Порфирин-фуллереновые наночастицы (\!\#225#1Mg#2+#1\?\)#34#1PMC16 в коррекции митохондриальных дисфункций, индуцированных в клетках миокарда крыс 1-метилникотинамидом Амиршахи Нима

Содержание к диссертации

Введение

1. Фармакологическая коррекция нарушений метаболизма в клетках тканей млекопитающих при гипоксиях различного генеза

1.1 Отравления и побочные эффекты лекарств

1.2 Ингаляционный дефицит кислорода

1.3 Последствия интенсивных физических нагрузок

1.4 Окклюзионная ишемия миокарда

1.5 Пост-электрошоковый электролитный дисбаланс

1.6 Опыт фармакологического применения наночастиц

2. Митохондрии и патология

2.1 Наследственная патология митохондрий

2.2 Гиповитаминозы

2.3 Митохондрии - мишени ксенобиотиков

2.4 Нарушения функции митохондриальных рецепторов. Порфирин-связывающие белки мембран

2.5 Митохондрии и кардиотоксикология

3. Фармакологические перспективы применения фуллеренов и их производных

3.1 Мембранотропные свойства

3.2 Общие закономерности проявлений биологической активности

3.3 Антитела к фуллеренам

3.4 Метаболизм

3.5 Токсичность и биологическая безопасность

3.6 Фуллерены и нанофармакология

4. Магнитный изотопный эффект "Mgz+ в биологии и медицине

4.1 Гиперактивация окислительного и субстратного каналов фосфорилирования нуклеотидов в митохондриях

4.2 Фармакологическая целесообразность и возможности избирательной (адресной) доставки катионов 25Mg2+ в миокард. Предполагаемая роль аддуктов фуллерена-С6о

Выводы

• Ингаляционный дефицит кислорода
• Опыт фармакологического применения наночастиц
• Митохондрии и кардиотоксикология
• Фуллерены и нанофармакология

Введение к работе

Актуальность темы

Миокардиоциты являются, наряду с нейронами коры головного мозга, клетками, наиболее чувствительными к дефициту кислорода (Leder & Waugh, 1980; Sallivan et al, 2001). Поэтому последствия тканевой гипоксии миокарда, нередко необратимые, способствуют формированию устойчивых нарушений строения и контрактильной функции сердечной мышцы (Chomsky et al, 2000). В основе патогенеза этих нарушений лежит падение уровня синтеза АТФ, связанное с невозможностью нормального протекания внутримитохондриальных электрон-транспортных реакций окислительного фосфорилирования в отсутствие кислорода (Liu & Pratt, 2002). Таким образом, как профилактика, так и лечение митохондриальных дисфункций и гипоксических миокардиопатий должны включать способы быстрого восстановления истощённого пула АТФ в клетках сердца.

При этом этиология этих нарушений весьма разнообразна: это и врождённые нарушения метаболизма (синдром Ледерера-Вальдека), и отравления (нитрофенолы), и побочные эффекты лекарств — ингибиторов окислительного фосфорилирования (Доксорубицин), и ингаляторное кислородное голодание, и чрезмерные физические нагрузки, и спровоцированные электрошоком разновидности электролитного дисбаланса в миокарде (Barthels et al, 1998; Asher & Ramsey, 2000; Buchanan et al, 2002; Dupret et al, 2005; Kerr et al, 2005; Telashima et al, 2006). Общим же звеном в молекулярных механизмах всех этих нарушений является нарастающий дефицит АТФ в миокардиоцитах (Radczek et al, 2003; Jalenski & Tropp, 2007).

Значительно компенсировать или даже восполнить этот дефицит возможно путём стимулирования резервных, т.е. не зависящих от потребления кислорода клеткой, реакций синтеза АТФ — реакций субстратного фосфорилирования. Большинство этих реакций обеспечиваются в митохондриях ферментами семейства киназ, осуществляющими
Mg²⁺-зависимый перенос фосфата от молекулы-донора (креатинфосфат, -глицерофосфат, фосфоенолпируват и др.) на АДФ (Tomassetti & Darnell, 2001). Адресная доставка активирующих катионов Mg²⁺ в места локализации этих ферментов могла бы способствовать снижению остроты дефицита АТФ.

Однако быстро и эффективно ликвидировать этот дефицит в условиях гипоксии возможно лишь при участии катионов единственного парамагнитного изотопа магния, ²⁵Mg²⁺ (Buchachenko & Kuznetsov, 2008; Buchachenko et al, 2004-2008; Kuznetsov et al, 2004-2008). Этот стабильный изотоп (распространённость в природе 11%) отличается от двух других, немагнитных, изотопов ²⁴Mg²⁺ и ²⁶Mg²⁺ тем, что обладает отличным от нуля ядерным спином (+2,5) и, как следствие, выраженным ядерным магнитным моментом (0,85 МБ). Магнитный изотопный эффект ионов ²⁵Mg²⁺, проявляемый в киназных реакциях, сводится к гиперактивации синтеза АТФ, не требующей присутствия кислорода (Buchachenko et al, 2005). Образование ион-радикальных пар с последующей синглет-триплет спиновой конверсией в них лежит в основе этого уникального эффекта (Бучаченко и соавт., 2006).

Приведённые данные говорят в пользу того, что ткань-селективная доставка в миокард ионов ²⁵Mg²⁺ могла бы стать радикальным средством борьбы с его тканевой гипоксией и её последствиями.

В этом случае исключительно важное значение приобретает вопрос о "миокард-нацеленном" переносчике этих ионов: введение чистых солей ²⁵Mg экономически нецелесообразно и чревато созданием хаоса в системе энергетического обмена во всех иных, нежели миокард, органах и тканях. Последнее обстоятельство (отсутствие ткань-селективного эффекта) является также фактором, серьёзно ограничивающим эффективность фармакологического применения препаратов солей АТФ в терапии и профилактике локальных гипоксий миокарда (Loewenhaupt et al, 2004).

Для направленного транспорта ²⁵Mg²⁺ в миокард разработана углеродная наночастица (1,8-2,0 нм) на основе К-порфинового аддукта циклогексил-фуллерена-С₆₀, структура и технология синтеза которой защищены патентами Европейского Союза (Sarkar et al, 2007 a, b). Данное соединение, получившее название "Порфиллерен-МС16" или РМС16 впервые исследуется как фармакологический агент в настоящей работе, которая является фрагментом обширной программы его всестороннего исследования в России, Италии и Иране (2005-2008).

Являясь водорастворимым амфифильным катионитом (Sarkar et al, 2007 a), РМС16 имеет Mg²⁺-удерживающий тетрапиррольный порфириновый домен, что позволяет надеяться на его "узнавание" миокард-специфическими порфирин-связывающими белками (ПСБ) мембран миокардиоцитов млекопитающих, известных благодаря работам Ioshida et al (1997-2004) и Wallerstrm et al (2002-2006). С этим связана возможность использования наночастиц РМС16 для адресной доставки микроколичеств ²⁵Mg²⁺ в ткань миокарда.

Изучению такой возможности и её фармакологического потенциала и посвящена эта работа. В качестве экспериментальной модели тканевой гипоксии использована модель Rilke-Bohmer (1994), основанная на избирательном ингибировании окислительного фосфорилирования нуклеотидов in vivo 1-метилникотинамидом.

Таким образом, актуальность диссертационной работы связана с изучением важной проблемы современной медицины – проблемы профилактики и лечения острых гипоксических нарушений энергетического метаболизма в миокарде с помощью магнитного изотопного эффекта ионов ²⁵Mg²⁺, реализуемого в клетках миокарда, благодаря направленному транспорту в них этого изотопа катионообменными наночастицами.

Цель работы

Оценка возможности коррекции биохимических проявлений гипоксии миокарда, вызванной у крыс введением 1-метилникотинамида, с помощью порфирин-фуллереновых наночастиц [²⁵Mg²⁺]РМС16 (“Porphylleren-MC16”, EU Pat. No. 07009882.7 / EP07009882, EU Pat. No. 07009881.9 / EP07009881).

Задачи исследования:

1. Определение основных параметров фармакокинетики наночастиц PMC16 при их однократном внутривенном введении крысам.

2. Определение эффективности и селективности адресной доставки ионов ²⁵Mg²⁺ в миокард крыс наночастицами PMC16 и последующего высвобождения этих ионов в норме и при гипоксическом тканевом ацидозе, вызванном введением
1-метилникотинамида (МНА).

3. Оценка основных биохимических параметров, характеризующих состояние энергетического метаболизма в миокарде крыс, на фоне действия in vivo наночастиц [²⁴Mg²⁺]РМС16, [²⁵Mg²⁺]РМС16 и [²⁶Mg²⁺]РМС16 в норме и при
МНА-индуцированной тканевой гипоксии.

4. Выделение, очистка, изучение внутриклеточной локализации и основных структурных особенностей миокард-специфического PMC16-узнающего рецептора, предположительно входящего в состав пула
порфирин-связывающих белков (ПСБ) мембран.

5. Изучение функционирования PMC16-рецептора in vitro: определение констант аффинности, анализ изотерм селективности связывания
«белок-лиганд».

Научная новизна исследования

1. ²⁵Mg²⁺-магнитный изотопный эффект, как элемент регуляции
   АТФ-продуцирующей активности клеток миокарда, не изучался ранее на моделях химически индуцированной гипоксии (1-метилникотинамид) in vivo.

2. Фармакологическая перспектива применения магнитного изотопного эффекта ²⁵Mg²⁺ для профилактики и лечения гипоксических нарушений энергетического обмена в клетках миокарда впервые является предметом научного исследования.

3. Впервые проведено изучение эффективности применения ²⁵Mg²⁺-переносящих катионообменных наночастиц «Порфиллерен-МС16» (РМС16), созданных на основе К-порфиринового производного фуллерена-С₆₀ (Бакминстерфуллерен-(C₆₀)-2-(бутадиен-1-ил)-тетра-(o-g-аминобутирил-o-фталил)-ферропорфирин), для профилактики и коррекции метаболической гипоксии миокарда, индуцированной 1-метилникотинамидом.

4. Впервые решена задача структурно-функионального изучения взаимодействия наночастиц РМС16 с тканеспецифическим К-порфирин-узнающим рецептором клеток миокарда.

Научно-практическая ценность

1. Представленная работа является фрагментом обширной международной программы исследований РМС16 и, следовательно, в случае её успешного завершения, данные работы по фармакокинетике и фармакодинамике будут элементом научного планирования дальнейших испытаний [²⁵Mg]PMC16.

2. Обнаруженная и изученная способность наночастиц [²⁵Mg]PMC16 избирательно доставлять катионы ²⁵Mg²⁺ в миокард и высвобождать их там в ответ на гипоксический ацидоз с последующей гиперактивацией синтеза АТФ по каналу субстратного фосфорилирования позволяет применять эти наночастицы как новый инструмент исследования Mg²⁺-зависимых ферментативных реакций энергетического обмена.

Внедрение полученных результатов

Разработана и внедрена новая высокоэффективная методика аффинной хроматографии для выделения и очистки порфирин-связывающих белков биологических мембран (митохондрии клеток миокарда), основанная на использовании РМС16 в качестве лиганда стационарной фазы.

Получен акт внедрения ²⁵Mg²⁺-переносящих катионообменных наночастиц «Порфиллерен-МС16» на базе ООО «Нановита» (г. Москва) с целью планирования дальнейших испытаний.

Апробация работы

Результаты работы доложены на научных конференциях молодых ученых ИХФ РАН (Москва, 2007, 2008); на научно-практической конференции «Индустрия здоровья-2008» (Крокус-Экспо-2008, Москва, 2008); на 2^й Пан-Азиатской конференции по нанобиотехнологиям (Аль-Айн, ОАЭ, 2006); на 31^м Конгрессе ФЕБО (FEBS-2006, Будапешт, Венгрия); на 9^м Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии стран Центральной Азии (Шираз, Иран, 2007); на 4^й Европейской конференции по метаболизму лекарств (Охрид, Республика Македония, 2007); на 7^м Европейском совещании по наночастицам в медицине и ветеринарии (Солоники, Греция, 2007); на 2^м Европейском совещании по нанофармакологии (Лимерик, Ирландия, 2008); на 3^й Конференции по наномедицине стран Северной Европы (Копенгаген, Дания, 2008).

Основные положения, выносимые на защиту

1. «Порфиллерен-MC16» (РМС16) представляет собой низкотоксичный водорастворимый катионит с размерами частиц 1.8-2.0 нм, обладающий способностью избирательно и прочно удерживаться миокард-специфичными порфирин-связываюшими белками, что позволяет использование данных наночастиц для адресной доставки в клетки миокарда катионов парамагнитного изотопа ²⁵Mg²⁺, обеспечивающих гиперактивацию реакций субстратного фосфорилирования нуклеотидов и, благодаря этому, эффективный синтез АТФ в условиях гипоксии.

2. Частицы РМС16 являются «умными» наноконтейнерами для катионов ²⁵Mg²⁺: находясь в состоянии устойчивого аффинного взаимодействия с порфирин-связывающими белками (рецепторами РМС16) мембран митохондрий миокардиоцитов, наночастицы высвобождают ²⁵Mg²⁺ только в ответ на метаболический ацидоз, возникающий вследствие тканевой гипоксии миокарда.

3. Рецептором для связывания наночастиц РМС16 служит миокард-специфический гидрофобный -глобулярный мономерный триптофан-богатый белок с молекулярной массой 17,6 kDa (122 аминокислотных остатка), локализованный в трансмембранном канале внешней мембраны митохондрий миокардиоцитов. Этот рецептор обеспечивает узнавание порфиринового домена РМС16 с высокой степенью селективной аффинности.

4. Особенности метаболизма РМС16 in vivo соответствуют представлениям о высокой степени биологической безопасности этого нанокатионита, порфириновый домен которого служит предшественником в реакциях биосинтеза гема, а фуллереновое ядро которого, являясь нетоксичным, вообще не метаболизируется и выводится с мочой.

5. Параметры фармакокинетики и фармакодинамики [²⁵Mg]PMC16 позволяют использовать данный агент для профилактики и коррекции острых экспериментальных митохондриальных дисфункций, вызванных подавлением окислительного фосфорилирования с помощью 1-метилникотинамида.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ: 4 в виде тезисов докладов на международных конференциях и конгрессах и 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК; из них 2 – в России и 4 – за рубежом.

Личный вклад автора

Соискатель принимал непосредственное участие в постановке задачи, проведении всех экспериментов, представленных в диссертации и обработке данных. Выводы диссертации сформулированы соискателем.

Структура и объём работы

Материалы диссертации изложены на 148 страницах машинописного текста, включая иллюстрации: 6 таблиц и 26 рисунков. Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 120 ссылок на работы отечественных ( 29 ) и зарубежных ( 191 ) авторов.

Ингаляционный дефицит кислорода

В условиях низкого парциального давления кислорода во вдыхаемой газовой смеси (высокогорье, полёт на высоте более 2000 м без специальной защиты) возникает острое кислородное голодание, прежде всего головного мозга и миокарда, быстро устраняемое при возвращении к нормальному режиму дыхания. Известны попытки превентивного снижения чувствительности клеток этих тканей к кислородному голоданию с помощью создания в них "резервного депо" (reserve pool) макроэргических соединений0—АТФ и.ГТФ [7], ацетил-коэнзима А [32] и фосфоенолпирувата [7, 32]. В экспериментах на животных показано, что коротки курс в/в инъекций перечисленных метаболитов в различных сочетаниях, предшествующий размещению крыс на срок до 24 часов на высоте 3826 м (плато Трегуальпа, Перу) позволил значительно замедлить развитие гипоксических нарушений метаболизма — таких как снижение уровня белкового синтеза, неиропроводимости, мышечного тонуса, а таюке предотвратить возникновение морфологических повреждений митохондрий (дисплазия, фрагментация) в нейронах коры головного мозга и в миокардиоцитах [7]. 1.3 Последствия интенсивных физических нагрузок Наиболее распространённая из всех причин тканевых гипоксии. Будучи обратимым физиологическим состоянием, такие гипоксии, тем не менее, рассматриваются специалистами в областях спортивной ветеринарии/медицины, военной медицины и медицины катастроф как нежелательные, требующие предотвращения и/или коррекции, явления [8]. При этом ситуации катастроф, как и спорт высоких достижений, являются уникальными, а доступ к сведениям о новинках в соответствующих сегментах фармакологической науки ограничен [54].

Список веществ, обозначаемых как "допинг" и обновляемый ежегодно МОК, насчитывает сегодня (2007) 1024 наименования, включая ксенобиотики (оксипирролидины и др.), метаболиты (сукцинил-КоА), гормоны (стероиды, катехоламины), соли металлов (Fe2+, Са2+), макроэрги (АТФ), компоненты крови (эритроцитарная масса) и др. [51]. Обобщая доступные данные, можно заключить, что медикаментозные средства профилактики рассматриваемого вида тканевых гипоксии относятся, в основном, к следующим группам веществ: витамины — предшественники кофакторов оксидоредуктаз (В2, РР, Q), гормоны — стимуляторы общего обмена (ТТГ, АКТГ, тироксин), средства заместительной терапии при дефиците макроэргов (АТФ, сукцинил-КоА), препараты геминового железа и кальция [8, 51- 54]. Обтурация одного или нескольких сосудов, принадлежащих к бассейну васкуляризации системы коронарных артерий (тромбоз, эмболия, внешнее сдавление), означает уменьшение объёма циркуляции крови внутри определённого фрагмента сердечной мышцы. Для тех случаев, когда радикальное (хирургическое) вмешательство не показано, частично компенсировать (но не восстановить полностью) пониженный вследствие кислородного голодания уровень метаболических процессов в миокарде возможно благодаря применению таких лекарственных средств, как глицеролтринитрат [52]; сиднонимины (Молсидомин), уменьшающие преднагрузку на сердце за счёт снижения давления в лёгочной артерии и в крупных венах [51]; /5-адреноблокаторы (Метипранолол) [53]; стимуляторы метаболизма из группы предшественников АТФ (Инозин) [54]; миокард-селективные антиоксиданты (2-этил-6-метил-3-оксипиридин-сукцинат) [55] и активаторы цитохромоксидазы (Триметазидин) [51]. Следует заметить, что применение всех этих препаратов является паллиативной мерой, не способной привести к полному восстановлению нарушенного метаболизма [55]. К недостатку этих методов фармакотерапии нужно отнести и возможность значительного числа побочных эффектов со стороны /3-адреноблокаторов [53] и сиднониминов [51]. Прямым и серьёзным последствием электротравмы является возникновение хаоса в работе Na+- и К+-переносящих каналов в мембранах нейронов, поперечнополосатых мышечных клеток и миокардиоцитов [9]. Двусторонний транспорт этих потенциал-формирующих ионов представляет собой активный, то есть протекающий противоположно вектору градиента концентрации, АТФ-зависимый процесс, осуществляемый ферментами семейства пермеаз [49]. Последние представлены в мембранах сложными белками с четвертичной структурой, АТФ-гидролизующий домен которых перестаёт взаимодействовать с ион-переносящими участками после воздействия электрическим разрядом [38,39]. В этом случае мембраносвязанный пермеазный комплекс начинает бесконтрольно потреблять АТФ, не расходуя высвобождаемую энергию на ионный транспорт: фермент работает "вхолостую", истощая внутриклеточный фонд АТФ [50]. Клеточный метаболизм повреждается по "гипоксическому" типу — возникает дефицит АТФ, удельное потребление кислорода тканью снижается [39, 46].

Методы специфической фармакологической защиты не разработаны. Описаны случаи успешного применения кардиотонических средств (допамин, кофеин) в сочетании с натриевой и калиевой солями АТФ [51]. 1.6 Опыт фармакологического применения наночастиц Накопленный к настоящему времени опыт такого рода весьма небогат. Наночастицами медицинского назначения (medicinal nanoparticles) сегодня принято считать медленно метаболизируемые in vivo (или не метаболизирующиеся вовсе) структуры, размер и форма которых не зависит от физико-химических свойств среды (рН, Т С, hv и др.) при том, что существует прямая зависимость между размером этих частиц, не превышающим 100 нм, и качественной составляющей вызываемых ими биологических эффектов [56]. Привлекательной особенностью использования наночастиц в фармакологии является их высокая способность проникать через полупроницаемые биологические барьеры и, в то же время, достаточно долго удерживаться на поверхностях последних за счёт гидрофобных и электрофильных взаимодействий [57]. Это, в свою очередь, позволяет разрабатывать технологии адресной доставки к тканям — мишеням лекарств, иммобилизированных на наночастицах, обладающих необходимой степенью аффинности к структурам этих мишеней [58]. Наночастицы коллоидного металлического золота (10-20 нм), несущие монослой молекул полиадениловой кислоты с размерами полинуклеотидных цепей 70-100,,, применялись для пополнения истощённого пула АТФ (за счёт внутриклеточного гидролиза поли(А)) в клетках обонятельного нерва мартышек с пост-кокаиновым синдромом, включающим значительный гипоксический .компонент [59]. В этой, как и в ряде аналогичных работ, не удалось достичь хорошего клинического результата, хотя факт проникновения наночастиц внутрь аксонов и дендритов из синаптических щелей glomerulus olfactorius и был убедительно доказан [60]. Покрытые лецитином полистереновые наночастицы (50-80 нм, 100-120 нм) использовались для стабилизации мембран гепатоцитов и фибробластов человека в культуре при исследовании гипоксии, вызванной 1-метилникотинамидом (конкурентный антиметаболит НАД и НАДФ) in vitro [56]. Наночастицы на основе иридия (20-30 нм) и Мп02 (10-40 нм) способствуют восстановлению интенсивности эритропоэза, нарушенного при отравлениях угарным газом, у мышей и крыс. Механизм последнего эффекта, предположительно связанного с избирательной тропностью наночастиц к гемоцитобластам, остается неясным, несмотря на факт прямой корреляции между кинетикой накопления частиц в клетках и уровнем потребления в них кислорода [60].

Опыт фармакологического применения наночастиц

Белки митохондрий кодируются генами как митохондриального, так и ядерного происхождения [38]. Полагают, что нарушения функций митохондрий вносят вклад в развитие некоторых нейродегенеративных болезней, в частности, болезни Паркинсона, хореи Гентингтона и старческого слабоумия при болезни Альцгеймера [39]. ДНК митохондрий по ряду признаков отличается от ядерной ДНК. Она передаётся к потомку с цитоплазмой яйцеклетки (материнское наследование). Мутации в митохондриальной ДНК приводят к появлению гетерогенной популяции, состоящей из нормальных и изменённых молекул, которые случайным образом распределяются среди дочерних клеток. Вероятность мутаций увеличивается с возрастом, а степень нарушения энергетической функции отражает долю мутировавшей митохондриальной ДНК. Митохондрии служат главным источником свободных радикалов, что объясняет более высокую частоту мутирования митохондриальной ДНК по сравнению с ядерной [39, 42, 52]. К числу наследственных митохондриальных болезней относятся наследственная зрительная нейропатия Лебера и синдром MELAS (миопатия, энцефалопатия, лактатацидоз) [39, 61]. Клиника митохондриальных болезней отражает в первую очередь поражение нервной и мышечной систем. Патология может быть обусловлена наследственными дефектами в отдельных звеньях цепи транспорта электронов (дефекты цитохромов), фосфорилирования (неполноценность АТФазы митохондрий) или транспорта жирных кислот [36, 61]. При недостаточности цитохрома с или пируватдегидрогеназы возникает синдром Лея. Он обусловлен симметричными очагами поражения нейронов в спинном и головном мозге, что проявляется в задержке умственного развития, мышечной слабости, атаксии и судорогах. В ЦНС накапливаются лактат и пируват [39, 44]. Дисфункция митохондрий может быть вызвана недостатком витаминов — предшественников кофакторов митохондриальных дегидрогеназ, входящих в состав электрон-транспортных цепей, либо присутствием антиметаболитов этих витаминов [39]. Так, витамин РР (никотиновая кислота и её амид), являясь предшественником НАД и НАДФ, необходим для обеспечения первого этапа окислительного фосфорилирования — переноса электрона и протона от окисляемого субстрата на ФАД.

Дефицит этого витамина, приводящий к развитию пеллагры [39, 53], может приводить к полному прекращению утилизации кислорода клеткой и к гипоксической грануло дегенерации митохондрий [52]. Поражение НАД-зависимого звена антиметаболитами витамина РР приводит к серьезным патологическим изменениям в работе митохондрий [20, 31, 39]. Например, отравление токсином МРТР (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетра-гидропиридин) вызывает у человека и приматов симптомы паркинсонизма с олигокинезией, ригидностью и тремором [39, 61]. НАД является субстратом фермента поли-АДФ-рибозилтрансферазы, активизирующейся при повреждениях молекул ДНК и способствующей их репарации [38]. При массивных повреждениях ДНК клеток чрезмерное использование НАД4" может привести к нарушению окислительных процессов и вызвать гибель клеток по некротическому или апоптотическому типу [37]. Напротив, отмечено успешное использование никотинамида для замедления скорости развития инсулинзависимого диабета в результате подавления некроза и апоптоза клеток в островках Лангерганса [50]. Другой антиметаболит витамина РР, 1-метилникотиыамид (МНА), является удобным инструментом исследования благодаря способности избирательно подавлять окислительное фосфорилирование (вызывает абортивный захват электрона), не затрагивая субстратное фосфорилирование нуклеотидов киназами [31, 37]. МНА-индуцированная гипоксия миокарда крыс может сопровождаться дисплазией и даже фрагментацией митохондрий [53]. Аналогичное витамину РР имеют значение для патологии митохондрий витамины В2 (предшественник ФАД и ФМН), Е (бензохинон) и К (нафтохинон) [39]. Последние два отличаются способностью участвовать в биосинтезе убихиноновых коферментов (Q), разделяющих пути переноса электронов и протонов в митохондриях [39, 40]. Известно лишь небольшое число высокотоксичных синтетических производных этих соединений, ограниченно применявшихся в экспериментах на изолированных митохондриях [53]. Витамин Е (а-токоферол) — антиоксидант, "перехватывающий" неспаренные электроны активных форм кислорода и тем самым предотвращающий образование пероксидов органических соединений in vivo [39]. Дефицит этого витамина сопровождается ускоренным "старением" митохондрий при повышенной частоте возникновения повреждений их мембран свободными и мембраносвязанными пероксидами [40]. Вследствие этого ослабляется АТФ-продуцирующая функция митохондрий и развивается гипоксия тканей [52].

В целом же, повреждение митохондрий играет решающую роль в гибели клетки от гипоксии. Нехватка кислорода нарушает работу митохондрий (в нейронах через 3-5 мин, в клетках сердца — через 20-180 мин и через несколько часов в фибробластах) [50]. При обратимой тканевой гипоксии митохондрии набухают, в них появляются вакуоли, на мембранах — складки, происходит накопление Са2+ в липопротеинах, затем разрыв мембран и их посмертная кальцификация [49]. Отчасти материал этого раздела уже рассмотрен выше на примерах побочных эффектов лекарств и биологической активности некоторых ядов и антиметаболитов (1-1, 1-6, П-2). В этом разделе будут рассмотрены эффекты тех ксенобиотиков, для которых идентифицированы конкретные митохондриальные структуры, отвечающие за взаимодействие с ними. Значительный прогресс достигнут в изучении мико- и альгиотоксинов, прерывающих транспорт электронов в . строго определённых местах митохондриальной цепи окислительного фосфорилирования [38]. Так, гетероциклический антибиотик миксотиазол, вырабатываемый клетками Pseudomonas aeruginosa, необратимо и избирательно блокирует в клетках млекопитающих убихиноновый домен локализованного на внутренней поверхности крист электрон-переносящего фермента НАДФ-убихинон-оксидоредуктазы [62]. Это ведёт к "гипоксическому шоку" и, нередко, гибели клеток при полном разобщении окислительного и субстратного каналов фосфорилирования АДФ [50]. Антимицин, полусинтетический антибиотик на основе полициклического компонента, продуцируемого различными видами Streptomyces, обладает исключительной аффинностью к цитохромному комплексу bci в митохондриях клеток эпителия и в фибробластах человека [38]. Данный агент перспективен как противораковый цитостатик, создающий эффект АТФ-депривации в клетках-мишенях [62]. Побочным действием препарата является, как и в случае Доксорубицина, гипоксия миокарда и нарушения гемопоэза [63]. Некоторые из соединений хинолонового ряда — такие как гептилгидроксихинолин-К-оксид — блокирует, и весьма избирательно, "сброс" протонов с убихинонового фактора Q, определя этим их перенос на кислород через систему цитохромов и, как следствие, приводя к образованию пероксида водорода вместо эндогенной воды [38]. Сходным образом влияет на работу митохондрий и гербицид 2,4-дихлорфеноксиацетат [39]. Во всех этих случаях глубокие нарушения оксидативной функции митохондрий означают высокий уровень токсичности препаратов.

Митохондрии и кардиотоксикология

Литература по этому вопросу содержит очень большое количество данных, подтверждающих то, что патогенез Доксорубицин-индуцированных кардиомиопатий включает тотальное ингибирование трансмолекулярного переноса фосфата в митохондриях миокардиоцитов [10, 12, 38]. Как отмечалось ранее, Доксорубицин (ДКР), известный противоопухолевый антибиотик, вызывает серьёзные побочные эффекты, связанные с его кардиотоксичностью [10]. ДКР оказывает прямое ингибирующее воздействие на митохондриальные АТФсинтазу [72], креатинкиназу [73], цАМФ-протеинкиназу [74] и фосфоенолпируваткиназу [63], приводя к комбинированному угнетению окислительного и субстратного каналов биологического фосфорилирования [72]. В результате развиваются все признаки локальной тканевой гипоксии миокарда, причины тканеселективности этого эффекта не выяснены [73-75]. Следует отметить, однако, что прямой эффект ДКР на активность ферментов семейства киназ (субстратное фосфорилирование) никогда не приводит к их полному ингибированию: степень подавления активности обычно составляет 30-40% для применявшихся паратерапевтических доз препарата (0,05-0,1 DL50) [10, 12]. Известная кардиотоксичность другого класса противораковых антибиотиков, антрациклинов, также связана с повреждением функций митохондрий миокардиоцитов. Так, мишенями для этих соединений служат нуклеотид-узнающие сайты миокард-специфических изоферментов креатинкиназы, ККг и КК5, отличающиеся от миокард-неспецифических изоформ (ККЬ КК3, КК4) уникальной топологией и высоким содержанием серина и аргинина [73]. Как видим, это — тот редкий случай, когда причина кардиоселективности эффекта вполне очевидна. Следствием же этого эффекта является заметное, но не критическое (в пределах 50-60% от нормы) снижение уровня синтеза АТФ в митохондриях при нормальном уровне потребления кислорода [73, 74]. Морфологические изменения митохондрий в этом случае, как правило, не развиваются [39]. Других случаев выраженной кардиотоксичности ксенобиотиков, непосредственно связанной с избирательным воздействием последних на функционирование митохондрий, приводящим к локальной гипоксии миокарда, не выявлено.

При этом необходимо учитывать вероятность т.н. метаболической гипоксии ткани [7], когда при нормальном обеспечении клетки кислородом он не потребляется вследствие блокад этапов окислительного фосфорилирования [7, 12, 32, 39]. Термином «фуллерены» обозначается группа высокосимметричных наноконструкций (1,0-3,2 нм), состоящих только из атомов углерода и имеющих идеально шаровидную (С6о) или эллипсоидную (С7о-С9о) форму [58]. Уникальность фуллеренов как класса химических соединений определяется особенностями их строения, а именно: замкнутой структурой молекулы и единой 7г-электронной системой [58, 60]. Особое место среди фуллеренов занимает молекула Сбо, обладающая наиболее высокой симметрией. Она имеет структуру правильного усечённого икосаэдра, в котором атомы углерода располагаются на сферической поверхности в вершинах 20 правильных шестиугольников и 12 правильных пятиугольников так, что каждый шестиугольник граничит с тремя шестиугольниками и тремя пятиугольниками, а каждый пятиугольник граничит только с шестиугольниками. Так как в молекуле С6о каждый атом углерода находится в вершинах двух шестиугольников и одного пятиугольника, он принципиально не отличим от других атомов углерода [76]. Уникальность строения и свойств молекул фуллеренов и их доступность в реальных количествах привели к тому, что после 1993 г. исследования как по биологической активности самих фуллеренов, так и по применению их самих и их производных в химии лекарственных веществ (medicinal chemistry) стали развиваться широким фронтом [77]. Не последнюю роль, вероятно, играла (и играет до сих пор) эстетическая привлекательность этих молекул [76, 78]. Поэтому в настоящее время можно смело сказать, что использование фуллеренов в биологии и экспериментальной медицине представляет собой отдельную, достаточно обширную область [77, 79]. Фуллерен-Сбо, непосредственно являющийся предметом нашего практического интереса, не растворим в воде в отличие от своих гетероциклических, ароматических и даже многих алифатических аддуктов [76]. Среди них немало амфифильных соединений, прекрасно внедряющихся внутрь липидного слоя клеточных мембран in vitro и in vivo даже в отсутствии взаимодействия с поверхностными рецепторами [56, 58]. Такая, прямо коррелирующая с гидрофобностью веществ, их неизбирательная мембранотропность во многих случаях сопровождается проявлением разнообразных форм биологической активности [80]. В частности, способность таких аминокислотных производных фуллерена, как С6о-Рго, Сбо-Arg и С60--аминокапроновая кислота, проникать через биологические мембраны и вызывать их деполяризацию, показана в работе [81], что эффективно используется в исследованиях механизмов нейротрансмиссии [82] и дифференцировки миобластов [56], проводимых на культурах клеток и тканей. Весьма интересны связанные с мембранотропностью противовирусные эффекты аддуктов Сбо- Например, карбоксипроизводные этого фуллерена в концентрации 10 мкМ ингибируют вирус Dengue-2 при освещении, т. е. по фотохимическому механизму, включающему в себя образование синглетного кислорода.

Однако противовирусное действие этого соединения может реализовываться и по другому механизму, так как в концентрации 40 мкМ оно практически полностью подавляет репликацию даже в полной темноте [83]. Более того, противовирусное действие, в основе которого лежит взаимодействие с мембранами, фуллерен-С6о проявляет и в составе комплекса с ПВП (поли- Т-винилпирролидон). Было показано, что этот комплекс ингибирует репродукцию вирусов гриппа А/Виктория/3 5/72 (H3N2) в дозах от 250 до 1000 мкг/мл, не проявляя при этом цитотоксического действия. В высоких дозах (500 и 1000 мкг/мл) действие комплекса было сравнимо с действием ремантадина. Сам ПВП, используемый в качестве полимера-носителя, никакой противовирусной активности не проявил. Отсюда можно сделать вывод, что именно фуллерен-Сбо представляет собой в этом случае истинное противовирусное начало. При этом, учитывая его низкое содержание в комплексе ( 1%), оказывается, что в мольном выражении противовирусная активность фуллерена-С6о значительно выше, нежели препарата сравнения ремантадина [56, 58]. Комплекс Сб(/ПВП способен ингибировать репродукцию не только РНК-, но и ДНК-содержащих вирусов, в частности вируса простого герпеса [84]. Так как почкование оболочечных вирусов в значительной степени зависит от текучести липидного бислоя наружной мембраны клетки, изменение механических свойств мембраны под действием фуллеренов, вероятно, и приводит к нарушению репликации вируса на стадии почкования. Таким образом, эти данные также свидетельствуют в пользу предположения о мембрапотропном типе действия комплекса С6о/ПВП [85, 86]. Среди других примеров противовирусной активности производных фуллерена следует упомянуть конъюгат фуллерена-Сб0 с со-аминокапроновой кислотой, подавляющей размножение ВИЧ и цитомегаловируса [87, 88]. Антибактериальное действие фенил- и олигокарбокси-фуллеренов-С60 также заявлено как пример возможного фармакологического применения, обусловленного мембранотропностыо этих соединений [89].

Фуллерены и нанофармакология

Ранее уже было приведено конвенциональное определение, данное понятию «медицинская наночастица» (medicinal nanoparticle) на 2м Международном конгрессе по наномедицине, проходившем в 2004 г. в Вене [56]. Нанофармакология, таким образом, это область фармакологической науки, изучающая механизмы биологических эффектов, фармакокинетику и разрабатывающая методы медицинского применения этих наночастиц [77, 128]. Несомненно, фуллерены и их производные заслуживают оставаться в фокусе многочисленных усилий, предпринимаемых для их исследования в рамках предмета и методов этого нового раздела фармакологии. Судьба фуллеренов в биологических и медицинских исследованиях складывалась непросто по разным причинам. Сначала исследователей постигло определённое разочарование в фуллеренах, так как эти вещества не дали такого быстрого выхода в виде лекарственных препаратов, как это произошло в своё время с адамантанами [129]. Но фуллерены — это всё же нечто другое, чем все известные ранее каркасные соединения [76-78, 128]. Долгое погружение в исследования о фуллеренах приводит к пониманию их необычного предназначения в молекулярной биологии и медицине. В то же время следует ещё раз подчеркнуть, что существенным преимуществом использования углеродных наноструктур в биологии и для медицинских целей является практически полное отсутствие «внутренней токсичности» у самого атома углерода, в отличие, например, от атомов тяжёлых металлов. Это приводит к тому, что если у углеродных наночастиц и наблюдаются какие-то токсические эффекты, то они связаны практически исключительно с размером и формой наночастиц. Заслуживает внимания позиция De Larco [130] и Bremmer et. al. [131], суть которой в том, чтобы относить биологически активные аддукты фуллерена-Сбо к категории т.н. фармакофоров, т.е. веществ, привлекательных для фармакологических исследований благодаря их биологическим эффектам и низкой токсичности. Дальнейшие исследования фармакологии и ксенобиохимии фуллереновых производных способно серьёзно пополнить арсенал современных лекарств и молекулярных инструментов для научных изысканий в различных сферах биологии и медицины.

Ряд авторов склонны рассматривать фармакофоры в целом, и фуллереновые производные в частности, как своего рода «концепт-кары» в фармакологии, т.е. как прообразы новых групп лекарственных средств [129-131]. Открытие гигантского изотопного эффекта изотопа магния-25 при ферментативном синтезе АТФ формирует новый взгляд на механохимию ферментов как молекулярных машин [17, 23, 24, 26]. Обнаружено, что активность ферментов АТФазы, креатин- и а-глицерофосфаткиназы, в которых ион Mg2+ имеет магнитно-изотопные ядра 25Mg, в 2-4 раза превосходит активность ферментов, в которых Mg2+ содержит бесспиновые, немагнитные изотопы 24Mg или 26Mg. Изотопный эффект однозначно доказывает, что синтез АТФ является спин-селективным процессом, в котором ион Mg2+ является реагентом, акцептором электрона [20, 31]. Синтез АТФ происходит в ион-радикальной паре, партнёрами которой являются оксирадикал AnpnMg+[18,21]. В 2000-2004 гг. А. Л. Бучаченко и соавт. измеряли скорость фосфорилирования АДФ с выходом АТФ тремя ферментами — креатинкиназой, АТФсинтазой и а-глицерофосфаткиназой, в которых ион Mg был замещён (полностыо или частично) его чистыми изотопными формами Mg , Mg и Mg . Среди них только Mg имеет магнитное ядро (спин ядра 5/2, магнитный момент — 0,855 магнетона Бора): ионы 24 26Mg2+ содержат бесспиновые, немагнитные ядра (напомним, что все изотопы магния стабильны, нерадиоактивны). Результат оказался впечатляющим: скорость синтеза АТФ ферментами, в которых ион Mg имел магнитное ядро Mg, была многократно выше, чем скорость образования АТФ теми же ферментами и в тех же условиях, но с бесспиновыми, немагнитными ядрами 24Mg и 26Mg. Никакого различия в скоростях синтеза АТФ ферментами с Mg и Mg не наблюдалось. Оба эти результата надёжно установлены для креатинкиназы, для АТФсинтазы, ФЕПК и для ГФК как на очищенных ферментах, так и в изолированных митохондриях миокарда крыс; в последнем случае ядерно-спиновый изотопный эффект магния установлен и в нативных митохондриях — где имеет место одновременно и субстратное, и окислительное фосфорилирование — ив митохондриях, в которых окислительное фосфорилирование предварительно избирательно подавлено 1-метилникотинамидом [19, 20, 28]. Открытый в реакции фосфорилирования изотопный эффект магния не зависит от масс ядер и потому не является классическим (кинетическим); это магнитный изотопный эффект — зависимость скорости реакции от ядерного спина и от магнитного момента ядер реагентов. Он был открыт в 1976 г. [31] и с тех пор обнаружен для ряда элементов (Н, С, О, Si, S, Ge, Sn, Hg, U) в химических [23, 31] и биохимических реакциях [17, 18-30].

Существование магнитного изотопного эффекта в любой реакции — надёжное, однозначное и прямое доказательство того, что реакция является спин-селективной: в ней участвуют парамагнитные интермедиаты — радикалы или ион-радикалы, а также радикальные (или ион-радикальные) пары. Итак, в случае ферментативного фосфорилирования АДФ и ГДФ изотопный эффект является чистым, не замаскированным. Во-первых, используются чистые изотопные формы магния, и каждый изотоп «работает» независимо, самостоятельно. Во-вторых, изотопный эффект измеряется по скорости реакции, а не по фракционированию изотопов. В-третьих, эффективность АТФсинтазы с 24Mg2+ и Mg одинакова, т.е. классический, массзависящий изотопный эффект ничтожен. Только АТФсинтаза с 25Mg2+ обнаруживает аномально высокую эффективность. Здесь причина не в массе ядра, а в его магнитном моменте: ядро 25Mg является магнитным, а ядра 24Mg и 26Mg — бесспиновые, немагнитные. Отсюда следует однозначный вывод, что причиной аномальной активности АТФсинтазы с 25Mg2+ является магнитный изотопный эффект [27, 29, 31]. Сопровождающая магнитный изотопный эффект магния-25 (МИЭ) спиновая конверсия открывает дополнительный канал синтеза АТФ; она индуцируется магнитным ядром 31Р в фосфатном анион-радикале и особенно магнитным ядром 25Mg в катион-радикале 25Mg+. Именно .присутствие этого ядра почти утраивает скорость фосфорилирования за счёт триплетного канала; детальный механизм представлен в работах [18, 20-22, 28, 29]. Поскольку 25Mg2+-MH3 проявляется и в реакциях ІУ 2+-содержащих ферментов прямого, субстратного, фосфорилирования АДФ (КК, ГФК, ФЕПК), то гиперпродукция АТФ, вызываемая МИЭ, идёт и в отсутствие кислорода [20, 22]. Практически значимым следствием из приведённых данных по магнитному изотопному эффекту 25Mg может служить возможность его использования для обеспечения гиперактивации образования АТФ в митохондриях клеток тканей, страдающих от той или иной формы тканевой гипоксии [19, 28]. Такая гиперактивация не зависит от присутствия в клетке кислорода и может способствовать быстрой и полной компенсации внутриклеточного дефицита АТФ. 4.2 Фармакологическая целесообразность и возможности избирательной (адресной) доставки катионов 2SMg2+ в миокард.

Похожие диссертации на Порфирин-фуллереновые наночастицы (\!\#225#1Mg#2+#1\?\)#34#1PMC16 в коррекции митохондриальных дисфункций, индуцированных в клетках миокарда крыс 1-метилникотинамидом

Влияние опиатов, производных ГАМК и бензодиазепинов на агрессию и тревогу лактирующих крыс и общительность детенышей крысКосенкова, Наталия Сергеевна

Фармакологическая регуляция функции Na#2+#1-K#2+#1-2Cl#2-#1-котранспортера скелетных мышц и изучение его роли в гомеостазе калия и водыГосманов Айдар Рауисович

Местноанестезирующие свойства некоторых N-аминоэтилзамещенных 2-арилимидазо[1,2-a]бензимидазолаВасильева, Светлана Викторовна

Местноанестезирующие свойства некоторых 1- и 9-замещенных 2-трет-бутилимидазо[1,2]бензимидазолаБогус, Саида Казбековна

Поиск новых антидепрессантов в ряду производных 1,2,4-триазола и тиетан-1,1-диоксидаГабидуллин Ришат Анварович

Класс производных 1,2,4-триазола как источник новых антиаритмических и диуретических лекарственных средствМутин, Игорь Николаевич

Фармакологическая активность аминозамещенных 1,2,4-триазолаЛитарова, Ольга Ивановна

Фармакологическая активность производных N-арилкарбаматов и 1,2,4-оксадиазолов [Электронный ресурс]Останина Мария Владимировна

Фармакодинамические и фармакокинетические свойства соединения - N#39#1-производных имидазо\NU1,2-а\NWбензимидазола, обладающего противоязвенной активностьюСперанская Анна Сергеевна

Фармакологическая и экстракорпоральная коррекция дисфункции сосудистого эндотелия при церебральном атеросклерозеВаизова Ольга Евгеньевна