
5.3. Влияние комплексной стандартной терапии на некоторые показатели свёртывающей системы крови у больных ишемической болезнью сердца 115
5.4.Влияние комбинированной терапии с дополнительным применением 3-оксипиридина сукцината на некоторые биохимические показатели у больных ишемической болезнью сердца 117
5.5.Влияние комбинированной терапии с дополнительным применением 3-оксипиридина сукцината на некоторые показатели перекисного окисления липидов крови у больных ишемической болезнью сердца 121
5.6.Влияние комбинированной терапии с дополнительным применением 3-оксипиридина сукцината на некоторые показатели свёртывающей системы крови у больных ишемической болезнью сердца 127
Глава 6. Обсуждение полученных результатов 130
Выводы 144
Практические рекомендации 145
Список литературы 147
- Побочные эффекты ацетилсалициловой кислоты
- Характеристика клинического исследования
- Влияние курсового введения ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг на некоторые биохимические показатели
- Влияние курсового комбинированного применения ацетил салициловой кислоты в дозе 4 мг/кг и 3-оксипиридина сукцината в дозе 5 мг/кг на некоторые показатели перекисного окисления липидов
Введение к работе
Проблема ишемической болезни сердца остаётся одной из наиболее актуальных проблем в клинической кардиологии в связи с высокими показателями заболеваемости и смертности. Данная патология занимает лидирующие позиции среди причин стойкой утраты трудоспособности. Важно отметить, что в последние годы наблюдается тенденция к «омоложению» ИБС. Приведённые данные обуславливают важность профилактических мероприятий, что подразумевает воздействие на основные факторы риска.
Первичная профилактика в большей степени является сферой деятельности врача общей практики, специалистов амбулаторно-поликлинического звена и направлена на пропаганду здорового образа жизни. Вторичная профилактика является важной клинической задачей. Она направлена на предотвращение прогрессирования заболевания, возникновения повторных инфарктов. Одним из основных направлений медикаментозной вторичной профилактики ишемической болезни сердца является антитромботическая*. терапия.
Эффективность её была показана в ряде крупных клинических исследований, показавших, что длительный приём антиагрегантных средств снижает риск сосудистых эпизодов на 25%. Наиболее изученным и широко применяемым среди антиагрегантов средством является ацетилсалициловая кислота. Но результаты исследования тромбоцитарного гемостаза свидетельствуют об отсутствии ответа на введение АСК или недостаточное подавление агрегации тромбоцитов у 27-35% пациентов, что обусловило появление понятия «резистентность к аспирину». Путями преодоления которой является увеличение дозы преперата или комбинация его с другими антитромботическими препаратами. В связи с этим продолжаются исследования, направленные на поиск методов, усиливающих эффекты известных дезагрегантов.
В последнее время обращают большое внимание на исследование эффективности комбинированного применения препаратов с антиоксидантным действием и традиционных сердечно-сосудистых препаратов.
Целью работы явилось исследование влияния комбинированного применения ацетилсалициловой кислоты и 3-оксипиридина сукцината на некоторые показатели гемостаза, а также биохимических методов исследования.
В ходе выполнения работы решались следующие задачи:
1. Исследование влияния курсового введения ацетилсалициловой кислоты (АСК) (4 мг/кг и 8 мг/кг) и ее отмены на некоторые биохимические показатели и гемостаз в эксперименте.
2. Оценка влияния комбинации АСК (4мг/кг и 8мг/кг) и 3-оксипиридина сукцината (5мг\кг и 10 мг/кг) на некоторые показатели гомеостаза при курсовом введении и после отмены препаратов в эксперименте.
3. Исследование влияния дополнительного применения 3-оксипиридина сукцината на некоторые показатели гомеостаза на фоне курсового приема ацетилсалициловой кислоты и после ее отмены у здоровых добровольцев.
4. Оценка влияния дополнительного применения 3-оксипиридина сукцината в комплексной терапии на некоторые показатели гомеостаза больных ишемической болезнью сердца.
Научная новизна работы Показано долговременное влияние (до 20 суток) отмены ацетилсалициловой кислоты (4 мг/кг) на некоторые показатели гомео стаза в эксперименте в виде сокращения тромбинового времени, роста степени тромботеста, содержания фибриногена, роста маркеров паракоагуляционных тестов, а также в виде снижения активности трансаминаз. Показано, что при отмене курсового введения АСК в дозе 8мг/кг через 20 суток сохранялся повышенный уровень антитромбина Ш, снижалось содержание фибриногена Б, возрастала активность фибринолиза, не достигая однако исходного уровня, увеличивалось содержание мочевины.
Отмечено, что комбинация ацетилсалициловой кислоты с 3-оксипиридина сукцинатом в эксперименте оказывает большее влияние на гемостаз, чем введе-ние ацетилсалициловой кислоты в виде монотерапии, а кроме того, предотвращает рост маркеров тромбо-геморрагического синдрома и прокоагуляционные сдвиги, наблюдающиеся в отсроченном периоде после отмены препарата.
Отмечено, что дополнительное применение 3-оксипиридина сукцината на фоне приема ацетилсалициловой кислоты здоровыми добровольцами пролонгирует гипокоагуляционный эффект препарата после его отмены.
Научно-практическая значимость: Полученные результаты подтверждают безопасность комбинированного применения ацетилсалициловой кислоты и 3-оксипиридина сукцината, а также указывают перспективы для повышения эффекта терапии и предупреждения прокоагуляционных сдвигов гемостаза в случае вынужденной отмены ацетилсалициловой кислоты.
Результаты исследований внедрены в практическую работу кардиологического отделения и отделения нарушения сердечного ритма МУЗ «Городская клиническая больница №4» г. Саранска. Научные положения, изложенные в работе, включены в программу обучения студентов на кафедрах фармакологии, поликлинической терапии и функциональной диагностики с курсом эндокринологии ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П.Огарева», используются при чтении лекций и проведении практических занятий по теме: «Фармакотерапия ишемической болезни сердца».
Основные положения, выносимые на защиту:
1. При введении в течение 10 суток АСК (4 мг/кг) на фоне гипокоагуля-ционных изменений отдельных показателей гемостаза возрастает содержание продуктов паракоагуляции. Через 20 суток после прекращения введения препарата наблюдаются гиперкоагуляционные изменения гемостаза, сопровождающиеся замедлением фибринолиза и дальнейшим ростом продуктов паракоагуляции. При увеличении дозы АСК до 8 мг/кг не наблюдается роста содержания продуктов паракоагуляции на всех сроках наблюдения, а гиперкоагуляционные изменения изученных показателей гемостаза через 20 суток после прекращения введения препарата менее выражены.
2. Комбинированное применение ацетилсалициловой кислоты и • 3- оксипиридина сукцината усиливает гипокоагуляционный эффект АСК на фоне ее курсового приема, пролонгирует гипокоагуляционное действие и предотвращает гиперкоагуляционные сдвиги показателей гемостаза в сыворотке крови после отмены АСК, корригирует процессы перекисного окисления липидов.
3. Комбинированный прием АСК и 3-оксипиридина сукцината здоровыми добровольцами пролонгирует влияние АСК на показатели гемостаза в отсроченном периоде после отмены препаратов.
4. Дополнительное применение 3-оксипиридина сукцината в комплекс-ной терапии больных ИБС не оказывает влияния на маркеры цитолитического синдрома, содержание мочевины и креатинина, предотвращает сокращение активированного частичного тромбопластинового времени и снижение активности каталазы в крови больных.
Апробация работы Результаты работы были доложены на научно-практической конференции «Современная кардиология: наука и практика» (С.-Петербург, 2007), на юбилейной научно-практической конференции «Неинфекционные заболевания и здоровье населения России» (Москва, 2008), на XIII научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов медицинского факультета Мордовского государственного университета им. Н.П.Огарева «Медицинские проблемы жизнедеятельности организма в норме, патологии и эксперименте» (Саранск, 2008).
По теме диссертационного исследования имеется 6 публикаций, в том числе одна в журнале, рекомендованном ВАК. Структура и объем работы Диссертация изложена на 169 страницах текста компьютерного набора,
Побочные эффекты ацетилсалициловой кислоты
Впервые способность ацетилсалициловой кислоты вызывать патологические изменения слизистой оболочки желудка (СОЖ), принадлежит С. Binz (1893) и датируется 1981 г. В 1938 г. при эндоскопическом исследовании A. Douthwaite и S.Lintott обнаружили, что прием аспирина вызывает развитие геморрагии, эрозий и язв СОЖ. В начале 70-х годов рядом контролируемых исследований была подтверждена способность аспирина вызывать осложнения со стороны желудочно-кишечного тракта. АСК обладает выраженной гастротоксичностью, что является частой причиной возникновения язв, приводя у 70% больных к медикаментозным желудочно-кишечным кровотечениям (Белоусов Ю.Б., 2002; Барышникова Г.А., 2003; Гумеров Р.Х. с соавт., 2003; Российские рекомендации по диагностике и лечению стабильной стенокардии, 2006; Звенигородская Л.А., Бондаренко Е.Ю., 2008; Карпов Ю.А., 2008). По данным Ю.А. Карпова и Е.В. Сорокина (2003) практически в 100% наблюдений развиваются повреждения слизистой гастродуоденальной зоны после однократного приема 650-1300 мг аспирина. G.W. Albers с соавтороами (1998) отмечают, что эрозивно-язвенные поражения желудка и двенадцатиперстной кишки могут возникать даже при приеме небольших доз АСК (150-300 мг/сут). Однако, по данным мета-анализа исследований по вторичной профилактике, применение АСК в дозах 75 мг или 160-325 мг/сут давало даже больший эффект в снижении риска осложнений, чем его использование в дозах 500-1500 мг/сут. (Комаров А.Л., Панченко Е.П, 2003; Карпов Ю.А., Сорокин Е.В.,2003; Лупанов В.П., 2007; Kelly R.V., Steinhubl S. 2005). Механизмы повреждающего действия НПВП активно обсуждаются в литературе.
Обнаружено, что аспирин в дозе 25 мг/кг вызывает 95% ингибирование синтеза простагландинов, при этом повреждений СОЖ не отмечается (Князева С.А., Шилов A.M., 2007;). Парентеральное введение АСК в дозе 100 мг/кг не продуцировало повреждений СОЖ, несмотря на 95% ингибирование ЦОГ. С этим положением согласуются работы других авторов, свидетельствующие, что прямое токсическое действие НПВП на СОЖ связано с местным действием при добавлении к ингибированию циклооксигеназы (Белоусов Ю.Б., 2002; Барышникова Г.А., 2003; Михайлова И.Е., Перепеч Н.Б, 2007). В ответ на длительный прием аспирина у большинства пациентов наблюдается адаптация слизистой оболочки, выражающаяся в уменьшении повреждений, несмотря на продолжающийся приём аспирина (Алёхин Е.К., 1999). По мнению Gum Р.А. (2003) в основе адаптации к АСК лежит местное усиление митотической активности, уменьшение нейтрофильной инфильтрации и улучшение кровотока. Ряд авторов считают, что возможен и второй, «воспалительный» механизм образования НПВП-ассоциированных язв, который связан с «шунтированием» метаболизма арахидоной кислоты на 5-липооксигеназный путь и влечет за собой избыточную продукцию метаболитов липооксигеназной реакции - лейкотриенов, активных хемоаттрактантов, констрикторов капилляров и, соответственно, развитие локальной ишемии (Насонов Е.Л., 1999; Насонов Е.Л., Каратеев А.Е., 2000; Баркаган З.С., Котовщикова Е.Ф., 2004; Аршин Е.В. с соавт., 2007). Кроме того, усиленное генерирование радикалов кислорода вследствие повышенной активности 5 липооксигеназы усугубляет сосудистые нарушения и вызывает клеточные реакции. А. Н. Закирова с соавторами (1996) рассматривают активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ) в качестве одного из ведущих механизмов развития НПВП-индуцированных поражений желудочно-кишечного тракта наряду с дефицитом простагландинов, ответственных за защиту слизистой оболочки. Ю.М.
Петренко с соавторами (1998) установлена способность АСК катализировать окисление закисного железа, сопряженное с генерацией активных форм кислорода. Авторы полагают, что приобретаемая АСК способность генерировать активные формы кислорода происходит за счет образования салициловой кислоты при ее гидролизе и может иметь непосредственное отношение к проявлению и широкого спектра биологической активности и токсических эффектов, сопровождающих ее применение. С другой стороны, НПВП присущи антиоксидантные свойства: АСК подавляет образование малонового диальдегида и повышает активность глутатионпероксидазы (Моругова Т.В., Лазарева Д.Н., 2000). Ю.Б. Белоусов (2002) полагает, что мощное ингибирование АСК периферической циклооксигеназы, снижающее продукцию простагландинов, в конечном итоге приводит к торможению перекисных и свободнорадикальных процессов. Однако в литературе не приводятся сведения относительно дозозависимости антиоксидантних свойств АСК. Побочные эффекты АСК не ограничены ее ульцерогенным действием. Подымова Г.Д. (1998) отмечает, что при использовании 2 г салицилатов в сутки развивается фокальный гепатоцеллюлярный некроз у 2/3 лиц. Стеатоз печени, в том числе развитие синдрома Рейе, был обнаружен у детей, принимавших салицилаты (Венгеровский А.И. с соавт., 2000). Tseeng S., Arora R. (2008) описывают случаи развития острых поражений печени при применении аспирина. Алёхин Е.К (1999), Карпов Ю.А (2007), Brent R.L., Beckman D.A. (1991) отмечают наличие тератогенного эффекта ацетилсалициловой кислоты: аспирин при приеме в первом триместре беременности в 8-14 случаях на 100 наблюдений приводит к расщеплению верхнего неба у плода. Ацетилсалициловая кислота может явиться причиной конъюнктивита, аллергического ринита, синдрома Видаля, гиперэозинофилии.
Причём до 0,5% всех осложнений составляют тяжелые реакции в виде отёка Квинке и анафилактического шока. У 10% больных бронхиатьной астмой аспирин (и другие НПВП) провоцируют бронхоспазм, обусловливая гиперпродукцию лейкотриенов (Карпов Ю.А., 2007; Awtry EH, Loscalzo J., 2000), вызывают развитие ринита и конъюнктивита (Cambria-Kiely JA, Gandhi PJ., 2002). При применении салицилатов может наблюдаться альбуминурия и гематурия (Фармакотерапия, 1996). Ряд авторов отмечает влияние аспирина на функцию почек у больных системной красной волчанкой: после 7 дней лечения аспирином примерно у половины этих больных выявлялось увеличение содержания азота мочевины и креатинина в крови. Показано, что салициловая кислота и индометацин могут накапливаться в клетках проксимальных канальцев, снижать клубочковую фильтрацию пациентов с нарушенной функцией печени (Алёхин Е.К., 1999; Карпов Ю.А., 2007). При регулярном приеме АСК повышает риск развития хронической почечной недостаточности (Карпов Ю.А ., 2007; Elwood Р.С., 2001). В последние годы активно обсуждается проблема резистентности к терапии ацетилсалициловой кислотой, которая характеризуется как неспособность АСК в ряде случаев предупреждать развитие тромботических осложнений, а также адекватно подавлять функцию тромбоцитов по данным тех или иных лабораторных тестов (время кровотечения, оптическая или полуавтоматическая аггрегометрия, определение Р-селектина, метаболитов тромбоксана А2 и т.д.) (Пучиньян Н.Ф. с соавт., 2007; John W. et al., 2003; Michelson AD, et al., 2005; Wang T.H et al., 2006).
Характеристика клинического исследования
Клинические наблюдения проводились на базе кардиологического отделения ГУЗ «Мордовская Республиканская клиническая больница» за 28-больными (10 женщин и 18 мужчин) с диагнозом: ИБС: стенокардия напряжения II-III ф.кл. Гипертоническая болезнь II-III ст., очень высокий риск, СН 2-3 ФК. Средний возраст пациентов составил 54,9±4,8 года. Участники исследования были разделены на 2 группы (сопоставимые по полу, возрасту, сопутствующим заболеваниям): больные 1-й группы получали стандартную терапию. Больным, вошедшим во 2-ю группу, в схему комплексного лечения дополнительно был включен 3-оксипиридина сукцинат (мексидол) 5%-2,0 мл (100 мг) внутривенно ежедневно в течение 10 дней. При поступлении и через 10 дней в динамике оценивалась коагулограмма (АЧТВ, ВР, ТВ, РФМК, АТ-Ш, фибриноген, фибриноген Б, ТТ, этанол-тест), биохимические показатели (общий холестерин (ОХ); 3-липопротеиды (р-ЛП); холестерин липопротеидов высокой плотности (ХсЛПВП), холестерин липопротеидов низкой (ХсЛПНП) и очень низкой плотности (ХсЛПОНП), триглицериды (ТГ), индекс атерогенности (ИА= (ОХ-ХсЛПВП)/ ХсЛПВП), активность аланиновой трансаминазы (АЛТ), аспарагиновой трансаминазы (ACT), содержание мочевины и креатинина), некоторые показатели ПОЛ и антиоксидантной защиты в плазме и эритроцитах (МДА, Fe-МДА, активность каталазы.
Рассчитывались АОА и РЛПО). Нами исследовались следующие показатели гемостаза: активированное частичное тромбопластиновое время, время рекальцификации плазмы, тромбиновое время, определение растворимыхфибринмономерные комплексы, антитромбин Ш, фибриноген, фибриноген Б, тромботест, этанол-тест; и перекисного окисления липидов: МДА плазмы и эритроцитов, Fe МДА плазмы и эритроцитов, каталаза плазмы и эритроцитов. Определение времени рекалыщфикации плазмы по Bergerhoj и Roka Исследование проводят с плазмой, содержащей тромбоциты. Плазму получают из цитратной крови (9:1). В пробирку, установленную на водяную баню при 37С, вводят 0,2 мл 0,277% раствора СаСЬ и 0,1 мл 0,85% раствора NaCl. Через 60 секунд, в пробирку вводят 0,1 мл плазмы и включают секундомер. Определяют время свертывания крови. Определение фибриногена Б в плазме Фибриноген Б представляет собой фибрин-мономеры и их комплексы с фибриногеном. В пробирку вносят 0,5 мл цитратной плазмы добавляют 0,1 мл 2 % раствора Р-нафтола. Пробирку встряхивают и на 10 мин оставляют при комнатной температуре. Чтение результатов: отсутствие частиц - 0; мелкие гранулы (+); мелкие нити и хлопья - (++); грубые нити или небольшой сгусток - (+++); большой сгусток - (++++). Определение антитромбина III В пробирку набирают 0,1 мл рабочего раствора тромбина активностью 35-45 секунд; и добавляют к нему 0,1 мл разведенной в 75 раз испытуемой плазмы. Инкубируют при температуре +37С 2 минуты, добавляют 0,1 мл раствора фибриногена, имеющего комнатную температуру и начинают отсчет времени свертывания. Время свертывания (с) переводят в активность AT III (%) по калибровочному графику. Фибринолиз-тест К 0,5 мл цитратной бедной тромбоцитами плазмы добавляют 7,5 мл дистиллированной воды, 0,25 мл взвеси каолина и 0,18 мл раствора уксусной кислоты, смешивают и инкубируют 30 мин на водяной бане при +37С. Затем смесь центрифугируют 7 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, пробирку опрокидывают на фильтровальную бумагу и осушают в течение 1 мин.
Оставшийся на дне пробирки осадок эуглобулинов разводят внесением 0,5 мл буфера, добавляют 0,5 мл раствора хлорида кальция, осторожно перемешивают покачиванием пробирки (не встряхивая!) и инкубируют на водяной бане при +37с. Образуется сгусток. Регистрируют время с момента добавления хлорида кальция до полного (при +37С) растворения сгустка. Этаноловыи тест (Godal et al., 1971) Обогащенную тромбоцитами цитратную плазму в объеме 0,4 мл смешивают с 0,15 мл 50% раствора этанола, пробирку встряхивают и включают секундомер. Через 10 мин инкубации (при температуре +18...+25С), слегка наклоняя пробирку, в проходящем свете определяют, появился ли в плазме желеобразный сгусток (не хлопья и не крупнозернистые коагуляты). Чтение результатов. При наличии в исследуемой плазме комплексов фибрин-мономера с продуктами фибринолиза и фибриногеном под влиянием этанола образуется желеобразный сгусток. Результат читается точно через 10 мин как положительный или отрицательный. Более позднее образование геля и сгустка не учитывают. При выполнении теста при температуре воздуха выше +26 С результат может быть ложно отрицательным, в связи с чем при высокой температуре воздуха в помещении требуется термостатирование на водяной бане. Фенантролиновый тест (определение растворимых фибрин-мономерных комплексов в плазме крови) При комнатной температуре к 0,1 мл исследуемой бедной тромбоцитами цитратной плазме добавляют 0,1 мл раствора орто-фенантролина.
Включают секундомер и при периодическом покачивании пробирки в проходящем свете от осветителя в течение 60 с отмечают появление зёрен паракоагулята ( в случае положительного результата) или их отсутствие (отрицательный результат). Определение активированного парциального (частичного) тромбопластинового времени К 0,1 мл исследуемой бедной тромбоцитами цитратной плазме, взятой в сухую пробирку, добавляют 0,1 мл АЧТВ-реагента. Пробирку встряхивают и помещают на 3 мин на водяную баню при +37 С. После чего в пробирку добавляют ОД мл раствора хлорида кальция, предварительно подогретого до +37С и включают секундомер. Определяют время свёртывания при периодическом (раз в 1-2 с) покачивании пробирки. Тромбиновое время К 0,2 мл исследуемой бедной тромбоцитами цитратной плазме, прогретой на водяной бане при +37 С в течение 1 мин, добавляют 0,1 мл раствора тромбина (который должен иметь температуру +18...+25С). Включают секундомер и отмечают время свёртывания. Тромботест К 5,0 мл 0,05% раствора СаС1, приготовленного непосредственно перед исследованием, осторожно по стенке пробирки добавляют 0,1 мл исследуемой плазмы. Пробирку помещают на 30 мин на водяную баню при +37 С. Чтение результатов: 1 степень - опалесценция; 2 степень —«пылинки» и мелкие «крупинки»; 3 степень — отдельные хлопья фибрина; 4 степень — нити или волокна фибрина; 5 степень - сетка из нитей фибрина; 6 степень — «мешочек» из нитей фибрина, занимающий весь объём раствора; 7 степень — плотный «мешочек» из нитей фибрина, не отходящий от стенок пробирки.
Влияние курсового введения ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг на некоторые биохимические показатели
На следующем этапе исследования нами была увеличена доза ежедневно вводимой ацетилсалициловой кислоты до 8 мг/кг, что принималось условно соответствующим средней дозе 650 мг на человека весом 70 кг, используемой в клинике. На фоне 10-суточного введения кроликам ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг уровень ACT снизился до 22% (с 0,92±0,06 до 0,21 ±0,03 ммоль/л, Рис. 2. Динамика некоторых биохимических показателей при курсовом введении ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг (в % к исходным данным). Примечание: - достоверность различия р 0,05 по сравнению с исходными данными, # - по сравнению с данными на 10-е сутки эксперимента. Через 20 дней после отмены препарата уровень аспарагиновой трансаминазы несколько возрос и составил 27% от исходного показателя (0,25±0,01 03 ммоль/л, р 0,001), что достоверно не отличается от активности ACT на 10-е сутки введения ацетилсалициловой кислоты, (табл.2). Сходная динамика прослеживалась и в активности АЛТ. Уровень фермента в сыворотке крови кроликов на 10-е сутки введения ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг снизился на 41% - с 0,87±0,07 до 0,52±0,07 ммоль/л (р 0,05). После отмены препарата уровень фермента повысился до 0,64±0,04 ммоль/л, что составило 73% от исходного уровня (р 0,05).На 10-е сутки введения ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг уровень мочевины достоверно не отличался от исходного. Через 20 суток после отмены препарата отмечался рост показателя на 34% (с 4,01±0,14 до 5,73±0,28 ммоль/л, р 0,001) по сравнению с исходом (рис. 2, табл. 2). Не было отмечено достоверных изменений уровня билирубина и креатинина на фоне 10-ти суточного введения ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг.
Таким образом, при 10-суточном введении кроликам ацетилсалициловой кислоты в дозе 8 мг/кг нами отмечено снижение уровней маркеров цитолиза (аланиновой и аспарагиновой трансаминаз) в плазме крови. Имеется тенденция к росту уровня мочевины; уровни креатинина и билирубина достоверно не изменяются. После отмены ацетилсалициловой кислоты в изученной дозе уровень АЛТ и АС і несколько возрастает, так же возрастает и уровень мочевины; показатели билирубина и креатинина по-прежнему достоверно не меняются. При сравнительном анализе влияния курсового введения ацетилсалициловой кислоты в разных дозах (4 мг/кг и 8 мг/кг) можно отметить, что снижение активности ACT было в два раза более выраженным при использовании большей дозы препарата (на 40% и 80% соответственно), аналогичной была и динамика АЛТ (снижение на 18% и 40% соответственно), рис. 3, табл. 3. При использовании ацетилсалициловой кислоты в дозе 4 мг/кг уровень билирубина к 10-м суткам снизился в два раза по сравнению с исходным: с 5,9±1,1 до 3,2±0,48 мкмоль/л (р 0,05), а при использовании большей дозы - 8 мг/кг - показатель по отношению к исходу достоверно не изменялся. При увеличении дозы ацетилсалициловой кислоты до 8 мг/кг содержание мочевины в плазме крови сохранялось на исходном уровне, в то время как на фоне введения ацетилсалициловой кислоты в меньшей дозе показатель на 10 - сутки снижался с 6,2±0,4 до 3,90±0,42 ммоль/л (р 0,05, табл. 3). Сходная динамика наблюдалась в отношении содержания креатинина: при введении кроликам ацетилсалициловой кислоты в меньшей дозе показатель снижался на 30% от исходного уровня, при увеличении ежедневно вводимой дозы препарата до 8 мг/кг содержание креатинина в плазме крови сохранялось на исходном уровне. При сравнении отсроченного действия разных доз ацетилсалициловой кислоты на изученные нами биохимические показатели оказалось, что через 20 суток после курсового введения ацетилсалициловой кислоты в дозах 4 мг/кг и 8 мг/кг уровень ACT и АЛТ сохранялся на уровне 10-х суток эксперимента, содержание креатинина и билирубина не менялось, а мочевины - достоверно возрастало по сравнению с 10-ми сутками введения препарата в обеих дозах.
Причем, при использовании большей дозы ацетилсалициловой кислоты показатель превышал исходный уровень на 34% (р 0,001, рис. 4). Таким образом, курсовое введение ацетилсалициловой кислоты привело к изменению исследуемых биохимических показателей: введение препарата в течение 10 суток в дозе 4 мг/кг приводит к достоверному снижению уровня всех изучаемых показателей. Причем, через 20 суток после отмены ацетилсалициловой кислоты наблюдается дальнейшее снижение показателей активности АЛТ, ACT, содержания билирубина, а уровни креатинина и мочевины восстанавливаются. При увеличении ежедневно вводимой кроликам дозы ацетилсалициловой кислоты до 8 мг/кг нами отмечено более выраженное по сравнению с меньшей дозой снижение уровней маркеров цитолиза (аланиновой и аспарагиновой трансаминаз) к 10-м суткам эксперимента, но уровни мочевины, креатинина и билирубина достоверно не изменяются. При сравнении отсроченного действия ацетилсалициловой кислоты в дозах 4 мг/кг и 8 мг/кг на изучаемые биохимические показатели оказалось, что через 20 суток после курсового введения препарата увеличился уровень мочевины, причем, при использовании большей дозы ацетилсалициловой кислоты показатель превышал исходный на 34% (р 0,001). Остальные же показатели сохранялись на уровне 10-х суток эксперимента. При курсовом 10-суточном введении ацетилсалициловой кислоты в дозе 4 мг/кг время рекальцификации к 10-м суткам эксперимента увеличилось на 14% по сравнению с исходом с 98,2±3,1 до 111,8±1,04 с (р 0,05). Через 20 суток после отмены препарата показатель вернулся к исходному уровню и составил 97,6±0,6 с. При введении кроликам ацетилсалициловой и после отмены препарата активированное частичное тромбопластиновое временя (АЧТВ) не изменялось, (рис. 5).
Влияние курсового комбинированного применения ацетил салициловой кислоты в дозе 4 мг/кг и 3-оксипиридина сукцината в дозе 5 мг/кг на некоторые показатели перекисного окисления липидов
В 3-й экспериментальной серии нами изучалось влияние курсового введения ацетилсалициловой кислоты (4 мг/кг) и 3-оксипиридина сукцината (5 мг/кг) на некоторые показатели перекисного окисления липидов. Так, на фоне 10-суточного введения кроликам комбинации препаратов уровень МДА в плазме крови снизился с 12,7±0,3 до 11,3±0,53 ммоль/л (р 0,05). В отсроченном периоде после отмены АСК и 3-оксипиридина сукцината наблюдалось дальнейшее снижение показателя до 5,1 ±0,7 ммоль/л (рис. 15.табл. 10). Показатель Fe МДА в плазме крови животных при введеним им комбинации препаратов 11-м суткам увеличился с 25,4±1,1 до 67,04±1,5 ммоль/л, р 0,001). После отмены препаратов наблюдалось резкое снижение показателя - на 80 % (р 0,001) - до 14,6=Ы,49 ммоль/л (рис. 15, табл. 10). РЛПО плазмы крови к 10-м суткам эксперимента увеличился с 1,0±0,2 до 4,9±0,2 усл.ед., (р 0,001). Через 20 суток после отмены ацетилсалициловой кислоты и 3-оксипиридина сукцината показатель снизился до 2,00±0,38 усл.ед, составив 200% от исходного уровня (р 0,001), (рис. 15, табл. 10) На фоне комбинированной 10-ти суточной терапии уровень каталазы плазмы крови не изменился. Посче отмены препарата показатель так же остался на прежнем уровне (табл. 10, рис. 15). При введении кроликам ацетилсалициловой кислоты (4 мг/кг) и 3-оксипиридина сукцината (5 мг/кг) к 10-м суткам происходило снижение уровня МДА эритроцитов на 80% (с 101,2±10,4 до 20,8±0,9 ммоль/л, р 0,001). После отмены препаратов уровень показателя возрос (на 22%) составив 45,1±3,4 ммоль/л (р 0,001, pl 0,001) (рис. 16). Через 10 суток введения комбинации препаратов показатель РзМДА в эритроцитах снизился по сравнению с исходом на 20% (с 129,8±12,2 до 105,0±3,4 ммоль/л, р 0,001). Через 20 суток после отмены препаратов уровень РеМДА продолжал снижаться (еще на 20%) , и составил 76,1 ±4,3 ммоль/л (р 0,001, pl 0,001) (рис. 16). Уровень РЛПО эритроцитов к 10 суткам комбинированного введения ацетилсалициловой кислоты и 3-оксипиридина сукцината увеличился с 0,25±0,02 до 0,70±0,07 усл. ед. (р 0,001), что в 2 раза правышает исходный уровень показателя (рис. 16). На следующем этапе работы (4-я серия эксперимента, п4=10) суточная доза вводимого подопытным животным 3-оксипиридина сукцината была увеличена до 10 мг/кг. Доза ацетилсалициловой кислоты составила 4 мг/кг.
Как и в серии с 3-оксипиридина сукцинатом в дозе 5 мг/кг, к 11-м суткам эксперимента отмечено увеличение тромбинового времени с 12,6±0,35 до 13,60±0,36 с, (р 0,05). После отмены препаратов показатель возвращается к исходу, (р 0,05), рис 17. Рис. 17. Динамика некоторых показателей гемостаза при курсовом 10-суточном введении АСК в дозе 4 мг/кг и 3-оксипиридина сукцината в дозе 10 мг/кг. Примечание: - достоверность различия р 0,05 по сравнению с исходными данными, # - по сравнению с данными на 10-е сутки введения препаратов. Остальные исследуемые показатели гемостаза (ВР, АЧТВ, тромботест, фибринолиз-тест) сохранялись на исходном уровне и на 11-е сутки и через 20 суток после отмены комбинации препаратов (рис. 17, табл. 11). В целом при увеличении дозы 3-оксипиридина сукцината с 5 до 10 мг/кг основными отличиями от серии с введением меньшей из изученных доз явилось достоверное увеличение времени рекальцификации, активности антитромбина Ш, снижение содержания фибриногена к 10 суткам комбинированного применения препаратов, а также достоверное снижение АЧТВ и фибриногена в отсроченном периоде наблюдения. В 4-й серии эксперимента нами было изучено влияние курсового введения АСК (4 мг/кг) и 3- с 7,7±0,29 до 4,4±0,2 ммоль/л (р 0,001). В отсроченном периоде после отмены АСК и 3-оксипиридина сукцината наблюдалось повышение показателя до 9,04±0,34 ммоль/л, что превысило исход на 17,4% (р 0,05), (рис. 18.табл. 12.) Показатель Fe МДА в плазме крови животных при введении им ацетилсалициловой кислоты в дозе 4 мг/кг и 3-оксипиридина сукцината (10 мг/кг) 11-м суткам снижается на 12,6% , р 0,05 с 12,7±0,3 до 11Д±0,62 ммоль/л, (р 0,05). После отмены препаратов наблюдался рост показателя — до 17,0±0,62 ммоль/л, что превысило исход на 56% (табл. 12). РЛПО плазмы крови к 10-м суткам эксперимента увеличился в 2,5 раза с 0,65±0,06 до 1,5±0,12 усл.ед., (р 0,05). Через 20 суток после отмены ацетилсалициловой кислоты и 3-оксипиридина сукцината показатель снизился до 0,9±0,049 усл.ед, (р 0,05), (рис. 18, табл. 12). На фоне комбинированной 10-ти суточной терапии активность каталазы плазмы крови снизилась на 16,4% (с 0,9±0,02 до 0,8±0,04 мккат/с-л, р 0,05). После отмены препаратов показатель так же продолжал снижаться до 0,51±0,017 мккат/с-л, (табл. 12, рис. 18).
