Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Клиническое использование препаратов цитокинов и их влияние на систему цитохром Р450-зависимых монооксигеназ
1.1. Цитокины и их клиническое использование 12
1.2. Цитохром Р450-зависимые монооксигеназы 21
1.3. Влияние цитокинов на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы 25
Глава 2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Иммунологические методы 34
2.1.1. Оценка гемограммы 34
2.1.2. Получение суспензий из лимфоидных органов 34
2.1.3. Анализ клеточного цикла и апоптоза тимоцитов и спленоци-тов 34
2.1.4. Гистоморфологические лимфоцитов периферической крови 35
2.2. Гистоморфологические методы 38
2.3. Получение субмитохондриальной фракции печени 39
2.4. Определение монооксигеназных активностей по скорости биотрансформации проб-субстратов 37
2.4.1. Определение дибензилфлюоресцеин дебензилазной (ДБФД) активности
2.4.2. Определение эритромшат-И-деметилазной (ЭРНД) активности 38
2.4.3. Определение этоксирезоруфин-О-деэтилазной (ЭРОД) активности 39
2.4.4. Определение р-нитрофенол-гидроксилазной (ПНФГ) активности 39
2.5. Определение уровня билирубина 40
2.6. Определение активности аланинаминотрансферазы 40
2.7. Определение уровня малонового диальдегида (МДА, тиобарби-туровая кислота - реагирующие продукты) в 812-фракции гомогенатах печени 40
2.8. Статистическая обработка результатов 41
Глава 3. Результаты исследования и их обсуаедение
3.1. Гематологические и иммунотропные эффекты ронколейкина у крыс 42
3.1.1. Гематологические показатели при введении ронколейкина крысам в различных дозах и режимах 42
3.1.2. Пролиферативпая активность и апоптоз клеток лимфоид-ных органов крыс при введении ронколейкина в различных дозах 48
3.1.3. Структура субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови крыс и экспрессия а-цепи рецептора ИЛ-2 (CD25) при введении ронколейкина 53
3.2. Влияние ронколейкина на гистологическую структуру печени крыс и конститутивные монооксигеназные активности в субми-тохондриалыюй фракции гомогенатов печени
3.2.1. Гистологическая структура печени и некоторые функциональные показатели при введении ронколейкина в различных дозах 56
3.2.2. Копституитивные монооксигеназные активности печени при введении ронколейкина
3.2.2.1. Влияние ронколейкина на окислительный метаболизм этоксирезоруфина 65
3.2.2.2. Влияние ронколейкина на окислительный метаболизм дибензилфлюоресцеина 61
3.2.2.3. Влияние ронколейкина на окислительный метаболизм эритромицина 68
3.2.2.4. Влияние ронколейкина на окислительный метаболизм р-нитрофенола 69
3.2.3. Гепатотропные и иммунотропные эффекты ронколейкина в условиях индукции токсического поражения печени 75
3.2.4. Компьютерная программа прогноза изменений биотрансформации фармакологических препаратов в условиях комплексной цитокино- и фармакотерапии 81
3.2.4.1. Краткое описание программы 82
3.2.4.2. Ход работы с программой 83
Заключение 87
Выводы 93
Список использованной литературы
- Влияние цитокинов на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы
- Определение монооксигеназных активностей по скорости биотрансформации проб-субстратов
- Гематологические показатели при введении ронколейкина крысам в различных дозах и режимах
- Гепатотропные и иммунотропные эффекты ронколейкина в условиях индукции токсического поражения печени
Введение к работе
Актуальность работы.
В настоящее время значительно возрос интерес исследователей и врачей клинической практики к препаратам рекомбинантных цитокинов. Это обусловлено углублением понимания регуляторной роли цитокинов не только в рамках функционирования иммунной системы, но и всего организма, а также прогрессом в области получения рекомбинантных цитокинов и высокой эффективностью цитокинотерапии при лечении злокачественных опухолей, вирусных инфекций, иммунодефицитных состояний [Симбирцев, 2002; Rouveix et al., 2000; Jonasch et al., 2001].
Участие цитокинов в сложной цепи нейроиммуноэндокринной регуляции гомеостаза, плейотропность биологической активности обусловливает то, что их введение, помимо основного иммунотропного фармакологического эффекта, сопровождается побочным действием — изменением функциональной активности других систем организма (нервной, эндокринной, сердечнососудистой и пр.) [Симбирцев, 2002; Черешнев и соавт., 2002]. Одним из свойств цитокинов является способность изменять (как правило, угнетать) экспрессию и активность цитохром Р450-зависимых монооксигеназ печени и других тканей, - ключевой ферментной системы, участвующей в биотрансформации и детоксикации низкомолекулярных чужеродных соединений (ксенобиотиков), а также в биотрансформации липофильных эндогенных соединений [Сибиряк и соавт., 2003, 2006; Morgan, 1998, 2001]. Существенно, что влияние цитокинов на различные изоформы цитохрома Р450 неоднозначно.
В экспериментальных и клинических исследованиях показано, что введение рекомбинантных ИЛ-1, ФНО, интерферонов I типа приводит к угнете-ниию окислительной биотрансформации, изменению фармакокинетики совме-
стно вводимых лекарственных средств и, как следствие, изменению их фарма-кодинамики и токсичности [Сибиряк и соавт., 1990; 1995; Okuno et al., 1990; Craig et al., 1993; Rouveix et al., 2000; Sibiryak et al., 2004]. В отношении цито-кинов Т-хелперных клонов (ИЛ-2, ИЛ-4, уИФН, ИЛ-10) в литературе представлены довольно противоречивые результаты. В частности, это касается ИЛ-2: ряд авторов отмечают способность рекомбинантного ИЛ-2 угнетать мо-нооксигеназы при введении экспериментальным животным или в процессе цитокинотерапии [Abdel-Razzak et al., 1993; Thai et al., 1994; Elkahwaji et al., 1999], другие исследователи отрицают влияние ИЛ-2 на монооксигеназы [Anderson et al., 1989; Thai et al. 2004]. В отличие от провоспалительных цито-кинов, для которых продемонстрирован четкий параллелизм между иммуно-тропным эффектом и воздействием на систему цитохром Р450-зависимых мо-нооксигеназ [Sibiryak et al., 2004], сведений о взаимосвязи иммунтропного эффекта ИЛ-2 и его влиянием на монооксигеназы нет.
Отечественный препарат дрожжевого рекомбинантного человеческого ИЛ-2 (ронколейкин), активно внедряется в клиническую практику как эффективный иммуномодулятор [Елькин и соавт., 2002; Козлов, 2002; 2006; Попович, 2004 и др.]. В то же время побочные эффекты терапии ронколейки-ном, в частности, его влияние на систему цитохром Р450-зависимых моноок-сигеназ, взаимосвязь с иммунотропным действием не охарактеризованы. Этот аспект действия ронколейкина представляется существенным, поскольку препарат, как, впрочем, и препараты других рекомбинантных цитокинов, нередко используется в рамках комплексной фармакотерапии, особенно в онкологии [Сепиашвили, 2001; Киселевский и соавт., 2002; Киселёва и соавт., 2002; Молчанов и соавт., 2002; Рукавицьш, 2002; Попович, 2004].
В настоящее время характер окислительного метаболизма, спектр участвующих в биотрансформации изоформ цитохрома Р450 для многих лекарственных препаратов четко установлен. Имеющиеся, а также вновь установленные сведения о характере воздействия цитокинов на те или иные изофор-мы позволяют предположить направленность изменений биотрансформации
7 совместно вводимых лекарств. Это определяет целесообразность создания компьютерной программы, позволяющей прогнозировать особенности фар-макокинетической интерференции.
Все изложенное выше и определило актуальность настоящего исследования.
Цель исследования. Оценить влияние человеческого рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина) на цитохром Р450-зависимую монооксигеназную систему печени во взаимосвязи с иммунотропным эффектом в экспериментальных условиях и разработать компьютерную программу, позволяющую прогнозировать характер влияния цитокинов на биотрансформацию лекарственных средств.
Задачи исследования.
Изучить иммунотропные эффекты ронколейкина (влияние на структуру гемограммы, пролиферативную активность и апоптоз в лимфоидных органах, субпопуляциопную структуру лимфоцитов периферической крови) интактных крыс при его введении в различных дозах.
Изучить влияние ронколейкина на гистологическую структуру печени при его введении в различных дозах.
Изучить влияние ронколейкина на конституитивные цитохром Р450-зависимые монооксигеназы печени.
Изучить иммунотропные эффекты ронколейкина (пролиферативную активность и апоптоз в лимфоидных органах) и его влияние на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы печени у крыс в условиях индукции повреждения печени гепатотропным ядом.
Разработать компьютерную программу, позволяющую прогнозировать характер изменения метаболизма лекарственных препаратов при проведении комплексной цитокинотерапии.
Научная новизна.
Оценено влияние отечественного препарата дрожжевого рекомбинантного человеческого ИЛ-2 (ронколейкина) на показатели пролиферативной
8 активности, апоптоза в лимфоидных органах крыс, субпопуляционную структуру лимфоцитов периферической крови крыс при введении препарата в различных дозах. Установлено, что иммуностимулирующий эффект препарата проявляется в наибольшей степени при однократном введении низких доз цитокина и выражается в стимуляции гемопоэза, активации митогенеза тимоцитов, увеличении содержания в периферической крови Т-лимфоцитов, экспрессирующих а-цепь рецептора к ИЛ-2.
Впервые установлено, что ронколейкин при однократном введении крысам в зависимости от дозы вызывает умеренные изменения гистологической структуры печени «воспалительно-дистрофического» характера, причем эффект более выражен при введении низких доз цитокина. Ронколейкин изменяет конституитивную активность цитохром Р450-зависимых монооксиге-наз печени. Характер влияния ронколейкина на монооксигенирование, реализуемое изоформами цитохрома Р450 различных подсемейств (CYP1A, CYP2B, CYP2C, CYP2E, CYP3A), неоднозначен. В зависимости от дозы ронколейкин увеличивает или не влияет на CYPlA-зависимую этоксирезоруфин-7-деэтилазную (ЭРОД) активность, угнетает СУР2С-зависимую дибензил-флюоресцеин-дебензилазную (ДБФД) активность; угнетает CYP2E-зависимую р-нитрофенол-гидроксилазную (ПНФГ) активность и мало влияет на СУРЗА-зависимую эритромицин-ТЧ-деметилазную (ЭРНД) активность в печени. Трёхкратное ежедневное введение ронколейкина в дозе 1 х 105 ед./кг не сопровождается изменениями монооксигеназных активностей.
Впервые изучены иммуно-гепатотропные эффекты ронколейкина на фоне токсического гепатита, вызванного введением четырёххлористого углерода. Обнаружено, что ронколейкин при введении в дозе 1 х 105 ед. /кг препятствует вызванной четыреххлористым углеродом индукции CYP2E1, но не защищает печень от повреждения и потенцирует угнетение других моноок-сигеназ, а также усиливает иммунодепрессивное воздействие четырёххлористого углерода на тимоциты.
Разработана компьютерная программа, позволяющая прогнозировать характер изменения метаболизма лекарственных препаратов при их совместном введении с препаратами рекомбинантных цитокинов.
Научно-практическая значимость работы.
Полученные результаты способствуют расширению знаний о цитоки-новой регуляции цитохром Р450-зависимых монооксигеназ и биотрансформации ксенобиотиков и метаболизирующихся цитохромом Р450 эндобиоти-ков, а также углубляют понимание механизмов регуляции гомеостаза при инфекции и «иммунном» стрессе. Результаты работы свидетельствуют, что рекомбинантный ИЛ-2 (ронколейкин) характеризуется гепатотропным эффектом, в эффективных дозах изменяет морфо-функциональное состояние печени и её фармакометаболирующую функцию. Это имеет практическую значимость при проведении комплексной фармакотерапии, поскольку назначение различных лекарственных препаратов на фоне приёма ронколейкииа может изменить их фармакокинетику и как следствие - фармакодинамику и токсичность.
Установлено, что токсические поражения печени гепатотропными ядами являются противопоказанием для применения ронколейкииа.
Создана компьютерная программа, которая на основании полученных сведениий о влиянии ронколейкииа на те или иные изоформы цитохрома Р450, а также данных о характере влияния других препаратов цитокинов позволяет прогнозировать характер изменения биотрансформации лекарственных средств и оптимизировать комплексную фармакотерапию с использованием цитокинов.
Внедрение результатов исследования.
Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу в лабораториях иммунофармакологии и иммунотоксиколопш Института иммунологии и физиологии Уро РАН (Екатеринбург), молекулярной биологии и биотехнологии Института биохимии и генетики УНЦ РАН (Уфа), используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре
10 иммунологии и кафедре биохимии Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск), на кафедре фтизиопульмонологии Башкирского государственного медицинского университета (Уфа). Основные положения, выносимые на защиту.
Дрожжевой рекомбинантный человеческий ИЛ-2 (ронколеикин) у крыс при однократном введении в зависимости от дозы проявляет иммуно-тропный эффект, обеспечивая стимуляцию гранулоцитопоэза, и воздействует преимущественно на Т-звено иммунитета, усиливая митогенез тимоцитов, экспрессию а-цепи рецептора к ИЛ-2 на зрелых Т-лимфоцитах периферической крови.
Ронколеикин при однократном введении в низких дозах вызывает умеренные изменения гистологической структуры печени в виде незначительных «воспалительно-дистрофических изменений» паренхимы органа. В зависимости от дозы ронколеикин изменяет копституитивную активность цитохром Р450-зависимых монооксигеназ печени, причем характер его влияния на монооксигеназную активность изоформ различных подсемейств неодинаков - ронколеикин преимущественно активирует Ah-рецептор-зависимые изоформы (CYP1A1/2) и преимущественно угнетает изоформы подсемейств CYP2C, CYP2E, CYP3A.
Ронколеикин в условиях токсического поражения печени гепатотроп-ным ядом (четыреххлористый углерод) препятствует индукции изоформы CYP2E1, но не защищает печень от повреждения, усиливает ее функциональную недостаточность и не обеспечивает коррекции нарушений иммунитета, вызванных токсикантом.
Прогнозирование характера взаимодействия препаратов рекомбинант-ных цитокинов с другими лекарственными препаратами возможно в рамках компьютерной программы на платформе 2.0 с применением технологии 2.0 в среде Microsoft Visual Studio 2005.
Апробация работы.
Результаты диссертационной работы доложены на научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2004); 2-й Российской школе по иммунотерапии (Новороссийск, 2005); Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины. Стволовая клетка» (Новосибирск, 2005); XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005); IV конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005); V конференции иммунологов Урала (Оренбург, 2006); Российской конференции молодых ученых, посвященной памяти Н.Н. Кеворкова (Пермь, 2006).
Публикации.
По материалам диссертационной работы опубликовано 9 работ в центральной печати, из них тезисов докладов на конференциях - 5, статей - 4.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 129 страницах, иллюстрирована 9 таблицами и 24 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, раздела, отражающего результаты собственных исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы включает 301 источник (88 отечественных и 213 зарубежных).
Автор выражает глубокую благодарность программисту П.В. Курчатову за помощь в разработке программы для анализа характера фармакокинетиче-кой интерференции.
Влияние цитокинов на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы
В настоящее время доказано, что большинство цитокинов изменяют активность монооксигеназной системы. Эти исследования имеют многолетнюю историю. Первоначально были установлены факты угнетения биотрансформации различных фармакологических препаратов при бактериальных и вирусных инфекциях [Наджмутдинов и соавт., 1987; Хакимов и соавт., 1991; Ковалев и соавт., 1994; Kato et al., 1963; Kraemer et al., 1982; Sonne et al., 1985; Renton et al., 1990; Mansor et al., 1991 и др.], иммунизации животных [Хлопушина, 1996], асептической воспалительной реакции [Belpair et al., 1998], введении различных иммуностимуляторов [Ковалев и соавт., 1994; Сибиряк и соавт., 2006]. Фактором ингибиции монооксигеназ и соответственно метаболизма фармакологических препаратов являются цитокины ИФНа и Р, ИЛ-1, ИЛ-6, ФНОа, ИЛ-11, ИЛ-2, ИФНу, ТФРр и др. [Сибиряк, 2003а; Сибиряк и соавт., 20036; Morgan, 2001]. Цитокиновая супрессия ЦхР450 осуществляется в основном путем блокады транскрипции генов различных изоформ. Цитокины снижают и экспрессию белков изоформ, и содержание мРНК, причем не исключено, что в реализации этих эффектов принимает участие активируемый цитокинами транскрипционный фактор NF-KB [Renton et al., 1990; Barker et al., 1992; Moritz et al., 1998; Iber et al., 2000]. Активно обсуждалась также роль пнтроксидергических механизмов, участие церамида в цитокин-опосредованной депрессии ЦхР450 [Khatsenko et al., 1993].
Наиболее интересным представляется то, что благодаря способности воздействовать на экспрессию ЦхР450 (для подавляющего большинства изоформ угнетать, но для некоторых индуцировать в различных клетках и тканях организма), цитокины выступают в роли важнейших регуляторов биотрансформации (как биосинтеза, так и катаболизма) эндогенных липофиль-ных соединений, в первую очередь стероидов и производных арахидоновой кислоты [Сибиряк, 2003а; Сибиряк и соавт., 20036, 2006; Morgan, 2001]. Кроме того, цитокины изменяют активность и ряда других ферментов, участвуют в метаболизме этих соединений. Все эти эффекты являются важнейшей составляющей плейотропной биологической активности цитокинов и свидетельствуют об универсальной роли иммунной системы в контроле над физиологическими процессами. Вызываемая цитокинами депрессия этой ферментной системы рассматривается как один из серьёзных побочных эффектов цитокинотерапии [Сибиряк и соавт., 20036, 2006; Kirkwood et al., 2002].
Способность влияния рекомбинантных цитокинов на активность цито-хрома Р450 была впервые описана для интерферонов [Sonnefield et al., 1981; Franklin et al., 1986]. ИФНа, ИФНр, ИФНу снижают уровень белка цитохро-ма Р450 и подавляют биотрансформацию различных веществ в гепатоцитах, что было выявлено как при введении ИФН животным, так и в системе in vitro [Craig et al., 1989; Moochhala et al., 1991; Fukuda et al., 1992; Tapner et al., 1996; Moritz et al., 1998]. Возможными механизмами ингибирующего действия ИФН на активность монооксигеназ рассматриваются активация эндори-бонуклеазы, инициирующей разрыв РНК и нарушающей таким образом процесс трансляции [Cribb et al., 1994], и ксантшюксидазы, генерирующей активные формы кислорода, которые впоследствии подавляют активность ци-тохрома [Moochhala et al., 1991]. Есть данные, что механизм действия ИФНу отличается от ИФНа, ИФІ-ф и других цитокинов — при анализе эффекта ци-токинов на конституитивную и индуцированную ксенобиотиками экспрессию мРНК и белков соответствующих изоформ в гепатоцитах было обнаружено, что в отличие от других цитокинов ИФНу мало влияет на содержание мРНК, но существенно угнетает накопление белков цитохромов, т.е. вызывает постранскрипционную супрессию [Calleja et al., 1997]. При введении ИФН описано снижение активности различных изоформ - CYP1A1/2, CYP1A2 и CYP2B6/7, CYP3A [Israel, 1993; Craig et al., 1993; Cribb et al., 1994; Brockmeyer et al., 1998], в то время как CYP2E1 -зависимое моноокси-генирование не изменяется. Так, введение высоких доз ИФНа-2Ь в процессе терапии меланомы приводило к угнетению СУР1А2-зависимой биотрансформации в печени более чем на 60%, однако CYP2E1-зависимое моноокси-генирование не изменялось [Islam et al., 2002]. Анализ динамики угнетения монооксигеназных активностей в печени у больных меланомой, получающих интерферонотерапию (ИФНа-2Ь) показал, что в первую очередь угнетаются CYP1A2 и CYP2D6 изоформы, а позднее - CYP2C19, максимальное подавление которой наблюдается на 26-й день от начала терапии. Интересно, что выявлена прямая корреляция между подавлением активности CYP1A2 и проявлением нейротоксичности, между CYP2D6 и лихорадкой и анемией [Kirkwood et al., 2002].
Доказано, что угнетение монооксигеназной активности печени и нарушение биотрансформации эндо- и ксенобиотиков при развитии бактериальной инфекции, введении эндотоксинов (ЛПС), асептическом воспалении обу 28 словлены влиянием на цитохром Р450 таких провоспалительных цитокинов, как ИЛ-1, ФНО [Chezzi, 1986; Schedlofsky, 1987; Morgan et al., 1998; Shimamoto et al., 1999; Morgan, 2001; Beigneux et al., 2002; Gilmore et al., 2003]. Показательны эксперименты, проведённые СВ. Сибиряком и соавторами [1995], в которых ингибирующий эффект различных по составу ЛПС грамм-негативных бактерий на аминопирин-М-деметилазную и анилин-р-гидроксилазную активности в печени был прямо пропорционален их способности индуцировать синтез ИЛ-1(3 и ФНОа в культурах мононуклеаров.
Определение монооксигеназных активностей по скорости биотрансформации проб-субстратов
Биотрансформация дибепзилфлюоресцепна осуществляется изофор-мами цитохрома Р450 подсемейств CYP2C и CYP3A [Stresser et al., 2000; 2002]. В процессе окислительного дебензилирования образуется флюорес-цин. У человека, в печени которого конституитивно в максимальной степени экспрессирована изоформа CYP3A4, интенсивность биотрансформации дибепзилфлюоресцепна отражает активность в основном этой изоформы. У крыс в максимальной степени конституитивно экспрессированы изоформы подсемейства CYP2C, и ДБФД-активность отражает в основном активность изоформ этого подсемейства. Реакцию осуществляли по методу, описанному Stresser с соавторами [2000]. Реакционная система общим объёмом 1 мл содержала 50 тМ К3Р04 буфера (рН 7,4), 3 тМ MgCl2, НАДФ Н-генерирующую систему (6,6 тМ глюкозо-6-фосфата (Sigma), 0,8 Ш глюко-зо-6-фосфат дегидрогеназы (Sigma), 2,6 mM ЫАДФ (Sigma) и 0,5 - 1 мг белка 812-фракции. Реакцию инициировали добавлением 1 тМ дибензил-флюоресцеина (GENTEST). Пробы инкубировали на шейкер-бане (Juan) при 37 С в течение 30 минут (120 качаний/мин). Реакцию останавливали помещением проб на лёд, добавляли 400 мкл 2N NaOH, центрифугировали и затем определяли интенсивность флюоресценции супернатанта на флюори-метре VERSA FLUOR 1,3 (BioRad) при длине волны возбуждения флюоресценции 475 нм, эмиссии — 530 нм. Количество образовавшегося флюоресцеина рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору флюоресцеина (Fluka).
Деметилирование эритромицина в N-положении и у человека, и у крыс селективно осуществляется изоформами подсемейств CYP3A [Wrighton et al., 1985; Yamazaki et al., 1996; Hanioka et al., 1997; Bhagwat etal., 1999; Guengerich, 1999]. В процессе деметилирования образуется формальдегид, который идентифицируется цветной реакцией. Оценку эритро-мицин-К-деметилазной (ЭРНД) активности осуществляли по методу J.Werrigloer [1978]. Реакционная система общим объёмом 1 мл содержала 50 тМ К3Р04 буфера (рН 7,4), 3 тМ MgCl2, 12,5 mmol/L эритромицина (Sigma) и 0,5 - 1 мг белка 812-фракции или микросом. Реакцию инициировали добавлением 0,5 mmol/L НАДФ Н (Sigma). Пробы инкубировали на шейкер-бане (Juan) при 37 С в течение 45 минут (120 качаний/мин). Реакцию останавливали помещением проб на лёд, добавляли 200 мкл 15% ТХУ, центрифугировали. Содержание формальдегида в супернатате оценивали спектрофотометрически (405 нм) на планшетном фотометре Multiskan Plus (Labsystems), используя реактив Наша (2М ацетат аммония, 0,05 М ледяной уксусной кислоты, 0,02М ацетил-ацетон). Ферментативную активность рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору формальдегида.
Скорость окислительного деалкилирования 7-этоксирезоруфина цито-хромом Р450 у человека и грызунов отражает активность Ah-рецептор-зависимых изоформ CYP1A1/2 [Burke et al., 1985]. Определение ЭРОД-активности осуществляли по методу R. Pohl и J. Fouts [1980]. Реакционная система общим объёмом 1 мл содержала 50 тМ К3Р04 буфера (рН 7,4), 3 тМ MgCb, 1 пМ 7-этоксирезоруфина (Sigma) и 0,5 - 1 мг белка S12-фракции или микросом. Реакцию инициировали добавлением 0,25 тМ НАДФ Н (Sigma). Пробы инкубировали на шейкер-бане (Juan) при 37 С в течение 30 минут (120 качаний/мин). Реакцию останавливали добавлением ледяного метанола, пробы центрифугировали и затем определяли интенсивность флюоресценции супернатанта на флюориметре VERSA FLUOR 1.3 (BioRad) при длине волны возбуждения флюоресценции 546 нм, эмиссии -590 нм. Количество образовавшегося резоруфина рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору резоруфина (Sigma).
В процессе окислительного шдроксилирования р-нитрофенола цито-хромом Р450 образуется 4-нитрокатехол. Окислительная биотрансформация р-нитрофенола осуществляется у млекопитающих изоформой Р450 CYP2E1 [Коор, 1986; Forkert et al., 2001]. Определение ПНФГ-активности производили по методу, описанному P.-G. Forkert с соавторами [2001]. Рекционная система общим объёмом 1 мл содержала 50 тМ К3Р04 буфер (рН 6,8), 5 тМ MgCl2, 1 тМ аскорбиновой кислоты, 1,5 mM EDTA (Merck), НАДФ Н-генерирующую систему (7,5 тМ глюкозо-6-фосфата (Sigma), 2 Ш глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Sigma), 0,4 mM HAДФ(Sigma) и 0,5 - 1 мг белка S12-фракции или микросом. Реакцию инициировали добавлением 100 тМ р-нитрофенола (Sigma). Пробы инкубировали на шейкер-бане (Juan) при 37 С в течение 30 минут (120 качаний/мин). Реакцию останавливали помещением проб на лёд, добавляли 25 мкл 70%-ной перхлорной кислоты, центрифугировали. Затем супернатант смешивали с равным объёмом 0,9М NaOH и спек-трофотометрировали при длине волны 546 нм на планшетном фотометре Multiscan Plus. Количество образовавшегося 4-нитрокатехола рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору нитрока-техола (Sigma).
Гематологические показатели при введении ронколейкина крысам в различных дозах и режимах
Как н в случае со спленоцитами, в диапазоне доз от 2,5 х 106 до 5 х х 10 ед./кг ронколейкин статистически значимо не влиял на пролифера-тивную активность и апоптоз тимоцитов. Однако при снижении доз (2,5 х х 105 и 1 х 105 ед./кг) проявлялось отчетливое тимус-стимулирующее действие препарата — ронколейкин статистически значимо увеличивал величину SG2M-niiKa и, следовательно, количество митотически активных клеток. При этом содержание клеток, находящихся в фазе покоя, имело тенденцию к снижению, но статистически значимых различий с контрольной группой не было. В минимальной дозе (6x10 ед/кг) наблюдаемая закономерность сохранялась. Рис. 4 иллюстрирует сравнительные значения индекса пролиферации, который представляет собой соотношение митотически активных клеток (SG2M) с клетками, находящимися в фазе покоя и премитотической фазе (G0G1). На рисунке отчетливо видно митогенное действие ронколейкина на спленоциты при его введении в дозах 1 х 106 и б х 10 ед./кг. Стабильное возрастание индекса пролиферации тимоцитов при введении рекомбинантного ИЛ-2 проявлялось только при использовании низких доз (в диапазоне от 6 х х 104 до 2,5 х 105 ед./кг) препарата. Статистически значимых изменений апоптоза тимоцитов и спленоци-тов выявлено не было.
Уже в ранних работах было показано, что ИЛ-2 является ключевым ци-токином, контролирующим развитие тимоцитов, обеспечивающим их пролиферацию и защищающим от апоптоза функцию ЭКТ [Ярилин, 1999; Robb et al., 1984; Takei, 1988; Nieto et al., 1990; Kintzel et al., 1991]. Ранние тимоци-ты экспрессируют рецептор к ИЛ-2 и мРНК ИЛ-2, а добавление экзогенного ИЛ-2 в культуры фетальных тимоцитов или его введение индуцирует пролиферацию тимоцитов [Toribio et al., 1989; Zuniga-Pfluicker et al., 1990; Fedecka-Bruner et al., 1999; Kondo et al., 1997; Maslinski et al., 1992; Varas et al., 1997]. ИЛ-2 обеспечивает в тимусе созревание и дифференцировку всех типов Т-лимфоцитов: CD4+ Т-хелперов, CD8+ ЦТ Л, НК-лимфоцитов и, как показывают исследования последних лет, регуляторных CD4+CD25+ieneTOK, контролирующих аутоиммунные реакции [Nelson, 2004]. Судя по полученным данным, оптимальный тимус-стимулирующий эффект рекомбинантного ци-токина проявляется при введении невысоких доз препарата, что согласуется с данными других исследователей [Varas et al., 1997].
Неудивителен и активирующий эффект воздействия рИЛ-2 на клетки периферических лимфоидных органов. Очевидно, что «отвечающими» клетками в этом случае являются как зрелые примированные Т-лимфоциты, для которых ИЛ-2 является фактором экспансии [Ярилин, 1999], так и опосредованно В-лимфоциты. Неудивительно, что дозовая зависимость влияния рон-колейкина на спленоциты иная, нежели для клеток тимуса.
Одним из ведущих, клинически значимых эффектов ИЛ-2 при его введении пациентам с иммунологической недостаточностью является восстановление субпопуляционной структуры Т-лимфоцитов, увеличение содержания С04+Т-хелперных лимфоцитов [De Paoli, 1997]. В этой связи представлялось особо интересным оценить характер влияния ропколейкина на субпо-пуляционную структуру Т-лимфоцитов периферической крови, а также экспрессию а-цепи рецептора к ИЛ-2 на СОЗ+Т-лимфоцитах как показателя активации Т-клеток. В этих экспериментах ронколейкин вводили в дозах, обеспечивающих тимус-стимулирующий эффект: 2,5 х 105 и 1,0 х 105 ед./кг. Результаты иммунофенотипирования представлены на рис. 5 и 6.
При введении в дозе 2,5 х 105 ед./кг содержание С04+Т-лимфоцитов практически не изменялось, а при введении меньшей дозы (1,0 х 10 ед./кг) ронколейкин вызывал тенденцию к увеличению содержания CD4+ Т-хелперов, однако достоверных различий с контрольной группой животных не было. Содержание СОЗ+С08+лимфоцитов в группах животных, получавших ронколейкин, по сравнению с контрольной группой также не изменялось. В то же время при введении рекомбинантного ИЛ-2 в дозе 2,5 х х 105 ед./кг прослеживалась отчетливая тенденция (Р=0,07) к увеличению содержания Т-лимфоцитов, экспрессирующих а-цепь рецептора к ИЛ-2 (CD3+CD25+ лимфоцитов) в периферической крови, а при введении препарата в дозе 1,0 х 105 ед./кг содержание С025-экспрессирующих Т-лимфоцитов возрастало почти в 2 раза, и различия с контрольной группой были статистически значимы.Полученные результаты подтверждают иммунотропный эффект ронколейкина, направленный на индукцию Т-клеточных механизмов. Покоящиеся Т-лимфоциты-хелперы не экспрессируют на своей поверхности а-цепи ИЛ-2Р и не отвечают экспрессией ИЛ-2Р на воздействие даже очень высоких доз ИЛ-2. Экспрессия а-цепи возрастает только в случае митогенной или антигенной стимуляции [Сибиряк и соавт., 2006; Copeland et al., 1996; Glik et al., 2006]. Такой же тип ответа свойственен CDS+T-киллерам, так как они в покое экспрессируют низкие количества ИЛ-2Р. Поскольку аутокринное и паракринное усиление экспрессии а-цепи на Т-лимфоцитах возможно только на стимулированных антигеном клетках, полученные данные свидетельствуют, что при введении в низких дозах рИЛ-2 (ронколейкин) обеспечивает усиление активации примированных Т-лимфоцитов у интактных крыс. Не исключено, что снижение содержания лимфоцитов в циркуляции, которое наблюдается при введении невысоких доз препарата, связано с усиление тканевого «хоминга» активированных клеток.
Гепатотропные и иммунотропные эффекты ронколейкина в условиях индукции токсического поражения печени
Дистрофические изменения в цитоплазме гепатоцитов не обнаруживались. В синусоидах хорошо просматривались веретеновидные синусоидальные клетки. Обращали на себя внимание признаки стаза крови в отдельных портальных венах и артериях. В таких зонах паренхимы печени, где эти явления наблюдались, синусоидные капилляры были расширены и содержали элементы крови. В некоторых участках печени, независимо от локализации в дольке, выявлялась мелкоочаговая пролиферация купферовских клеток (рис. 15). Таким образом, введение рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина) вызвало умеренные изменения гистологической структуры печени, максимально выраженные именно при введении низких доз цитокина, т.е. имелся определенный параллелизм между иммунотропным эффектом. Напротив, при воздействии на крысу ронколейкина от 5 х 10 ед. /кг и выше (1 х 10 и 5 х 106 ед. /кг) морфологических изменений паренхимы печени практически не наблюдалось. В диапазоне доз от 6 х 104 до 2,5 х 105 ед./кг морфологические изменения в печени после введения ронколейкина носили примерно одинаковый характер и выражались в виде незначительных дистрофических изменений цитоплазмы гепатоцитов (вакуолизация цитоплазмы), ядра в клетках были неизмененными. Наблюдался стаз крови в расширенных синусоидах и сосудах портального тракта и центральных вен. Выявлялись отдельные мелкие лимфоцитарные инфильтраты. Возможно, что в малых дозах рекомбинантный ИЛ-2 усиливает эмиссию провоспалительных цитокинов, которые, в свою очередь, могут индуцировать в клетках транскрипцию «провоспалительных генов», синтез хемокинов и адгезивных молекул (ICAM-1, VCAM-1, Р-селектин), способствуя экстравазальной миграции клеток в паренхиму печени [Shirasugi et al., 1997; Bradham et al., 1998; Anderson et al., 1998; Hoek et al., 2002].
Существенно, что описываемые морфологические изменения не сопровождались негативной динамикой биохимических показателей. Табл. 3 иллюстрирует активность сывороточной аланинаминотрансферазы (АЛТ), уровень общего билирубина, а также содержание малонового диальдегида в гомогенатах печени крыс, получавших ронколеикин в сравнении с контрольной группой животных.
Как видно из таблицы, судя по уровню билирубина, явлений холестаза при введении ронколейкина не отмечалось. Отсутствие повышения уровня АЛТ, весьма характерного для последствий интерферонотерапии [Sriskandan et al., 1986; Schomburg et al., 1994; Larrea et al., 1996] и свидетельствующего о нарушении целостности гепатоцитов и явлениях цитолиза, также не было. Содержание МДА, как конечного продукта липопероксидации [Стальная и соавт., 1977], в гомогенатах печени крыс контрольной группы и крыс, получавших ронколейкин, было одинаковым.
По данным большинства исследователей, введение рекомбинантных цитокинов как в экспериментальных условиях, так и в клинических ситуациях вызывает изменение гистологической структуры печени, а «цитокиновый удар», по мнению исследователей, является фактором повреждения гепатоцитов в случае тяжёлой травмы, ожогов, эндотоксикоза, сепсиса и синдрома реперфузии [Shibayama, 1992; Wang et al., 1995; Shirasugi et al., 1997; Bradham etal., 1998].
По данным Ахматова и Сибиряка [2004], введение высокой дозы ре-комбинатного ИЛ-1 (6 х 106 ед./кг) вызывает вакуольную дистрофию гепатоцитов, нарушение внутрипечёночной гемоциркуляции [Ахматов и соавт., 2004]. Как и в наших исследованиях, было обнаружено, что введение высоких доз человеческого рекомбинантиого ИЛ-2 грызунам (мыши) вызывает перипортальную мононуклеарную инфильтрацию, бшшарную гиперплазию, нарушения гемодинамики с увеличением порозности капилляров и стаз крови [Anderson et al., 1989; Thai et al., 1994; Wolfgan et al., 1998]. Однако некоторые авторы описывают выраженную гепатоцеллюлярную дегенерацию с развитием некроза гепатоцитов [Thai et al., 1994]. Дистрофические и гемоди-намические нарушения в печени обнаруживаются у людей в условиях терапии рекомбипантым ИЛ-2 или комбинированной терапией ИЛ-2 и ИФНу [Sriskandan et al., 1986; Schomburg et al., 1994; Larrea et al., 1996]. Следует ещё раз подчеркнуть, что ИЛ-2 ускоряет продукцию и секрецию других цитокинов: интерлейкинов, интерферонов, колониестимулирующих факторов, и его эффект может носить опосредованный характер [Bradham etal., 1998]. Нельзя исключить, что описываемые другими авторами повреждения печени при введении рекомбинантного ИЛ-2 и отсутствие значимых, грубых изменений паренхимы в нашем исследовании связаны с различными технологиями получения ИЛ-2. Большинство коммерческих препаратов ИЛ-2 получены путем введения гена ИЛ-2 в клетки Е. coli и могут содержать примесь эндотоксинов, которые являются мощными индукторами синтеза ИЛ-1, а ронколейкин является препаратом дрожжевого происхождения.
Метаболизм этоксирезоруфин-О-деэтилирования осуществляется в основном изоформами цитохрома CYP1A1 и CYP1A2, которые отвечают преимущественно за трансформацию полициклических планарных соединений [Щербаков и соавт., 1995; Сибиряк и соавт., 2003; Guengerich et al, 1982; Burke et al, 1985; Ahokas et al., 1987; Ryan et al., 1990; Nerurkar et al, 1993]. Особенностью этих изоформ является то, что регуляция транскрипции генов этих изоформ осуществляется через так называемый арилуглеводородныи рецептор (Ah-рецептор) [Nebert et al., 2004]. Результаты оценки влияния ронколейкипа на ЭРОД-активность при его однократном введении крысам иллюстрируют табл. 4 и рис. 17. При введении ронколейкипа в высоких дозах — 5 х 10б и 2,5 х 106ед./кг - статистически значимых изменений CYP1A1-зависимой ЭРОД-активности по сравнению с контрольными группами не было. При введении ронколейкипа в дозе 1 х 106ед./кг скорость монооксиге-нирования этоксирезоруфипа несколько снижалась, при дальнейшем снижений дозы до 5 х 10 наблюдалось нарастание ЭРОД-активности (статистически достоверных отличий от контроля не было из-за значительной вариабельности результатов).
