Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 9
1.1 Механизмы развития окислительного стресса и его роль в патогенезе токсических поражений печени 9
1.2 Механизм действия флавоноидов и их применение при токсических поражениях печени 28
Выводы по обзору литературы 39
Список сокращений 40
Глава 2 Материалы и методы исследования 41
2.1 Характеристика объектов исследования 41
2.2 Лабораторные животные и экспериментальные модели 42
2.3 Постановка опытов и основные экспериментальные серии 43
2.3.1 Изучение влияния флавоноидов на интенсивность перекисного окисления ли-пидов и антиоксидантную систему печени в условиях острого ССІ4-гепатоза 43
2.3.2 Изучение влияния флавоноидов на продукцию N0 44
2.3.3 Изучение влияния флавоноидов на интенсивность перекисного окисления ли-пидов и антиоксидантную систему печени при курсовой алкоголизации 44
2.3.4 Изучение влияния курсового введения флавоноидов на интенсивность перекисного окисления липидов и антиоксидантную систему печени у здоровых животных 45
2.3.5 Изучение влияния флавоноидов на ферменты микросомальной системы, состояние митохондриальных процессов и энергообмена в печени при остром ССЦ-гепатозе 45
2.3.6 Изучение влияния флавоноидов на ферменты микросомальной системы, состояние митохондриальных процессов и энергообмена в печени при курсовой алко-голизаии 45
2.3.7 Изучение влияния курсового введения флавоноидов на ферменты микросо мальной системы, состояние митохондриальных процессов и энергообмена в печени у здоровых животных 46
2.3.8 Определение острой токсичности 46
2.3.9 Обоснование выбора доз исследуемых веществ 47
2.4 Методы исследования 47
2.4.1 Оценка поражения печени по биохимическим показателям 47
2.4.1.1 Определение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови 47
2.4.1.2 Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови 47
2.4.1.3 Определение содержания общего билирубина в сыворотке крови 47
2.4.1.4 Определение содержания триглицеридов в сыворотке крови и печени 47
2.4.1.5 Определение содержания фосфолипидов в печени 48
2.4.1.6 Определение содержания гликогена в печени 48
2.4.1.7 Определение содержания глюкозы в сыворотке крови 48
2.4.2. Оценка интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) 48
2.4.2.1 Определение содержания ТБК-активных продуктов в сыворотке крови 48
2.4.2.2 Определение содержания ТБК-активных продуктов в гомогенате печени 49
2.4.2.3 Определение содержания диеновых конъюгатов в гомогенате печени 49
2.4.2.4 Определение интенсивности спонтанного и индуцированного ПОЛ 49
2.4.3. Оценка состояния эндогенной антиоксидантной системы 50
2.4.3.1 Определение активности супероксиддисмутазы 50
2.4.3.2 Определение активности каталазы 50
2.4.3.3 Определение содержания восстановленного глутатиона в печени 51
2.4.3.4 Определение активности глутатионпероксидазы в печени 51
2.4.3.5 Определение активности глутатион-Б-трансферазы в печени 51
2.4.3.6 Определение НАДФ+-редуктазной активности печени 52
2.4.3.7 Определение активности глутатионредуктазы в печени 52
2.4.3.8 Определение общей антиокислительной активности сыворотки крови 52
2.4.4 Оценка резистентности биомембран и окислительно-восстановительного баланса тиолов 53
2.4.4.1 Определение активности кислой фосфатазы в сыворотке крови 53
2.4.4.2 Определение интенсивности спонтанного и перекисного гемолиза эритроцитов 53
2.4.4.3 Определение активности 5'-нуклеотидазы в постъядерной фракции печени 53
2.4.4.4 Определение активности фосфолипазы Аг в сыворотке крови 54
2.4.4.5 Определение содержания общих, белковых и небелковых сульфгидрильных (SH-) групп в гомогенате печени 54
2.4.5 Оценка активности ферментов микросомальной системы печени 54
2.4.5.1 Определение N—деметилазной активности 54
2.4.5.2 Определение n-гидроксилазной активности 55
2.4.5.3 Изучение активности оксидоредуктаз с добавлением акцепторов электронов: феррицианида калия, неотетразолия синего 55
2.4.5.4 Определение активности глюкозо - 6 - фосфатазы 55
2.4.6 Оценка интенсивности митохондриальных процессов в печени 56
2.4.6.1 Определение активности сукцинатдегидрогеназы 56
2.4.6.2 Определение активности цитохром-с-оксидазы 56
2.4.6.3 Определение М2+-АТФазной активности 57
2.4.7 Оценка показателей энергетического обмена в печени 57
2.4.7.1 Определение содержания глюкозы в печени 57
2.4.7.2 Определение содержания пировиноградной кислоты в печени 57
2.4.7.3 Определение содержания молочной кислоты в печени 58
2.4.7.4. Определение активности лактатдегидрогеназы в печени 58
2.4.7.5 Определение содержания АТФ в печени 58
2.4.8 Определение содержания NO-радикалов методом ЭПР 58
2.4.9 Выделение постъядерной, микросомальной и митохондриальной фракций печени 59
2.4.10 Определение антиоксидантной активности индивидуальных флавоноидов в модельной системе 60
2.5 Статистическая обработка результатов эксперимента 60
2.6 Используемые реактивы 61
Глава 3 Влияние флавоноидов на развитие окислительного стресса в условиях острого поражения печени тетрахлорметаном 62
3.1 Влияние флавоноидов на интенсивность перекисного окисления липидов и антиоксидантную систему при остром CCU — гепатозе у крыс 62
3.2 Влияние флавоноидов на митохондриальные процессы, микросомальную систему и энергообмен в печени при остром CCU - гепатозе у крыс 72
3.3 Сравнительная оценка гепатозащитной активности флавоноидов при остром ССІ4 - гепатозе 82
Выводы по главе 3 86
Глава 4 Влияние флавоноидов на развитие окислительного стресса при курсовой алкоголизации у крыс 88
4.1 Влияние флавоноидов на биохимические показатели состояния печени, интенсивность перекисного окисления липидов и антиоксидантную систему при курсовой алкоголизации у крыс
4.2 Влияние флавоноидов на митохондриальные процессы, микросомальную систему и энергообмен в печени при курсовой алкоголизации у крыс 100
4.3 Сравнительная оценка гепатозащитной активности флавоноидов при курсовой алкоголизации у крыс 109
Выводы по главе 4 114
Глава 5 Влияние флавоноидов на механизмы, участвующие в развитии окислительного стресса при курсовом введении здоровым животным 116
Выводы по главе 5 128
Глава 6 Изучение антиоксидантного и антирадикального действия гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина 129
Выводы по главе 6 137
Общие выводы 13 8
Список литературы 13 9
- Механизм действия флавоноидов и их применение при токсических поражениях печени
- Лабораторные животные и экспериментальные модели
- Влияние флавоноидов на митохондриальные процессы, микросомальную систему и энергообмен в печени при остром CCU - гепатозе у крыс
- Влияние флавоноидов на митохондриальные процессы, микросомальную систему и энергообмен в печени при курсовой алкоголизации у крыс
Введение к работе
Актуальность работы. Окислительный стресс, как возникающий дисбаланс в системе «прооксиданты-антиоксиданты», является важным патогенетическим фактором развития многих заболеваний, в т.ч. токсических поражений печени, рост которых отмечается в последние годы [68].
Для терапии различных заболеваний печени используется довольно разнообразный арсенал лекарственных препаратов, среди которых выделяют сравнительно небольшую группу гепатопротекторов (легалон, силибор, катерген, эссенциале) [10], но эффективность их действия не всегда оказывается достаточной [6,87,145]. Большинство из них относится к зарубежным лекарственным препаратам, а на долю отечественных гепатопротекторов приходится всего 23% [159].
В то же время, опубликованы многочисленные данные по гепатозащитному действию флавоноидов, благодаря проявлению ими антиоксидантных и антирадикальных свойств, а также способности усиливать систему эндогенной антиоксидантной защиты (АОЗ) [47,113, 203, 235].
Однако проблема применения антиоксидантов для коррекции свободно-радикальных патологий далека от разрешения. Это связано с тем, что активные формы кислорода (АФК) являются важными внутри- и межклеточными регуляторами. Кроме того, показано существование в организме механизмов саморегуляции редокс-баланса, изменения которого влияют на метаболическую активность, дифференциацию и пролиферацию клеток [ПО]. В связи с этим возникает необходимость изучения возможности воздействия на процессы избыточной липопероксидации не только путём ингибирования свободно-радикального окисления, но и индукции других сопряжённых компонентов клеточной защиты (энергообмена, систем де-токсикации).
Поэтому весьма актуальным является комплексное изучение влияния флавоноидов на механизмы развития окислительного стресса при заболеваниях печени для патогенетического обоснования их применения в качестве гепатозащитных средств.
Цели и задачи исследования. Целью исследования является комплексное изучение влияния флавоноидов растительного происхождения на механизмы, принимающие участие в развитии окислительного стресса при токсических поражениях печени.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
- провести сравнительное изучение антиоксидантного действия гесперидина, диосми-на, флавицина и кверцетина на модельной системе in vitro;
- изучить влияние гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина на процессы пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ), систему АОЗ организма при остром ССІ4-гепатозе и алкогольном поражении печени;
- изучить влияние гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина на показатели энергетического обмена и митохондриальное окисление при остром ССЦ-гепатозе и алкогольном поражении печени;
- изучить влияние гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина на ферменты метаболизма ксенобиотиков при остром ССІ4-гепатозе и алкогольном поражении печени;
- изучить влияние гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина на механизмы адаптации к окислительному стрессу у здоровых животных;
- изучить влияние гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина на продукцию N0 в норме и при индукции окислительного стресса CCU;
- провести сравнительное изучение гепатозащитного действия гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина при остром ССЦ-гепатозе и алкогольном поражении печени.
Научная новизна. Проведено сравнительное изучение гепатозащитной активности и влияния гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина на развитие окислительного стресса при токсических поражениях печени. Показано, что исследуемые флавоноиды обладают гепатопротекторными свойствами. Установлено, что флавицин оказывает более выраженное гепатозащитное действие, чем кверцетин, являющийся одним из самых сильных антиокси-дантов прямого действия.
Впервые показано, что флавицин обеспечивает наиболее эффективную защиту от окислительного стресса при действии ССЦ и алкоголя путём поддержания активности естественной антиоксидантной системы (АОС) организма, корригирующего действия на дыхательную цепь митохондрий, энергетический обмен, а также обеспечения сбалансированной и согласованной работы систем детоксикации как в условиях ингибирования (под действием CCU), так и в условиях индукции (под действием этанола) микросомальной монооксигеназ-ной системы.
Установлено, что в опытах на животных гесперидин, диосмин, флавицин и кверцетин уменьшают ССІ4-индуцированную продукцию N0, а введение гесперидина повышает его содержание в норме. Выявлено, что курсовое введение исследуемых флавоноидов оказывает стимулирующее влияние на глутатионовую систему на уровне ферментов, принимающих участие в генерации восстановленного глутатиона (ГР, НАДФ -редуктаза) и выполнения им защитных функций (Г-S). Их применение повышает содержание белковых SH-групп в печени, участвующих в механизмах неспецифической резистентности и адаптации организма к экстремальным факторам среды.
Практическая значимость работы. На основании экспериментальных исследований доказано, что флавицин из Vicia truncatula при остром поражении печени СС1(1 и этанолом обладает наиболее выраженной гепатозащитной активностью, что обосновывает перспективность дальнейшего более расширенного его изучения с целью создания нового лекарственного средства для профилактики и терапии заболеваний печени.
Уровень внедрения полученных результатов. По данным, полученным автором, подготовлены информационные письма, материалы которых включены в план НИР кафедр технологии лекарств (акт внедрения от 03.09.2007 г.), органической химии (акт внедрения от 07.09.2007 г.) и фармакологии (акт внедрения от 29.08.2007 г.) Пятигорской ГФА Росздрава.
Связь с планом НИР ГОУ ВІЮ «Пятигорская ГФА Росздрава». Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава» (номер государственной регистрации 01.2001.17645).
Положения, выдвигаемые на защиту:
1. Результаты исследований по изучению антиоксидантной активности гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина в системе in vitro и влиянию на продукцию NO в норме и при CCU-гепатозе.
2. Данные по влиянию гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина на про-/антиоксидантное равновесие, энергетический обмен и детоксикационную функцию печени при остром ССІ4-гепатозе, алкогольной интоксикации и у здоровых животных.
3. Обоснование эффективности гепатозащитного действия гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина при остром ССЦ-гепатозе и алкогольной интоксикации.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы изложены на 59-й, 60-й и 61-й научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск 2004, 2005, 2006 гг.), на десятой Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2005 г) и на международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2006 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 12 в центральной печати.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 160 страницах текста компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения (4 главы), общих выводов, списка литературы, приложений А и Б (37 страниц). Работа иллюстрирована 24 таблицами и 56 рисунками. Библиографический список включает 270 источников, из которых 99 публикации иностранных авторов.
Механизм действия флавоноидов и их применение при токсических поражениях печени
В 1814 году впервые был получен флавоноид, названный кверцетином и имел жёлтую окраску. На сегодняшний день из растений выделено и охарактеризовано более пяти тысяч флавоноидов. Они широко представлены в овощах, фруктах, цветах, стеблях и корнях растений. В основе этих веществ лежит молекула флавана, имеющая два бензольных (А и В) и одно кислородосодержащее гетероциклическое пирановое кольцо (С-кольцо).К флавонои-дам относятся катехины, антоцианы, лейкоантоцианы, производные флавона, изофлавона, флавонона, флавонола, а также халкона и дигидрохалкона.
Флавоноиды проявляют антирадикальное и антиокислительное действие. Они активны в отношении радикалов, возникающих как в липидной, так и в водной фазах, и ингиби-руют процессы ПОЛ на стадии инициации, взаимодействуя с АФК Ог", НО-, Ог, НОСІ, Н2О2 и на стадии продолжения цепи, выступая донорами атомов водорода для липидных радикалов LO , LO2. Структурный анализ и экспериментальные данные свидетельствуют о прямой взаимосвязи между антиоксидантной эффективностью флавоноидов и количеством феноль-ных ОН — групп в их молекулах. Соединения с тремя и более ОН-группами проявляют большую антирадикальную активность, чем аскорбиновая кислота. Флавононы и флавоны, содержащие от 2 до 6 ОН-групп в 2-4 раза превосходили тролокс по способности ингибировать перекисные радикалы. Среди разных по структуре флавонов в системе индуцированного ионами Fe окисление микросом печени крыс наибольшей антирадикальной активностью обладали соединения, имеющие ОН-группы в СЗ -, С4 - и С5 положениях. Наличие гидрокси-ла в положении СЗ было важным для угнетения индуцированного окисления липосом. ОН-радикалы, возникающие при разложении Н2О2 в присутствии ионов меди, флавоноиды перехватывали менее эффективно, чем тролокс; для антирадикалыюй активности существенным было присутствие ОН-групп рядом с гидроксилом в положении С4 , при этом наличие или отсутствие двойной связи С2-СЗ не было значимым [110]
Многочисленные экспериментальные исследования в водных системах позволили выявить следующие наиболее важные для антирадикальной активности структурные элементы молекул флавоноидов: 1) две ОН-группы в положениях С3 -С4 , 2) двойная связь, между 2 и 3 атомами углерода, желательно совместно с карбонильной группой в положении С4 3) ОН-группы в положениях СЗи С5 совместно с карбонильной группой. В молекулах флавоноидов ОН-группа в положении С4 представляет собой предпочтительную мишень для радикальной атаки, при этом наличие ОН-группы у СЗ облегчает отрыв атома водорода. Соединения, имеющие карбонильную группу в положении С4 и ОН-группы в положении СЗ и С5 (рутин, кверцетин), эффективно связывают ионы железа и ингибируют образование радикалов в реакциях разложения гидроперекисей [ПО]. Наличие гидроксильной группы в СЗ положении также оказывает стабилизирующее действие на структуру молекулы флавоноида. Анализ взаимодействия флавоноидов различной структуры с синглетным кислородом показал, что для физического тушения !02 важно наличие катехоловой структуры в В-кольце; в то же время как химическое связывание Ог происходит преимущественно по положению СЗ, и на его эффективность существенно влияет наличие в этом положении гидроксильного заместителя.
Во многих исследованиях in vitro у флавоноидов выявляется как антиоксидантный, так и прооксидантный эффект, особенно в присутствии ионов металлов переменной валентности [190]. Так, морин и нарингенин индуцировали окисление липидов в изолированных ядрах из печени крыс, а также вызывали образование сшивок в ДНК [255]. Усиление флаво-ноидами ( кверцетин, мирицетин, кемпферол), окислительного повреждения ДНК в изолированных ядрах печени крыс может быть связана со снижением содержания в ядрах глутатиона и Г-S [256]. Несмотря на высокую антиоксидантую активность, кверцетин индуцирует повреждение ДНК и обладает мутагенной активностью. Прооксидантные и антиоксидантные свойства флавоноидов во многом зависят от их растворимости, соотношения окислителей и восстановителей в среде, наличия металлов переменной валентности, рН среды и многих других факторов [243]. Если в присутствии органических перекисей флавоноиды подавляют индуцированное Си + окисление липопротеинов, то в присутствии перекиси водорода они проявляют себя преимущественно как прооксиданты и усиливают окисление. При этом про-оксидантная активность флавоноидов так же, как в случае ингибирования ОН-радикалов и перекисных радикалов, прямо зависит от наличия ОН-заместителей PI двойной связи С2-СЗ между кольцами А и В [190]. Нужно отметить, что структурные закономерности, установленные для флавоноидных соединений in vitro, довольно часто рознятся с теми антиоксидантними эффектами, которые наблюдаются in vivo [245,252]. Причинами этого могут быть различная биодоступность и метаболические превращения, которым подвергаются флаво-ноиды в кишечнике [184,197,240,247,259].
Отдельные структурные элементы молекул флавоноидов могут проявляться по-разному также в зависимости от экспериментальной системы. Например, З -О-метилкверцетин обладает большей антиоксидантной активностью, чем кверцетин в системе Fe2+ -АДФ-индуцированного ПОЛ в митохондриях мозга [205], взаимодействие гидратиро-ванных электронов, возникающих под действием радиации или УФ-лучей, определятся преимущественно наличием кетогруппы в положении С4, а присутствие ОН-групп и наличие двойной связи не оказывает существенного влияния на скорость реакции [154]. Рутин и кверцетин более эффективно по сравнению с лютеолином ингибировали Си +-индуцированное окисление липопротеидов низкой плотности, однако в отношении индуцированного метгемоглобином окисления липопротеидов наибольшую эффективность проявлял лютеолин [183]. В гетерофазных системах (клетки, липопротеиды) эффективность флавоноидов во многом определяется их липофильностью и гидрофильностью. В экспериментальной системе окисления рапсового масла при 105С мирицетин проявлял значительно более выраженную активность, чем кверцетин, но в другой модельной системе (окисление липидов мембран эритроцитов) эффективнее был кверцетин, что связывается с его большей липофильностью [179]. Таким образом, на сегодняшний день, трудно делать однозначные выводы о взаимосвязи между структурой и активностью, тем более что результаты, полученные in vitro, не согласуются с результатами in vivo [194,203,235,240,253].
Следует сказать, что до сих пор не получено убедительных данных о доминирующей антиоксидантной активности флавоноидов in vivo. По этому вопросу в литературе имеются противоречивые сведения. Например, показано, что 3 месячное введение антоцианов снижает содержание ТБК-активных продуктов [177], потребление рутина и байкалина с пищей улучшает антиоксидантную систему печени (гомогенат печени крыс значительно тормозит индуцированное ПОЛ) [181], а диета, обогащенная флавоноидами значительно увеличивает активность СОД эритроцитов [232]. В то же время приводятся данные, что диета, богатая флавоноидами, не вызывает каких-либо изменений в биомаркерах оксидативного повреждения [203], что черный чай повышает устойчивость сыворотки человека к ПОЛ in vitro, но не in vivo [194]. Несмотря на то, что экстракт из яблок, содержащий кверцетин, рутин, катехин, дигидрохалконы и др. in vitro увеличивал латентную фазу ПОЛ (т.е. проявлял антиоксидант-ное действие), употребление яблок здоровыми пациентами не дало эквивалентного эффекта in vivo. Авторы [211] считают, что для доказательства проявления антиоксидантного действия in vivo необходимо использовать различные модели оксидативного стресса (модели различных заболеваний, в основе развития которых лежит оксидативное повреждение) и наиболее чувствительные и специфические биомаркеры оксидативного стресса - маркеры повреждения липидов, белков и ДНК [203]. С этой точки зрения в пользу проявления антиоксидант-ных свойств флавоноидов in vivo свидетельствуют данные о том, что применение полифенолов чая тормозило карциногениндуцированное повреждение ДНК и повышало устойчивость липопротеинов к окислению ex vivo на модели атеросклероза [211]. Введение кверцетина в течение 3-х недель увеличивало антирадикальную активность печени при CCU-индуцированном фиброзе [196] и приводило к значительному снижению образования кислородных радикалов и продуктов ПОЛ при вирусной легочной патологии [206].
Лабораторные животные и экспериментальные модели
Исследования проведены на 307 белых беспородных и линии Wistar половозрелых крысах обоего пола массой 170-250 г. и 80 белых мышах обоего пола массой 25-30 г., содер жащихся в стандартных условиях вивария Пят ГФА и государственного учреждения «Российского кардиологического научно- производственного комплекса Минздрава РФ» г. Москва в условиях естественной смены дня и ночи. Модель острого ССЦ -гепатоза воспроизводили путём введения per os с помощью зонда 3 раза через день 50% раствора ССЦ в вазелиновом масле в дозе 0,15 мл/100 г массы тела [35]. Курсовую алкоголизацию проводили путём 2-х кратного внутрибрюшинного введения 33% раствора этанола в сутки в дозе 0,75 мл/100г массы тела животного в течение 7 дней [145]. антиоксидантную систему печени в условиях острого ССЦ -гепатоза
Изучение влияния гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина на интенсивность перекисного окисления липидов и антиоксидантную систему печени было проведено на 48 половозрелых крысах обоего пола, массой 180-200 г. в марте-апреле 2004 г. на модели острого ССЦ-гепатоза при их лечебно - профилактическом введении. Кверцетин использовали и в качестве вещества сравнения с хорошо изученной и достаточно высокой антиоксидантнои активностью. Исследуемые соединения вводили в дозе 100 мг/кг в виде водной суспензии перорально за 7 дней до введения ССЦ, а затем совместно с ССЦ. Животные получали вещества утром до кормления, в одно и тоже время. В случае совместного применения веществ и ССЦ, вещества вводили за 1 час до использования гепатотоксина. Контролем служили животные, получавшие такой же объём растворителя. Забой животных проводили путём дека-питации под лёгким эфирным наркозом через сутки после последнего введения ССЦ. Одновременно проводили забой интактных животных, голодавших в течение 12-14 часов. Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию ТБК-активных продуктов в печени и сыворотке крови, диеновых конъюгатов (ДК) в печени, интенсивности спонтанного (ПОЛИ) и индуцированного (ПОЛІ) перекисного окисления в постъядерной фракции печени (ПФП). Оценку антиоксидантнои системы (АОС) проводили путём определения активности в ПФП каталазы, СОД, глутатион-Б-трансферазы (Г-S), глутатионперок-сидазы (ГП): общей, Se-зависимой и Se-независимой, НАДФ+-редуктазы при использовании в качестве субстратов малата, глюкозо-6-фосфата и изоцитрата, содержанию глутатиона восстановленного (GSH) в печени и по общей антиокислительной активности (АОА) сыворотки крови. Для оценки окислительно-восстановительного баланса тиолов в печени измеряли ко личество белковых, небелковых и общих SH-групп. В качестве показателей деструктивного действия свободно-радикального окисления на мембраны измеряли активности 5 -нуклеотидазы в ПФП, кислой фосфатазы (КФ) и фосфолипазы Аг (ФЛ А2) в сыворотке крови и интенсивность спонтанного гемолиза эритроцитов по Ягеру.
Опыты проведены на 55 крысах - самцах линии Wistar, массой 230-250 г. в ноябре 2004 г. и апреле 2005г. в г.Москве на базе ГУ РКНПК Минздрава России в лаборатории физико-химических методов исследования отдела биохимии НИИЭК.
Изучено влияние флавоноидов на содержание радикалов NO методом ЭПР при использовании Ре3+ДЭТК2 и Fe +"(МГД)г в качестве ловушек в норме и после индукции ПОЛ ССІ4. Интактным животным вводили растворённые в воде компоненты ловушки радикалов оксида азота -диэтилдитиокарбамат натрия (ДЭТК, 620 мг/кг массы тела) внутрибрюшинно и FeS04 -7 Н2О (25 мг/кг массы тела) с цитратом натрия (125 мг/кг) подкожно. Через 30 мин после этого животных декапитировали под лёгким эфирным наркозом и извлекали печень. Комплексы двухвалентного железа с-Ы-метил-В,Ь-глюкаминдитиокарбаматом (Fe3+-MGD2 -избирательная водорастворимая ловушка NO) растворяли в 0,9% растовре хлорида.натрия и вводили интактным животным внутривенно (хвостовая вена) в дозе 100 мг/кг массы тела животного, соотношение МГД : FeS04-7H20 10:1. Животные контрольной группы получали ССЦ путём однократной внутрибрюшинной инъекции в дозе 2,5 мл/кг [76]. Биофлавоноиды животные получали в дозе 100 мг/кг за 3 дня до ССІ4, а затем совместно с ним, курсовое введение составило 5 дней. Через 24 часа после последнего введения ССІ4 (контроль) или совместно с биофлавоноидами (опыт) животным вводили компоненты ловушки и через 30 мин декапитировали (в случае использования Fe ДЭТК2), либо собирали мочу объёмом 150-300 мкл, которую сразу же замораживали в жидком азоте (в случае применения Ре3+(МГД)2)). Регистрацию спектров ЭПР образцов печени и мочи проводили на спектрометре Х-диапазона типа Е-109Е фирмы "Varian" (США) при температуре жидкого азота или комнатной температуре соответственно.
Опыты проведены на 48 крысах-самках массой 220-240 г. в период с февраля по апрель 2005 г. Использование в эксперименте именно крыс-самок обусловлено тем, что содержание воды на 1 кг массы тела у особей женского пола меньше, чем у самцов, поэтому равные дозы алкоголя оказывают у самок более выраженные токсические эффекты [62]. Геспе ридин, диосмин, флавицин и кверцетин вводили перорально в дозе 100 мг/кг за 5 дней до введения спирта этилового, затем совместно с этанолом. Для оценки интенсивности ПОЛ и антиоксидантного статуса использовали те же показатели, что и в 2.3.1 , и дополнительно изучали активность глутатионредуктазы (ГР) в ПФП.
Опыты проведены на 48 крысах обоего пола массой 170-190 г. в октябре-ноябре 2005 г. В течение 12 дней опытные животные получали гесперидин, диосмин, флавицин и кверцетин в дозе 100 мг/кг перорально, в виде водной суспензии. Контролем служила группа животных, которым вводили такой же объём растворителя. Через сутки после последнего введения веществ проводили забой животных опытных и контрольной групп путём декапитации под лёгким эфирным наркозом и проводили изучение показателей, как и в 2.3.3. Дополнительно к спонтанному был исследован также перекисный гемолиз эритроцитов.
Опыты проведены на 36 крысах обоего пола массой 190-210 г. в мае-июне 2004 г. Постановка опыта аналогична описанной в 2.3.1. Влияние диосмина, гесперидина, флавицина и кверцетина на ферменты микросомальной системы оценивали по НАДН:Кз[Те(СМ)б]-редуктазной, N-деметилазной, n-гидроксилазной активностям в микросомальной фракции печени. Состояние митохондриальных процессов и энергообмена оценивали по активностям Mg 2+ -АТФ-азы, сукцинатдегидрогеназы (СДГ), цитохром-с-оксидазы (ЦО) в митохондри-альной фракции печени, содержанию глюкозы, гликогена, пирувата, лактата, АТФ и активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в гомогенате печени. Параллельно регистрировали интенсивность спонтанного и индуцированного ПОЛ в микросомальной и митохондриальной фракциях печени.
Опыты проведены на 36 крысах-самках массой 210-230 г. в марте-апреле 2006 г. Постановка опыта аналогична, описанной в 2.3.3. В микросомальной фракции печени изучали N-деметилазную, п-гидроксилазную, НАДН: Кз[Ре(СЫ)б]- и НАДФН: неотетразолий (НТ) -редуктазные активности. В митохондриальной фракции печени измеряли активности СДГ, ЦО, Mg 2+-АТФ-азы. Помимо этого, в качестве показателей, отражающих состояние энерге тического обмена, измеряли содержание глюкозы, гликогена, пирувата, лактата и АТФ в гомогенате печени и активность ЛДГ в постмитохондриальной фракции печени. Параллельно регистрировали интенсивность индуцированного ПОЛ в микросомальной и митохондриаль-ной фракциях печени.
Влияние флавоноидов на митохондриальные процессы, микросомальную систему и энергообмен в печени при остром CCU - гепатозе у крыс
Ряд исследователей считают, что важным моментом в развитии патологий, связанных с окислительным стрессом, в т.ч. и токсических гепатитов, является повреждение энергетического аппарата клетки, что приводит к ещё большей интенсификации ПОЛ и формированию порочного круга [25,78]. Кроме того, необходимо учитывать изменение состояния системы микросомальных монооксигеназ, усиление или угнетение активности которых может оказывать существенное влияние как на продукцию свободных радикалов, так и на нейтрализацию токсических веществ, т.е. в целом на развитие и исход окислительного стресса, осо бенно в тех ситуациях, когда его причиной является действие ксенобиотиков (например, ССЦ).
В связи с этим, проведено изучение активности некоторых митохондриалышх ферментов, микросомальной монооксигеназной и редуктазной цепей окисления, содержания основных метаболитов и субстратов энергообмена в печени при лечебно-профилактическом введении гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина на фоне острого ССЦ -гепатоза с одновременным измерением интенсивности ПОЛ в митохондриальной и микросомальной фракциях печени. В митохондриальной фракции измеряли активность Mg +-АТФазы, [ДО и СДГ, в микросомальной фракции - N-деметилазную, п-гидроксилазную и НАДН-феррицианид-редуктазную активности, в гомогенате печени определяли содержание гликогена, глюкозы, ТРГ, лактата, пирувата и их соотношение и содержание АТФ, а также в гомогенате печени измеряли активность ЛДГ.
Как видно из данных, представленных на рисунке 3.2.1 и в таблице А.5 приложения А при ССЦ -гепатозе наблюдалось уменьшение примерно в равной степени содержания в печени гликогена и глюкозы (на 46% и 45% соответственно), резкое повышение лактата на 423%, снижение пирувата на 50%, в результате чего соотношение лактат/пируват увеличилось до 25,5 (+880% от интактного уровня). Одновременно в гомогенате печени регистрировалось достаточно выраженное повышение (+73%) активности гликолитического фермента ЛДГ, осуществляющего превращение пирувата в лактат. На 50% уменьшилось содержание в печени АТФ, и также отмечалось повышение содержания ТРГ по сравнению с нормой в 5 раз или на 389%.
При этом в митохондриальной фракции печени (рисунок 3.2.2, таблица А.5 приложения А) было выявлено снижение активностей СДГ (-70%) и ЦО (-71%), принимающих участие в работе II и IV белково-липидных кластеров дыхательной цепи и генерации разности электрических потенциалов, необходимой для образования АТФ протонной АТФ-синтетазой. Вероятно, именно вследствие недостаточности образующегося потенциала из-за нарушения переноса электронов по дыхательной цепи митохондрий, при ССЦ -гепатозе Н+ -АТФ-синтетаза начинает работать как Н -АТФаза, активность которой в наших опытах была увеличена на 247% (рисунок 3.2.2, таблица А.5 приложения А). Интересно, что в условиях развития гепатоза интенсивность ПОЛ I и ПОЛ II в митохондриальной фракции печени была снижена по сравнению с нормой на 53% и 56% соответственно.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что при ССІ4 -гепатозе происходит нарушение аэробного пути образования энергии, падение активности ферментов дыхательной цепи и снижение интенсивности процесса окислительного фосфорилирования в митохондриях. Одновременно происходит резкая активация анаэробного пути окисления, а именно активация гликолиза и гликогенолиза, но поскольку анаэробный путь значительно менее энергетически выгоден, в печени падает содержание АТФ (количество АТФ в 2 раза меньше, чем в норме), т.е. идёт развитие энергодефицита.
Нужно сказать, что полученные нами данные согласуются с результатами исследований и других авторов. Так, показано [83] снижение скорости дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях гепатоцитов при токсическом ССЦ -гепатите, а также установлена активация гликолитического пути окисления при поражении печени ССЦ [28] Сдвиг энергообмена в печени в сторону анаэробиоза при токсическом поражении печени ССЦ с нашей точки зрения может быть связан с развитием гипоксического состояния в органе, о чём свидетельствует увеличение коэффициента соотношения лактат/пируват и является адаптационно-компенсаторной реакцией, а также с мехмбраноповреждающим действием ССЦ и нарушением работы митохондриальной дыхательной цепи, где протекает процесс окислительного фосфорилирования.
Помимо выявленных сдвигов в энергообмене при остром ССЦ -гепатозе нами установлены выраженные изменения и в работе системы микросомальной монооксигеназы, а именно снижение скорости окислительного N-деметилирования (-53%) и скорости гидрокси-лирования анилина (-63%) в монооксигеназной цепи микросом, что может быть свидетельством деградации тех или иных изоформ цитохрома Р450 [24,120]. В то же время отмечался значительный рост по сравнению с нормой (на 229%) НАДН-феррицианид-редуктазной активности, относящейся к быстрым реакциям окисления, что можно расценивать, по-видимому, как компенсаторную реакцию в ответ на падение скорости окисления в монооксигеназной цепи.
Под влиянием диосмина, флавицина и кверцетина содержание лактата в печени уменьшилось в большей мере (на 33%, 57% и 67% соответственно), хотя и не достигло нормальных величин, зато содержание пирувата полностью нормализовалось, особенно выраженное его увеличение по отношению к контролю наблюдалось при применении флавицина (+239%), что оказалось даже выше нормы на 83%, поэтому соотношение лактат/пируват у животных, получавших диосмин и кверцетин, было несколько выше нормы (8,6 и 5,3 соответственно), а у животных, получавших флавицин, - это соотношение составило 3,2, т.е. практически такое же, как в норме (рисунок 3.2.4. таблица А.5 приложения А). Вследствие этого, можно заключить о практически полном снятии гипоксии и заметном» снижении анаэробного гликолиза при введении данных флавоноидов, что подтверждалось понижением активности в печени гликолитического фермента (ЛДГ) на 32%, 35% и 24% при введении диосмина, флавицина и кверцетина соответстственно (рисунок 3.2.5, таблица А.5 приложения А).
Влияние флавоноидов на митохондриальные процессы, микросомальную систему и энергообмен в печени при курсовой алкоголизации у крыс
Как видно изданных, представленных на рисунке 4.2.1 (таблица А. 10 приложения А), при курсовой алкоголизации у крыс наблюдалось снижение по сравнению с интактными животными содержания в печени пирувата (-49%) и повышение содержания лактата (+199%), вследствие чего отношение лактат/пируват увеличилось на 464% (т.е. в 5,6 раза), возросла активность ЛДГ, измеренная в постмитохондриалыюй фракции печени, на 319% (т.е. в 4,2 раза). Одновременно наблюдалось снижение содержания в печени гликогена (-55%) и глюкозы (-52%), значительное повышение содержания в ней ТРГ (+267%, в 4 раза) и падение на 59% содержания в печени АТФ.
Изменение активности ферментов микросомального окисления этанола при курсовой алкогольной интоксикации показано на рисунке 4.2.3. Как следует из рисунка 4.2.3, в микросомальнои фракции печени отмечалось достоверное повышение по сравнению с интакт-ными животными НАДФН-НТ-редуктазной и N-деметилазной активностей на 57% и 145% соответственно при одновременном снижении НАДН-феррицианид-редуктазной и п-гидроксилазной активностей на 26% и 65% соответственно (рисунок 4.2.3, таблица А. 17 приложения А).
Примечание - ПОЛ 1 - интенсивность индуцированного ПОЛ в микросомальнои фракции печени Возможно, в силу того, что под влиянием поступления этанола наблюдалось усиление электрон-транспортной активности в НАДФН -зависимой монооксигеназной цепи микросом и индукция определённой изоформы цитохрома Р 450, активность НАДН-редуктазной цепи (а именно НАДН-цитохром bs -редуктазы) была снижена, а также уменьшилась возможность участия других изоформ цитохрома Р 450 в метаболизме, о чём свидетельствует выявленное в нашем опыте снижение п-гидроксилирования анилина (субстрата II типа).
Интересно, что при ССІ4 -гепатозе было выявлено угнетение НАДФН-зависимых реакций микросомального окисления и повышение активности НАДН- цитохром bs -редуктазы, а при курсовой алкогольной интоксикации получены противоположные изменения: активация НАДФН-зависимой редокс-цепи и угнетение НАДН- зависимой цепи транспорта электронов в мембранах эндоплазматического ретикулума, что, вероятно, связано с существующими различиями в метаболизме ССІ4 и этанола. При этом на фоне курсовой ал 94 когольной интоксикации также, как и при ССІ4 -гепатозе, интенсивность Fe -аскорбат-индуцированного ПОЛ в микросомальной фракции печени была достоверно ниже, чем в норме, на 44%, что, вероятнее всего, обусловлено снижением содержания фосфолипидов -основных субстратов ПОЛ (рисунок 4.1.1, таблица А.6 приложения А).
При лечебно-профилактическом применении исследуемых флавоноидов в условиях курсовой алкогольной интоксикации была значительно снижена интенсивность анаэробного пути окисления углеводов и наблюдались восстановительные процессы в митохондриях печени. Как показано на рисунке 4.2.4 (таблица АЛО приложения А), под влиянием флавицина и кверцетина в печени полностью нормализовалось содержание лактата (достоверное снижение по сравнению с контролем на 67% и 76% соответственно) и содержание пирувата (достоверное увеличение по сравнению с контролем на 170% и 82% соответственно), под влиянием диосмина отмечалось снижение лактата на 66% (до уровня нормы) и повышение пирувата на 52%, но оно не достигло интактных значений, под влияниехМ же гесперидина содержание лактата снижалось в наименьшей степени (-58% по отношению к контролю), содержание же пирувата оставалось таким же низким, как и у контрольных животных, что отмечалось и на фоне ССЦ-гепатоза (глава 3.2). В связи с этим соотношение лактат/пируват восста 103
повилось в наибольшей степени у животных, получавших флавицин и кверцетин (1,9 и 2,0 при его значении в норме 2,8) и в наименьшей степени у животных, получавших гесперидин (6,9), а у крыс, которым вводили диосмин данное соотношение оказалось равным 3,6.
При этом в печени под влиянием флавицина и диосмина полностью нормализовалось содержание гликогена, увеличившись по отношению к контролю на 96% и 71% соответственно, но при введении гесперидина и кверцетина оно было достоверно ниже, чем у интакт-ных крыс и не отличалось от контрольных значений. При введении всех изучаемых флаво-ноидов оставалось сниженным содержание глюкозы в печени, и у тех групп, которые получали, диосмин, флавицин и кверцетин, оно достоверно не отличалось от контроля, а у животных, получавших гесперидин было даже ниже, чем в контроле на 51% (рисунок.4.2.4, таблица АЛО приложения А). Активность гликолитического фермента ЛДГ, компенсаторное увеличение которой отмечалось при алкогольной интоксикации, под влиянием применения гесперидина и диосмина снижалась на 68% и 75% соответственно до нормальных значений, уменьшая скорость превращения пирувата в лактат, увеличенную в контроле, вследствие чего снижалось и количество молочной кислоты в печени у животных, получавших данные флавоноиды. Интересно, что у животных, получавших флавицин и кверцетин, активность ЛДГ бьша достаточной высокой (выше нормы на 68% и 195% соответственно) и у них же отмечался довольно значительный рост пирувата (+170% и +82% соответственно) и наиболее выраженное снижение лактата (-67% и -76% соответственно) в отличие от нелеченных животных, у которых при увеличенной активности ЛДГ на 319% по отношению к норме наблюдался рост лактата (+199%) и снижение пирувата (-49%) в печени. Известно, что реакция, катализируемая ЛДГ, является обратимой и в зависимости от метаболической ситуации данный фермент может осуществлять как превращение пирувата в лактат, так и наоборот, последнее, вероятно, и наблюдалось под влиянием флавицина и кверцетина (была активирована работа фермента, направленная на усиление образования пирувата из лактата). Одновременно у всех опытных групп отмечалась полная нормализация содержания ТРГ в печени, которые снижались под влиянием гесперидина на 65%, диосмина - на 80%, флавицина - на 83% и кверцетина - на 82% по отношению к контролю.
