Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Кора березы (Betula) как источник биологически активных соединений 12
1.2. Фармакологические свойства бетулина и его производных 13
1.3. Роль монооксигеназной системы печени в метаболизме лекарственных веществ 16
1.3.1 Множественные формы цитохрома Р-450 и метаболизм лекарственных веществ 18
1.4. Процессы гидроксилирования ксенобиотиков и перекисное окисление липидов в микросомах печени 21
1.5. Микросомальная монооксигеназная система печени и метаболизм противоопухолевых препаратов 24
1.6. Фармакологическая характеристика цитостатиков, применяемых в клинической онкологии 27
1.6.1. Алкилирующие противоопухолевые препараты 28
1.6.2. Гормоны как противоопухолевые препараты 29
1.6.3. Противоопухолевые антибиотики 30
1.6.4. Противоопухолевые препараты растительного происхождения 31
1.7. Гепатотоксический эффект цитостатических препаратов 33
Глава 2. Материалы и методы исследования 35
2.1. Лабораторные животные 35
2.2. Условия проведения эксперимента 35
2.3. Материал исследования 37
2.3.1. Получение плазмы крови 37
2.3.2. Получение гомогената печени 37
2.3.3. Выделение микросомальной фракции печени 38
2.4. Экспериментальные модели 38
2.4.1. Моделирование спонтанной индукции перекисного окисления липидов в гомогенате печени 38
2.4.2.Моделирование полихимиотерапии 38
2.5. Оценка активности процессов перекисного окисления липидов 39
2.6. Оценка активности микросомальных ферментов печени 40
2.7. Определение содержания белка 41
2.8. Статистическая обработка результатов 42
Глава 3. Результаты собственных исследований 43
3.1. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на перекисное окисление липидов и антиоксидантный потенциал плазмы крови интактных животных 43
3.2. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на перекисное окисление липидов и метаболизм ксенобиотиков в ткани печени интактных животных 44
3.3. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на активность ПОЛ и метаболизм ксенобиотиков в микросомах печени у интактных животных 47
3.4. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на содержание МДА и антиокислительную активность ткани печени у интактных животных при спонтанной индукции ПОЛ 50
3.5. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на перекисное окисление липидов и антиоксидантный потенциал плазмы крови при экспериментальной полихимиотерапии 54
3.6. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на антиоксидантний потенциал ткани печени при экспериментальной полихимиотерапии 60
3.7. Влияние однократного профилактического введения БК и ее производных на микросомальный метаболизм ксенобиотиков при экспериментальной полихимиотерапии 66
3.8. Влияние однократного профилактического введения бетулоновой кислоты и ее производных на ПОЛ в микросомах печени при экспериментальной полихимиотерапии 69
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 74
Выводы 96
Список литературы 98
- Роль монооксигеназной системы печени в метаболизме лекарственных веществ
- Условия проведения эксперимента
- Оценка активности процессов перекисного окисления липидов
- Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на перекисное окисление липидов и метаболизм ксенобиотиков в ткани печени интактных животных
Введение к работе
Актуальность исследования. Современная фармакология располагает широким набором цитостатических средств, позволяющих проводить эффективное лечение злокачественных новообразований. Однако серьезным ограничением в достижении лечебного эффекта является токсическое действие противоопухолевых препаратов (Гольдберг Е.Д., Карпова Г.В., Колмогорова Л.А., 1991, Кончаловский М.В., 2001, Гольдберг Е.Д. и др. 2003, Зборовский А.Б., Тюренков И.Н., 2003). При использовании комбинации 2-х и более препаратов, с целью повышения эффективности лечения (Дельгадо Ф.Г., 2002, Price F.V. et al., 1993), токсичность полихимиотерапии возрастает (Переводчикова Н.И., Горбунова В.А., 2001, Баранова О.Ю. и др., 2003, Богданов А.Н. и др., 2004, Nakamura S., 1984). Органом, наиболее подверженным токсическому действию цитостатиков является печень (Городецкий В.М., 1998, Ушкалова Е.А., 2003, Моисеев СВ., 2005, Barak A.J. et. al., 1984). В токсическом повреждении печени при полихимиотерапии ведущая роль отводится активации свободно-радикальных процессов окисления, приводящих к снижению антиоксидантной защиты (Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П., 1990, Морозкина Т.С., Суколинский В.Н., Стрельников А.В., 1991, Мишенина СВ., 2002).
Микросомальная монооксигеназная система печени, осуществляющая поддержание метаболического гомеостаза организма путем инактивации ксенобиотиков до безвредных продуктов (Арчаков А.И., 1983, Гуляева Л.Ф. и др., 1994, Щербаков В.М., Тихонов А.В., 1995), определяет способность цитостатиков и продуктов их метаболизма вызывать прооксидантный эффект (Koren G. et al., 1992) в результате синтеза реакционно-способных соединений с гепатотоксическими свойствами (Гуляева Л.Ф. и др., 1994). Поэтому гепатотоксичность цитостатических средств зависит от активности монооксигеназной системы и изменение ее активности меняет токсические и лечебные эффекты цитостатиков (Богуш Т.А. и др., 1995).
Достижение максимальной терапевтической эффективности существующих методов лечения злокачественных новообразований связывают с созданием новых фармакологических средств, блокирующих или замедляющих развитие токсических повреждений, но не снижающих антинеопластических свойств цитостатиков (Гольдберг Е.Д. и др., 1995, Звартау Э.Э., Гнездилова А.В., 2001, Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000, Грек О.Р. и др., 2002, Птушкин В.В., 2004, Hoekman К. et al., 1999).
Многие из существующих гепатопротекторов на сегодняшний день являются препаратами растительного происхождения фенольной природы (Запрометнов М.Н., 1993, Сорокина И.В., Крысин А.П., Хлебникова Т.Б. и др., 1997) и оказываются недостаточно эффективными в условиях противоопухолевой полихимиотерапии (Гольдбер Е.Д., Зуева Е.П., 2000).
В последние годы внимание исследователей привлекают тритерпеноиды лупанового ряда (Толстиков Г.А., и др., 2005, Кузнецова С.А., и др. 2008), наделенные рядом фармакологических эффектов, в том числе, цитотоксическим, в отношении различных опухолей нейроэктодермального происхождения (Kim Darric S.H.L., 1998). Химическая модификация основного представителя тритерпеноидов лупанового ряда -бетулина до бетулоновой кислоты существенно повышает цитотоксическую активность соединения (Ле Банг Шон, Посыпанова Г.А., Колибаба Л.Г и др., 2002), а введение в молекулу бетулоновой кислоты по С-28 атому различных фрагментов является перспективным направлением для создания новых лекарственных препаратов (Сорокина И.В., Жукова Н.А., Волкова Е.Б и др., 2004, Позднякова СВ. и др., 2004, 2005, 2007, Шинтяпина А.Б., и др., 2008).
Таким образом, поиск новых природных соединений среди тритерпеноидов лупанового ряда, изучение их влияния на активность ферментов микросомальной монооксигеназной системы печени и на основные звенья патогенеза токсического эффекта цитостатиков: процессы свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантный потенциал является актуальной задачей теоретической и практической медицины.
Цель исследования: Изучить влияние бетулоновой кислоты и ее аланинамидных производных на антиоксидантныи гомеостаз и метаболизм ксенобиотиков в печени при введении полихимиотерапевтического комплекса цитостатиков в эксперименте.
Задачи исследования:
Изучить влияние бетулоновой кислоты и ее производных на активность процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантныи потенциал плазмы крови и ткани печени у интактных животных.
Исследовать влияние бетулоновой кислоты и ее производных на скорость микросомального TV-деметилирования амидопирина и эритромицина, р-гидроксилирования анилина и активность перекисного окисления липидов микросомальных мембран гепатоцитов у интактных животных.
Оценить дозозависимый эффект профилактического введения бетулоновой кислоты и ее производных на перекисное окисление липидов и антиокислительную активность ткани печени у интактных животных при спонтанной индукции ПОЛ.
Изучить влияние профилактического введения бетулоновой кислоты и ее производных на антиоксидантныи потенциал плазмы крови и ткани печени при экспериментальной полихимиотерапии.
Оценить сравнительную эффективность профилактического введения бетулоновой кислоты и ее производных на скорость микросомального метаболизма амидопирина, эритромицина, анилина и активность процессов перекисного окисления липидов микросомальных мембран гепатоцитов при экспериментальной полихимиотерапии.
Научная новизна
Впервые проведено сравнительное изучение фармакологической активности бетулоновой кислоты и ее аланинамидных производных по влиянию на антиоксидантный гомеостаз и процессы перекисного окисления липидов плазмы крови, ткани печени и мембран эндоплазматического ретикулума гепатоцитов. Выявлен дозозависимый антиоксидантный эффект у бетулоновой кислоты.
Впервые на модели спонтанной индукции ПОЛ показано, что бетулоновая кислота и ее аланинамидные производные оказывают антиоксидантный эффект разной степени выраженности, проявляющийся ингибированием перекисного окисления липидов и повышением антиокислительной активности ткани печени. Наиболее выраженное влияние на антиоксидантный гомеостаз оказывает бетулоновая кислота, 2р-аланин-бетулоновая кислота, метиловый эфир 2р-аланин-бетулоновой кислоты.
Впервые показано, что однократное введение бетулоновой кислоты и 2(3-аланин-бетулоновой кислоты оказывает выраженный индуцррующий эффект на изоформы цитохрома Р-450, ответственные за метаболизм амидопирина, эритромицина и анилина.
Показано, что предварительное введение бетулоновой кислоты и ее аланинамидных производных предупреждает снижение антиоксидантного потенциала плазмы крови и ткани печени, оказывает цитопротекторный и мембраностабилизирующий эффекты, предупреждая инактивацию микросомальных ферментов печени в раннем и отдаленном полихимиотерапевтическом периоде.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные экспериментальные данные существенно расширяют представления о фармакологических эффектах природных тритерпеноидов лупанового ряда как перспективного класса новых лекарственных средств.
Обнаруженные в эксперименте антиоксидантный, мембрано-
стабилизирующий эффекты, лежащие в основе гепатопротекторного
действия производных бетулина (бетулоновой кислоты, 2а- и 2р-аланин-
бетулоновой кислоты, метилового эфира 2а- и 2(3-аланин-бетулоновой
кислоты), открывают перспективы применения их в качестве
гепатопротекторов в программах цитостатической химиотерапии.
Дано обоснование целесообразности применения бетулоновой
кислоты, 2Р-аланин-бетулоновой кислоты, метилового эфира 2{3-аланин-
бетулоновой кислоты как новых природных индукторов микросомальных
монооксигеназ печени при проведении полихимиотерапевтических
программ и других состояниях, сопряженных с депрессией детоксицирующей функции печени.
На основании полученных экспериментальных данных бетулоновая кислота является перспективным препаратом- сопроводительной терапии и как основа для синтеза соединений с новыми фармакологическими свойствами.
Апробация работы:
Результаты исследования докладывались на ежегодных конкурс-
конференциях студентов и молодых ученых НГМУ «АВИЦЕННА»
(Новосибирск 2004, 2005, 2006, 2007, 2008), на Всесоюзной научной
конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы:
фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации (Новосибирск, 2005), на научно-практической конференции с международным участием, посвященной 70-летию НГМА «Медицина и образование в XXI веке» (Новосибирск, 2005), на III Съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на региональной конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007).
Положения, выносимые на защиту:
Полусинтетические тритерпеноиды лупанового ряда (бетулоновая кислота, 2а- и 2Р-аланин-бетулоновая кислота, метиловый эфир 2а- и 2Р-аланин-бетулоновая кислота) оказывают выраженный антиоксидантный эффект, проявляющийся повышением антиокислительной активности и ингибированием процессов пероксидации липидов плазмы крови, спонтанного и индуцированного перекисного окисления липидов ткани печени и мембран эндоплазматического ретикулума гепатоцитов.
Бетулоновая кислота и 2Р-аланин-бетулоновая кислота оказывают индуцирующий эффект на активность микросомальных монооксигеназ печени, повышая каталитическую активность изоформ цитохрома Р-450, катализирующих реакции ТУ-деметилирования и р-гидроксилирования ксенобиотиков.
Профилактическое введение бетулоновой кислоты и ее аланинамидных производных предупреждает сдвиг антиоксидантного гомеостаза и снижение активности микросомальных монооксигеназ печени при экспериментальной полихимиотерапии.
Роль монооксигеназной системы печени в метаболизме лекарственных веществ
Эндоплазматический ретикулум (ЭПР) гепатоцитов располагает набором разнообразных ферментов (микросомальные ферменты), таких как оксидоредуктазы, эстеразы, ферменты биосинтеза белков, липидов, фосфолипидов, липо- и гликопротеинов, желчных кислот, холестерина, простагландинов, а также ферменты биосинтеза парных соединений, эфиров глюкуроновой и серной кислоты. В этой связи ферментам ЭПР отводится важное место в поддержании метаболического гомеостаза организма (Арчаков А.И. 1975, 1983, Арчаков А.И., Андрианов Н.В., Карузина И.И., 1990), а также в детоксикации ксенобиотиков, в том числе и лекарственных веществ (Щербаков В.М., Тихонов А.В., 1995). Поскольку микросомальные оксидоредуктазы способны включать один атом кислорода в молекулу субстрата, а другой восстанавливать до воды, таким образом, выполняя как оксигеназную, так и оксидазную функцию, то такие монооксигеназные ферменты именуют оксидазами смешанных функций (Арчаков А.И. 1975, 1983, Лакин К.М, Крылов Ю.Ф., 1981). В качестве доноров электронов в монооксигеназных реакциях чаще всего выступает НАДФН, реже НАДН, ТГФ или аскорбиновая кислота (Арчаков А.И., 1975, Лакин К.М, Крылов Ю.Ф., 1981). Поскольку в конечном итоге ферментативной реакции создается гидроксильная группа, то такую систему метаболизма нередко именуют микросомальной гидроксилирующей системой (Лукиенко П.И., Заводник Л.Б., Бушма М.И., 1995). В литературе описаны две микросомальные электрон-транспортные цепи: 1) НАДФН-зависимая, состоящая из НАДФН-специфического флавопротеида (именуемым: НАДФН-цитохромом Р450-редуктазой, НАДФН-цитохром С-редуктазой; НАДФН-феррицитохром С-оксидоредуктазой) и цитохрома Р450; 2) НАДФН-зависимая связанная с цитохромом Ь5 (Арчаков А.И. 1975, 1983, Лакин К.М., Крылов Ю.Ф., 1981, Лукиенко П.И., Заводник Л.Б., Бушма М.И., 1995).
К функции ФП относится перенос электронов от НАДФН к цитохрому Р-450 в монооксигеназном окислении ксенобиотиков, причем концентрация свободного внутриклеточного НАДФН выступает лимитирующим фактором (Арчаков А.И., 1975, Лакин К.М., Крылов Ю.Ф., 1981, Coon J.M., 1991). ФП предположительно имеет два центра связывания, один с цитохромом Р-540, другой с цитохромом Ь5, т.к. наблюдаются различные механизмы взаимодействия. Последний также может самостоятельно катализировать некоторые оксигеназные и редуктазные реакции и участвовать в ПОЛ (Арчаков А.И., 1975, 1983, Лакин К.М, Крылов Ю.Ф., 1981, Ляхович В.В., Цирлов И.Б., 1981). Взаимодействует с субстратом окисления и производит реакцию гидроксилирования цитохром Р-450 (Арчаков А.И., 1975, 1983). Спектр катализируемых цитохромом Р-450 монооксигеназных реакций чрезвычайно широк: ароматическое и алифатическое гидроксилирование, TV-окисление, эпоксидирование, диаминирование, дигалогенирование (Арчаков А.И., 1975, 1983). Субстратами окисления выступают как экзогенные, так и эндогенные соединения. Окисление ксенобиотиков, в том числе лекарственных веществ, чаще приводит к обезвреживанию и составляет I этап их катаболизма (Щербаков В.М., Тихонов А.В., 1995). Однако в некоторых случаях с определенными субстратами или при недостатке кислорода на цитохроме Р-450 катализируются реакции восстановления, что приводит к «активации» ксенобиотика с гепатотоксическими и/или канцерогенными свойствами (Morehouse L.A., 1984). Существует множество изоформ цитохрома Р-450, чем объясняется его возможность связывания с различными субстратами (Арчаков А.И., 1975, 1983). Так, в микросомах печени человека обнаружено 24 изоформы цитохрома Р-450 (Shimada Т., 1992). Установлено, что вся множественность носит групповой характер, где одна изоформа может взаимодействовать с группой веществ (Лукиенко П.И, Бушма М.И., 1986). Кроме того, существует значительное субстратное перекрывание между отдельными изоформами (Shimada Т., 1992).
Номенклатура изоферментов цитохрома Р-450, основанная на дивергентной эволюции и нуклеотид/аминокислотной последовательности, по которой название цитохрома отражает семейство, подсемейство и индивидуальные гены, принята и используется с 1987 г. (Гуляева Л.Ф., Гришанова А.Ю., Громова А.О. и др., 1994). Помимо номенклатуры, основанной на структурной гомологии, цитохромы Р-450 подразделяют на конститутивные и индуцибельные формы. Конститутивные изоформы постоянно продуцируются клеткой, находясь под гомеостатическим контролем, они в меньшей степени зависят от субстрата. В отличие от конститутивных, экспрессия индуцибельных изоформ контролируется различными субстратами - ксенобиотиками (Лукиенко П.И., Заводник Л.Б., 1995). Индукция отдельных изоформ представляет собой одно из важнейших свойств цитохромов (Guengerich F.P., 1989, 1991). Считается, что
Условия проведения эксперимента
Работа выполнялась совместно с НИИ органической химии СО РАН им. Н.Н.Ворожцова (лаборатория фармакологических исследований — зав.лаб. - д.б.н. Толстикова Т.Г., лаборатория медицинской химии - зав.лаб.-д.х.н., проф. Шульц Э.Э.) и ЦНИЛ НГМУ (зав.- д.м.н., проф. Мичурина СВ.). Синтез изучаемых соединений проводился из бетулина (3-оксо-20(29)-лупен-28-ол): бетулоновая кислота (БК) - (3-оксо-20(29)-лупен-28-овая кислота) и ее пептидные производные, содержащие у атома С-28: а-аланин - 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-аминопропионовая кислота (БК-2а), метиловый эфир 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-аминопропионовой кислоты (ЭБК-2а) и р-аланин - 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-аминопропионовая кислота (БК-2р), метиловый эфир 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-аминопропионовой кислоты (ЭБК-2р) (Петренко Н.И., Еланцева Н.В., Петухова В.З., 2002). В качестве препарата сравнения использовали дигидрокверцетин (ДКВ), предоставленный той же лабораторией. Исследуемые БК-соединения вводились в виде водно-твиновой взвеси (твин 80) внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг (и 100 мг/кг при изучении дозозависимого эффекта) (Сорокина И.В. и др., 2004) за 6 часов до забора материала. В группах животных, получавших цитостатическую терапию, исследуемые БК-соединения вводились внутрижелудочно в дозах 50 мг/кг (и 100 мг/кг при изучении дозозависимого эффекта) за 6 часов до проведения полихимиотерапии (ПХТ). Эксперименты выполнялись в трех сериях: 1-я серия: Целью данной серии экспериментов было изучение влияния соединений на активность пероксидативных процессов, антиоксидантный потенциал и метаболизм ксенобиотиков у интактных животных. Крысы получали за 6 часов до забора материала (плазма крови, ткань печени, микросомы печени) БК-соединения: БК, БК-2а, БК-2{3, ЭБК-2а, ЭБК-2Р и ДКВ по группам. Контролем служили животные с введением водно-твиновой смеси без БК-соединений; 2-я серия: Целью данной серии экспериментов было сравнительное изучение антиоксидантного эффекта БК-соединений на модели спонтанной индукции перекисного окисления липидов в ткани печени. Крысы получали за 6 часов до забора печени и приготовления гомогената БК-соединения: БК, БК-2а, БК-20, ЭБК-2а, ЭБК-20 и ДКВ по группам.
В качестве группы контроля использовались животные, которым вводилась водно-твиновая смесь без БК-соединений; 3-я серия: Целью данной серии было изучение защитного эффекта соединений при их профилактическом введении на модели полихимиотерапии (ПХТ). Животные за 6 часов перед однократным введением комплекса цитостатических средств получали БК-соединения по группам (БК, БК-2а, БК-2р, ЭБК-2а, ЭБК-23 и ДКВ). Забор материала производился на 7-е и 14-е сутки ПХТ. Контролем служили животные с введением за 6 часов до ПХТ водно-твиновой смеси без БК-соединений. В каждую опытную и контрольную группы методом случайной выборки отбиралось по 6 животных. Кровь забирали после декапитации животных под эфирным наркозом. Плазму крови получали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. Определяли концентрацию альфа-токоферола и ретинола методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе «Милихром» (определение проводилось в лаборатории клинической биофизики ГУ НЦКЭМ СО РАМН, руководитель - проф. Сафронов И.Д.). Концентрацию церулоплазмина в плазме крови определяли по реакции с пара-фенилендиамином, антиокислительную активность (АОА) плазмы оценивали по методу Г.И. Клебанова и др. (1988). Скорость реакций перекисного окисления липидов оценивали по концентрации малонового диальдегида (МДА) в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Steinbrecher U.P., 1990, Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н., 2000). После декапитации животных под легким эфирным наркозом печень отмывали через нижнюю полую вену буферным раствором с содержащий 0Д54М КС1 и 5мМ трис-НС1-буфер, рН=7,4 (Т 0-4С), по окончании перфузии печень приобретала светло-бежевую окраску. Исследуемые образцы измельчали путем продавливания через перфорированный пресс из нержавеющей стали (диаметр отверстий 1 мм). Ткань гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейна с тефлоновым пестиком в течение 45 секунд при 1200 об/мин при 0-4С. В качестве среды гомогенизации использовали охлажденный раствор 0,154М КС1, 5мМ трис-HCl-буфер, рН=7,4. Приготовленный 20% (масса/объем) гомогенат фильтровали через капроновую ткань и использовали для дальнейшего исследования.
Оценка активности процессов перекисного окисления липидов
Активность реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ) изучалась в гомогенате печени в динамике спонтанной индукции и в микросомальной фракции гепатоцитов. Для оценки активности процессов ПОЛ в микросомах печени определяли спонтанное (СПОЛ), аскорбат-зависимое (АЗПОЛ) и НАДФН-зависимое (НЗПОЛ) окисление ненасыщенных жирных кислот микросомальных фосфолипидов по концентрации малонового диальдегида (МДА) в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Steinbrecher U.P., 1990, Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н., 2000). Эксперимент проводился по следующей схеме: в инкубационную среду, содержащую 40 мМ трис-НС1-буфер и 16 мМ MgCL2 (рН=7,4) объемом 0,9 мл вносили 0,1 мл суспензии микросом содержащей 3 мг белка. После этого в смесь добавляли 0,012 мМ FeS04x7H20, 0,2мМ Na4P2O7xl0H2O и 0,8 мМ аскорбата - для аскорбатзависимого или 1мМ НАДФН - для НАДФН-зависимого окисления в конечных концентрациях. Смесь инкубировали 10 мин при 37С в ультратермостате при постоянном встряхивании. Процесс липопероксидации останавливали добавлением 300 мкм ЭДТА в объеме 30 мкл и 0,5 мл 15% ТХУ. После центрифугировали (3000 об/мин — 10 мин) и к 1 мл надосадка добавляли 0,5 мл 0,67% ТБК с последующей инкубацией при 100С в водяной бане 10 мин. В качестве контроля служили образцы с инкубацией без аскорбата или НАДФН -спонтанное ПОЛ. Интенсивность окрашивания определяли на двух длинах волн 532 и 580 нм (специфическое и неспецифическое поглощение соответственно) на спектрофотометре СФ-46. Расчеты проводили с использованием коэффициента молярной экстинкции окрашенного комплекса (156 мМ"1).
Результаты выражали для спонтанного ПОЛ в нмоль/мг белка, для индуцированного ПОЛ - в нмоль/мг белка/мин. В микросомальной фракции печени определяли каталитическую активность изоформ цитохрома Р-450: P450IIC, Р450ША4 и Р450ИЕ1. Каталитическую активность изоформы P450IIC оценивали по скорости метаболизма амидопирина, Р450ША4 — эритромицина, P450IIE1 -анилина (Щербаков В.М., Тихонов А.В., 1995). Регистрировали скорость образования продуктов катаболизма субстратов, характерных для данных изоформ. Скорость катаболизма амидопирина и эритромицина оценивали по скорости образования формальдегида при реакции iV-деметилирования. Количество формальдегида определяли по реакции Nash Т. (Nash Т., 1953). Инкубационная смесь объемом 1 мл содержала 8 мМ амидопирина или 0,05 мг эритромицина, ЗмМ НАДФН, 16 мМ MgCL2, 40 мМ трис-НС1-буфера (рН=7,4) и 3 мг белка микросом. Смесь инкубировали в течение 20 минут при 37С в ультратермостате с доступом кислорода и постоянном встряхивании. Реакцию останавливали 0,5 мл 15% ТХУ и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. 0,25 мл полученного надосадка смешивали с 1 мл реактива Nash, содержащим 2 мМ ацетата аммония, 0,05М уксусной кислоты и 0,02М ацетилацетона. Смесь инкубировалась 45 мин при 37С и постоянном встряхивании. Интенсивность окрашивания раствора определялась на спектрофотометре СФ-46 с длиной волны 412 нм. Каталитическую активность изоформ цитохрома Р-450 рассчитывали по калибровочным кривым известной концентрацией формальдегида, показатели выражали в нмоль НСНО/мин/мг белка микросом. Каталитическая активность изоформы Р450ПЕ1 определялась по скорости /?-гидроксилирования анилина, характерной реакции для данной изоформы цитохрома (Щербаков В.М., Тихонов А.В., 1995).
Оценку р-гидроксилирования анилина оценивали по количеству образовавшегося р-аминофенола (Imai Y., 1966). Инкубационная среда объемом 1 мл содержала 3 мМ анилина, 3 мМ НАДФН и 3 мг микросомального белка. Инкубацию проводили 20 мин при 37С в ультратермостате с доступом к кислороду и постоянном встряхивании. Реакцию останавливали 0,5 мл 15% ТХУ, центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. К 0,5 мл надосадка добавили 1 мл реактива, состоящего из 10% раствора бикарбоната натрия и 2% раствора фенола в 0,2Н растворе NaOH, в соотношении 1:3. Последующая инкубация продолжалась 30 мин при 37С, интенсивность окрашивания определяли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 630 нм. Активность изоформы цитохрома Р-450 рассчитывали по калибровочным кривым известной концентрации р-аминофенола, показатели выражали в нмоль р-аминофенола/мин/мг белка микросом.
Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на перекисное окисление липидов и метаболизм ксенобиотиков в ткани печени интактных животных
Изучение активности процессов ПОЛ в ткани печени показало, что ЭБК-2а и ДКВ ингибировали спонтанное накопление МДА по сравнению с контролем на 28,6 и 21,4% соответственно. Все изученные соединения оказывали выраженный ингибирующий эффект на аскорбат-зависимое ПОЛ, блокируя накопление МДА на 47-82% по сравнению с контролем. Влияние соединений на НАДФН-зависимое ПОЛ было разнонаправленным. Так, при введении БК ферментативное ПОЛ возрастало на 25,5%, а БК-2а, БК-2[3, Примечание. В качестве контроля выступала группа животных с введением водно-твиновой взвеси без БК-соединений. - достоверность различий с контролем, принятым за 100% (р 0,05).. При изучении скорости метаболизма амидопирина, эритромицина и анилина в ткани печени было установлено, что все соединения (за исключением БК) оказывают индуцирующий эффект на изоформы цитохрома Р-450 - Р-450ПС (метаболизм амидопирина) и Р-450ИЕ1 (метаболизм анилина): скорость iV-деметилирования амидопирина возрастала на 41-73%, /7-гидроксилирования анилина — на 27-45% по сравнению с контролем. В то же время изоформа цитохрома Р-450 - Р-450ША4 (метаболизм эритромицина) при введении БК и ДКВ ингибировался на 35% и 25%о соответственно, а при введении БК-2р и ЭБК-2р не отличался от показателей в контроле (Табл. 3). Примечание. В качестве контроля выступала группа животных с введением водно-твиновой взвеси без БК-соединений. Скорость iV-деметилирования амидопирина и эритромицина выражена в нмоль НСНО/мин/мг белка, скорость /7-гидроксилирования анилина - в нмоль /?-аминофенола/мин/мг белка. - достоверность различий с контролем, принятым за 100% (р 0,05). Изучение активности процессов ПОЛ в микросомальных мембранах гепатоцитов интактных животных показало, что все соединения оказывают выраженный ингибирующий эффект на активность спонтанного ПОЛ. Концентрация МДА в микросомах снижалась при введении БК и ее производных, ДКВ на 65-75%. Скорость аскорбат-зависимого ПОЛ все соединения также ингибировали на 17-49%, за исключением БК-20, при предварительном введении которой скорость не отличалась от показателя в контроле. На скорость ферментативного НАДФН-зависимого ПОЛ ингибирующее действие оказывали БК-2р и ДКВ (на 25,6% и 7,4% соответственно).
Ингибирующий эффект у ЭБК-23 отсутствовал, а БК повышала скорость ферментативного ПОЛ на 20,5% по сравнению с контролем (Табл. 4). Оценивая влияние изучаемых соединений на каталитическую активность изоформ цитохрома Р-450 по скорости А -деметилирования амидопирина (изоформа P-450IIC), TV-деметилирования эритромицина (изоформа Р-450ША4) и р-гидроксилирования анилина (изоформа Р-450ПЕ1) был установлен индуцирующий эффект у БК и ее производных - БК-2(3 и ЭБК-2(3. Каталитическая активность изученных изоформ цитохрома Р-450 при однократном введении соединений возрастала на 18-82% от контроля. Менее выраженное индуцирующее действие оказывал ДКВ, который повышал активность только изоформы P-450IIE1, метаболизирующей анилин (на 16,3% от контроля), не влияя на активность других изоформ цитохрома Р-450 (Табл. 5). Примечание. В качестве контроля выступала группа животных с введением водно-твиновой взвеси без БК-соединений. - достоверность различий с контролем, принятым за 100% (р 0,05). Для сравнительной оценки антиоксидантной эффективности изучаемых соединений использовалась модель спонтанной индукции ПОЛ (инкубация гомогената печени при 37 С, постоянном встряхивании и заборе проб в нулевой точке, через 60 мин и 120 мин инкубации). Исследование антиоксидантного эффекта изучаемых соединений показало, что все БК-соединения ингибировали накопление МДА на 53-77% через 60 мин спонтанной индукции. Ингибирующий эффект сохранялся и через 120 мин индукции ПОЛ, когда уровень МДА оставался ниже на 49-74% по сравнению с контролем. Сравнительная оценка антиоксидантной активности бетулоновой кислоты и ее альфа- и бета- производных показала, что выраженным антиоксидантным эффектом обладает ЭБК-2а, которая ингибирует образование МДА в ткани печени на 28,5% в нулевой точке, на 77,3% и 74% соответственно через 60 мин и 120 мин индукции ПОЛ по сравнению с контролем. Ингибирующий эффект ДКВ сравним с таковым ЭБК-2а — концентрация МДА была ниже на 21% в нулевой точке, и на 68% и 74% соответственно через 60 мин и 120 мин спонтанной индукции ПОЛ. Менее выраженный антиоксидантный эффект по сравнению с другими изученными БК-соединениями обнаружен у ЭБК-2р\ Ингибирующий эффект данного соединения наблюдался только до 60 мин спонтанной индукции ПОЛ, когда концентрация МДА оставалась ниже показателя в контроле на 53% и не отличался от контрольных значений через 120 мин индукции ПОЛ (Табл. 6). Изучение дозозависимого эффекта бетулоновой кислоты и ее альфа-производных показало, что увеличение дозы бетулоновой кислоты до 100 мг/кг повышает антиоксидантную активность данного соединения. БК в дозе 100 мг/кг ингибировала образование МДА в нулевой точке по сравнению с дозой 50 мг/кг на 15,4%, через 60 мин индукции - на 43% и через 120 мин -на 32%. При введении БК-2а в дозе 100 мг/кг дозозависимого эффекта не выявлено. Ингибирующий эффект сохранялся на прежнем уровне. При увеличении дозы ЭБК-2а до 100 мг/кг антиоксидантный эффект нивелировался и был существенно ниже по сравнению с эффектом бетулоновой кислотой (в дозе 50 и 100мг/кг) и ее производным БК-2а и ДКВ (Табл. 7).
