Введение к работе
Актуальность темы. Трансмембранный перенос ионов и молекул воды является одним из интегральных биологических процессов, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность клеток млекопитающих [D.Haussinger et al., 1994; F.Lang et al., 1998; W.C.O'Neffl, 1999]. Показано, что Na+-K+-2C1-котранспортёр играет важнейшую роль в регуляции клеточного содержания электролитов и воды [С.Н.Орлов и др., 1996, 1997; M.Haas et al, 1994, 2000; J.M.Russell, 2000]. В последние годы были получены молекулярные и функциональные доказательства наличия Ка+-К+-2С1-котранспоргёра в поперечно-полосатой мышечной ткани [А.Х.Уразаев, 1997; L.Fu et al., 1999; M.I.Lindinger et al., 2001; J.A.Wong et al., 1999]. Показано, что в сердечной мышце крыс он участвует в поддержании концентрации калия мышечных клеток [G.O.Andersen et al., 1998]. Однако, несмотря на доказательства о присутствии №+-К+-2С1-котранспортера в скелетной мускулатуре, его роль в этой ткани остаётся малоизученной.
Скелетная мышца является уникальной тканью, так как она содержит в себе до 75% калия и до 40% воды всего организма [AAMcDonough et al, 2002]. Поэтому нарушения в функционировании механизмов, участвующих в транспорте калия и воды, могут привести к значительным сдвигам в концентрации калия и осмолярности плазмы и пагубным последствиям на работу сердца и мозга [D.W.Foster, 1974; F.Lang et al., 1998; M.I.Lindinger, 1995; O.M.Sejersted, 2000]. Согласно современным представлениям, Na+-K+-2C1-котранспортёр является единственным клеточным механизмом по одновременной стимуляции транспорта как калия, так и воды в клетку [J.M.Russell, 2000]. Однако ни в одном из исследований оценка активности Na+-К+-2С1-котранспортёра по переносу калия и воды в скелетньж мышцах не проводилась. Также не было изучено, какие стимулы надо приложить для активации котранспортёра. Изучение данного вопроса является важным для понимания процессов, задействованных в поддержании гомеостаза калия и воды как в скелетньж мышцах, в частности, так и в организме целом.
Внутриклеточные механизмы регуляции работы N а+-К+-2С1-котранспортёра скелетньж мышц также до сих пор остаются малоизученными.
2 В настоящее время имеются сведения, что при воздействии на мышцы гормонами, повышением осмолярности или сократительной активности происходят изменения в системе вторичных посредников и трансмембранных ионных потоков, что в свою очередь влияет на функциональную активность мышечной клетки [D.Haussinger et al., 1999; F.Lang et al., 1998; K.Sakamoto, LJ.Goodyear, 2002; J.F.Wojtaszewski et al., 2002]. Наиболее значимы в скелетной мышечной клетке такие системы как митоген-активируемые протеинкиназы, фосфатидилинозигол 3-киназа(Р13-К)/Ак1, а также прогеинкиназа A [F.Hoover et al, 2001; AThorell et al, 1999; U.Widegren et al, 2001; Widmann et al, 1999; J.F.Wojtaszewski et al., 1999]. Существуют данные и о сопряжении работы калиевых каналов с активностью Na+-K+-2Cl-KOTpaHcnoprepa [MA.Clark et al., 1993; W.C.O'Neffl et al, 1995; S.N.Orlov et al., 1996; J.Suvatne et al., 2001; T.Wang, 2003]. Однако влияние описанных процессов на работу Na+-K+-2C1-котранспортёра в скелетной мышце до сих пор не было исследовано.
Сахарный диабет является распространённым патологическим состоянием, которое сопровождается гипергликемией, гиперкалиемией и гилеросмолярностью плазмы [J.R.Gavin, 1998; H.King et al, 1998; AE.Kitabchi et al., 2001; P.Zimmet et al., 2001]. Терапия сахарного диабета лекарственными препаратами, а также систематическими физическими упражнениями улучшает механизмы по гомеостатическому контролю транспорта глюкозы и ионов через плазматическую мембрану мышечных клеток [T.Clausen, 1998; C.Y.Christ et al., 2002; R.DeFronzo, 1999; J.L.Evans, 2002; AJ.Scheen et al., 1998; A.R.Haimer et al., 2000; J.O.Holloszy, 2003 ; H.Klitgaard et al., 1989; J.W.Ryder et al., 2001]. Несмотря на эти данные, функционирование N а+-К+-2С1-котранспоргёра скелетных мышц при сахарном диабете и после его лекарственного лечения экспериментально не изучалось.
Таким образом, в связи с тем, что функционирование Na+-K+-2C1-котранспортёра вовлечено в течение ряда важных физиологических и патологических процессов в клетках организма, раскрытие функций Na+-K+-2C1 -котранспортёра и разработка способов их фармакологической регуляции в скелетных мышцах является актуальной проблемой современной базисной и клинической фармакологии.
Цель исследования. Изучение фармакологической регуляции работы Na+-К+-2С1-котранспоргёра в поддержании гомеостаза калия и воды в скелетных мышцах.
Задачи работы:
Оценить роль Ма+-К+-2С1-котранспоргёра в регуляции содержания калия и воды в скелетных мышцах крысы.
Выявить роль агонисгов адренергических рецепторов (изопреналина, фенилэфрина, эпинефрина), инсулина, короткого курса мышечных сокращений и гиперосмолярной среды в регуляции активности Ка+-К+-2С1-котранспортёра по транспорту калия и воды в скелетных мышцах крысы.
Изучить роль внутриклеточных вторичных посредников Raf-1-MEK-ERK1,2 МАРК, р38 МАРК и фосфатидилинозигол З-киназы/Akt в регуляции работы Ка+-К+-2СП-котранспортёра в "медленных" и "быстрых" скелетных мышцах крысы.
Оценить роль каскада вторичных посредников цАМФ-аденилат циклаза-прогеинкиназа А, гликолиза и АТФ-зависимых К-каналов в активации Na+-K+-2С1-котранспортёра гиперосмолярной средой в "медленных" и "быстрых" скелетных мышцах крысы.
Провести оценку фармакологической регуляции активности Na+-K+-2C1-котранспортёра в изолированных культурах клеток скелетной мышцы крысы.
Изучить влияние длительного курса физической нагрузок на активность Ка+-К+-2С1-котранспортера в "медленных" и "быстрых" скелетных мышцах крысы с оценкой воздействия на работу котранспортера изопреналина и инсулина.
7. Оценить функционирование Ка+-К+-2С1-котранспоргёра и активность
вторичных посредников по его регуляции в скелетных мышцах крысы и
человека, страдающих сахарным диабетом, до и после лекарственной терапии
заболевания пиоглитазоном и инсулином.
Научная новизна. Впервые выявлено, что агонисты адренергических рецепторов (изопреналин, фенилэфрин, эпинефрин), шперосмолярная среда и мышечные сокращения стимулируют работу Ка+-К+-2С1-котранспортёра в скелетной мускулатуре крысы, что сопровождается усилением транспорта калия и воды в мышечные клетки, который наиболее выражен в "медленных"
мышцах крысы. Инсулин подавляет активацию Ка+-К+-2С1-котранспортёра в изоосмотической среде.
Установлено, что активация вторичных посредников системы внеклегочно-регулируемых киназ мигоген активируемых прогеинкиназ (ERK1,2 МАРК) необходима для Ка+-К+-2С1-котранспортёр-опосредованного переноса калия. Фармакологаческая стимуляция вторичных посредников прогеинкиназы В (Akt) и р38 мигоген активируемьж протеинкиназ ( р38 МАРК) угнетает функцию Ка+-К+-2С1-котранспортёра по переносу калия за счет угнетения ERK1.2 МАРК.
Получены данные о роли АТФ-зависимых К-каналов (Кдтф-каналов) в регуляции работы Ка+-К+-2С1-котранспортёра скелетных мышц в гиперосмолярной среде: активация КАТФ-каналов в "медленной мышце" и их угнетение в "быстрой" мышце опосредует стимуляцию Na+-K+-2C1"-котранспортёра в гиперосмолярной среде, причем в "медленной" мышце стимуляция КАТФ-каналов происходит в результате подавления активности протеинкиназы А и угнетения образования гликолитического АТФ.
Показано, что активность Ка+-К+-2С1-котранспортёра в клеточных культурах in vitro угнетается изопреналином, форсколином и фармакологическими агентами, повышающими пАМФ в клетке.
Впервые установлено, что Ка+-К+-2С1-котранспортёр скелетных мышц
активируется после курса дозированной физической нагрузки, что
сопровождается улучшением как транспорта калия, так и воды в мышечные
клетки. В этих условиях активация адренергических рецепторов
изопреналином угнетает работу Ма+-К+-2С1-котранспортёра, а инсулин не влияет на его функцию.
Выявлена резистентность активации ERK1,2 МАРК и Akt инсулином в мышечной ткани животных и человека, страдающих сахарным диабетом. Фармакотерапия диабета инсулином и пиоглитазоном сопровождается нормализацией работы вторичных посредников по регуляции Na+-K+-2C1-котранспортёра в скелетных мышцах параллельно снижению уровня гипергликемии и гиперинсулинемии.
Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты исследования расширяют представления о роли скелетных мышц в регуляции
5 гомеостаза калия и воды в организме, протекающего с участием Na+-K+-2C1-котранспортёра.
Полученные данные об ингибирующем влиянии буметанида на работу Na+-К -2СГ-котранспортёра скелетных мышц расширяют представления о механизмах действия "петлевых диуретиков". Результаты исследований позволяют считать соединения, относящиеся к блокаторам ERK1,2 МАРК, в качестве фармакологических ингибиторов работы Ка+-К+-2СГ-котранспортёра.
Выявлена способность глибенкламида и пиоглитазона повышать активность №+-К+-2СГ-котранспортёра в скелетных мышцах. Результаты исследования раскрывают молекулярные механизмы антидиабетического действия пиоглитазона, обосновывая возможность применения этого препарата для профилактики и лечения сахарного диабета.
Раскрытие молекулярных механизмов по модуляции активности Na+-K+-2СГ-котранспортёра позволило сформулировать единую концепцию внутриклеточной регуляции работы этого транспортного протеина в скелетной мышце.
Изучение систем вторичных посредников в "медленной" и "быстрой" мышцах, регулирующих активность Ка+-К+-2СГ-котранспортёра, способствует раскрытию фенотипических различий в скелетной мышечной ткани. Также проведенные исследования по оценке роли Ма+-К+-2СГ-котранспортёра в поддержании гомеостаза калия и воды имеют практическое значения для понимания патогенеза метаболических расстройств, связанных с нарушением функции мышечнойткани.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях предметно-проблемной комиссии КГМУ (2001,2004); съездах Федерации Амерканских Обществ Экспериментальной Биологии (Orlando, 2001; New Orleans, 2002; San Diego, 2003; Washington, 2004); 61-ой, 62-ой и 63-ей Научных Сессиях Американской Диабетической Ассоциации (PMladelpMa, 2001; San Francisco, 2002; New Orleans, 2003); кафедре эндокринологии Научно-клинического Центра Университета Теннеси (2002, 2003, Memphis); кафедре физиологии Научно-клинического Центра Университета Теннеси (2003, Memphis); съездах "Вопросы биологического транспорта" Американского Физиологического Общества (2002, 2003,
Cumburland Lake, Kentucky); XI Российском Национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2004); Международной научно-практической конференции "Рациональное использование лекарств" (Пермь, 2004); V Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 научные работы.
Основные положения, выносимые на защиту:
Ка+-К+-2СГ-котранспоргёр скелетных мышц участвует в регуляции клеточного гомеостаза калия и воды. В изоосмолярных условиях котранспортёр переносит калий в клетку, а в гиперосмолярных условиях - препятствует потере воды из клетки.
В изоосмолярных условиях а - и Р-адренергические агонисты стимулируют, а инсулин угнетает активность N а+-К+-2СГ-котранспоргёра. Фармакологическая активация системы вторичных посредников, входящих в каскад ERK1,2 МАРК, необходима для усиления работы N а+-К+-2СГ-котранспортёра. Передача внутриклеточного сигнала через каскады р38 МАРК и фосфатидилинозигол З-киназа/Akt (PI 3-K/Akt) в "медленной мышце" и PI 3-K/Akt в "быстрой мышце", подавляет активацию ERK1.2 МАРК и котранспортёра.
В гиперосмолярных условиях активация Ка+-К+-2СГ"Котранспоргёра не зависит от системы ERK1.2 МАРК, р38 МАРК и Akt, а опосредована угнетением функции протеинкиназы А (ПКА). В "медленной" мышце подавление ПКА опосредует данный эффект в результате снижения гликолиза и активации КдтФ-каналов. В отличие от этого в "быстрой" мышце угнетение функции КАТФ-каналов гиперосмолярностью стимулирует работу Na+-K+-2C1'-котранспортёра.
Однократная и длительная физические нагрузки усиливают активность Na+-K+-2Cl*-KOTpaHcnopTepa в скелетных мышцах, которая подавляется изопреналином и фармакологическими блокагорами функции ERK1,2 МАРК и не изменяется при действии инсулина.
В скелетных мышцах крыс с наследственным сахарным диабетом и больных с впервые выявленным сахарным диабетом выявлен дисбаланс в
7 функционировании вторичных посредников, регулирующих Na+-K+-2Cr-котранспортёр. Терапия заболевания пиоглитазоном и инсулином оказывает нормализующее влияние на изменения во внутриклеточных связях.
Структура и объем работы. Диссертация объемом 228 страниц машинописи состоит из введения, обзора литературы, главы - Материалы и методы исследования, 7 глав результатов собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 437 источников, из них 21 отечественных авторов. Диссертация содержит 82 рисунка и 5 таблиц.
