Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. механизмы центральной регуляции половой функции 17
1.1. Гормональная регуляция половой функции 18
1.2. Роль различных структур мозга в регуляции половой функции..23
1.3. Значение нейромедиаторных систем мозга в регуляции половой функции 30
1.4. Влияние стрессорных воздействий на половое поведение самцов 46
1.5. Половой диморфизм развивающегося мозга в раннем онтогенезе 50
1.6. Влияние химических соединений холинотопными свойствами на онтогенетическое развитие медиаторных систем мозга 53
1.7. Взаимодействие холинергических механизмов с нейромедиатор ными системами дофамина и серотонина 71
1.8. Нейрональные механизмы действия андрогенов и холинергическая регуляция 73
Глава 2. Методы исследования 81
2.1. Выбор животных 81
2.2. Экспериментальные модели 81
2.3. Стереотаксические и нейрохирургические методы 82
2.4. Тест «половое поведение» 83
2.5. Стрессорные воздействия, применяемые к взрослым животным ..85
2.6. Холинергические воздействия в пренатальном периоде 85
2.7. Биохимические методы исследования 87
2.8. Определение гормонов методом иммуноферментного анализа 89
2.9. Нейрофизиологический метод исследования 90
2.10. Фармакологические препараты 92
2.10. Статистический анализ 92
Глава 3. Результаты собственных исследований 93
3.1. Роль М- и Н-холинергических систем в регуляции половой функции самцов 93
3.1.1. Влияние М- и Н-холинолитиков на структуру полового поведения 94
3.1.2. Влияние препаратов М- и Н-холинолитиков на половую активность самцов в зависимости от гормонального статуса 99
3.1.3. Взаимодействие препаратов холинергической и дофаминергической систем в реализации
половой функции самцов 104
3.1.4. Холинергическая модуляция активности основных медиаторных систем и гонадных гормонов у интактных и гипогонадных самцов 106
3.1.5. Взаимодействие галантамина с дегидроэпиандростероном в усиление половой функции у гипогонадных самцов 110
3.1.6. Исследование роли М- и Н-холинергических систем в стресс-реактивности организма в тесте полового поведения... 115
3.1.7. Заключение к разделу 129
3.2. Влияние холинергических средств на пренатальное развитие основных медиаторных систем мозга 132
3.2.1. Эффект М- и Н-холинолитиков на пренатальное развитие моноаминергическое системы головного мозга у 20-дневных плодов крыс 133
3.2.2. Отдаленные нейрохимические последствия пренатального воздействия селективных М- и Н-холинолитиков у 2-месячных потомств крыс 140
3.2.3. Исследование половой фунцкии 3,5-4 месячных самцов, подвергнутых пренатальному воздействию М- и Н-холинолитиков 150
3.2.4. Эндокринные изменения у потомств самцов, подвергнутых пренатальному воздействию М- и Н-холинолитиков 158
3.2.5. Стрессреактивность потомства самцов, подвергнутых пренатальному воздействию М- и Н-холинолитиков при реализации полового поведения 160
3.2.6. Коррекция половой дисфункции самцов, подвергнутых пренатальному воздействию М- и Н-холинолитиков 161
3.2.7. Заключение к разделу 163
3.3. Андрогенозависимая влияние холинотропных препаратов на биоэлектрическую активность головного мозга 167
3.3.1. Андрогенозависимое влияние М-холинолитика метамизила на биоэлектрическую активность головного мозга 168
3.3.2. Действие антихолинэстеразного препарата галантамина на биоэлектрическую активность головного мозга у гонадэктомированных кроликов 177
3.3.3. Заключение к разделу 181
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 183
Выводы 232
Практические рекомендации 235
Литература 236
- Значение нейромедиаторных систем мозга в регуляции половой функции
- Стрессорные воздействия, применяемые к взрослым животным
- Холинергическая модуляция активности основных медиаторных систем и гонадных гормонов у интактных и гипогонадных самцов
- Эффект М- и Н-холинолитиков на пренатальное развитие моноаминергическое системы головного мозга у 20-дневных плодов крыс
Введение к работе
Актуальность проблемы
Половая функция является важнейшим компонентом репродуктивной системы организма. В развитых странах мира частота половых расстройств у мужчин неуклонно повышается, что определяет актуальность изучения механизмов нормальной и измененной половой функции (ВОЗ, 2004). Половая функция является сложным интегративным процессом, состоящим из центральных мотивационных и периферических копуляторных механизмов, которые координируются на разных уровнях с вовлечением нейро-нальных структур, нейромедиаторных и нейроэндокринных систем. Большинство исследований механизмов регуляции мужской половой функции сосредоточено на его завершающей фазе (коитус), тогда как начальная, мо-тивационная фаза (либидо), регулируемая центральными механизмами, остается малоизученной (Pfaus et al., 2001; Agmo et al., 2004, Амстиславская Т.Г., 2002, 2006). Поскольку именно с активации лимбических структур мозга и гипоталамуса запускается половая функция самцов, исследование мотивационного обеспечения адекватного полового поведения является актуальной современной задачей.
Механизмы, регулирующие половую функцию, в значительной степени обеспечиваются нейрональными процессами преоптической зоны гипоталамуса, которые активируются различными нейромедиаторпыми системами (Bitran, 1987; Dorner, 1989; Gladkova, 2000). Холинергическая активация преоптической области, по мнению многих исследователей, является критической для осуществления нормального коитуса, а введение М-холиноблокатора скополамина в эту область задерживает инициирование копуляции (Hull, 1988; Retana, 1993). Несмотря на большое число исследований, посвященных роли нейромедиаторных систем в обеспечении репродуктивной функции, в литературе очень мало сведений об участии холи-нергической системы мозга в центральных механизмах регуляции мужской
половой функции во взаимосвязи с функциональным состоянием нейро-эндокринных систем. Также не исследована роль холинергических механизмов в реализации полового поведения при различных видах стресса. Известно, что репродуктивная функция организма подвержена модификации различными факторами, в частности, стрессорным воздействием. В основе таких модификаций лежат нарушения центральных регуляторных механизмов, играющих ключевую роль в возникновении половой мотивации, от которой зависит реализация половой функции.
Нормальная экспрессия мужской половой функции во взрослом состоянии зависит от функциональной целостности нейрональных цепей и неиромедиаторных систем, вовлеченных в этот процесс в течение раннего развития мозга в пренатальном периоде. Особое значение приобретают неблагоприятные воздействия в период раннего онтогенеза, когда развитие функциональных систем протекает наиболее быстрыми темпами и может быть легко изменено или модифицировано внешними воздействиями (Cabrera et al., 1999; Gerardin et al., 2005). Неблагоприятное воздействие многих химических факторов (никотин, барбитураты и др.) на развивающийся мозг плода в пренатальном периоде опосредовано изменением активности холинергической системы и с последующим проявлением когнитивно-поведенческих дефицитов у взрослых потомств (Slotkin, 1992, 2004; AvitalBeer, 2005). Несмотря на эти факты, в литературе отсутствуют сведения о нейрохимических и поведенческих эффектах пренатального воздействия селективных агонистов и антагонистов М- и Н-холинорецепторов, а также их влияние на динамику развития неиромедиаторных систем мозга на этапах онтогенеза и на половую функцию у взрослого потомства. Изменение активности холинергических механизмов головного мозга в критические сроки пренатального развития может оказать воздействие на целостность формирования медиаторных систем мозга, дифференцирующего эффекта
гонадных гормонов на развивающийся мозг, и тем самым, на проявления половой активности и адекватного полу сексуального поведения у взрослого потомства. Актуальность исследования пренатальных эффектов холинергических факторов на центральные механизмы половой функции и гормональный статус в процессе развития обусловлена необходимостью профилактики и лечения последующих половых дисфункций и аномального полового поведения.
Важную роль в механизмах формирования половой поведения, в особенности ее аппетентных или мотивационных аспектов играет взаимодействие нейромедиаторных систем мозга, интегрирующее моторные, вегетативные и эндокринные компоненты половой функции. Ацетилхолин (АХ) является медиатором, опосредующим передачу неспецифической информации к неокортексу из подкорковых структур (ретикулярная формация, гипоталамус) и участвует в функционировании корковой активирующей системы (Krnjevic, 1967; Кожечкин С.Н., 1982). Несмотря на важную роль холинергической системы в различных аспектах деятельности ЦНС (Аничков СВ., 1958, 1962; Голиков С.Н., 1956, 1965; Денисенко П.П., 1963, 1965; Сапронов Н.С. 1968; Лосев Н.А., 1968), очень мало исследовано её значение в формировании нейрофизиологических коррелятов биоэлектрической активности мозга в зависимости от эндокринного статуса организма, в изменении возбудимости и подвижности нервных процессов в структурах мозга при дисбалансе гонадных гормонов.
Таким образом, предпосылкой для проведения настоящего исследования явилась недостаточная изученность роли холинергической системы в регуляции половой функции самцов. Для понимания механизмов холинергической регуляции необходимо исследование способности самцов реализовать половую функцию в условиях фармакологической модуляции активности центральных М- и Н-холинорецепторов и других
нейрохимических регулирующих механизмов в зависимости от эндокринного статуса и факторов внешней среды, действующих в разные периоды онтогенеза.
Цель исследования
Цель исследования состояла в экспериментальном изучении роли хо-линергической системы в нейромедиаторных, эндокринных и нейрофизиологических механизмах регуляции половой функции самцов в разные периоды онтогенеза.
Задачи исследования:
Изучить половое поведение самцов крыс и закономерности поведенческих изменений, обусловленных введением М- и Н-холинергических средств в зависимости от гормонального статуса животных.
Исследовать нейрохимические и нейроэндокринные механизмы регуляции половой функции в условиях модуляции активности центральной холинергической системы.
Изучить особенности полового поведения гипогонадных самцов крыс после введения холинергических, дофаминергических средств и андроге-нов.
Оценить влияние неблагоприятных факторов (стрессовое воздействие, введение холинергических веществ), действующих в разные периоды онтогенеза, на половую функцию и нейроэндокринный статус самцов крыс.
Исследовать нейрональные механизмы центральной холинергической регуляции в интегративной деятельности мозга по данным спонтанной и вызванной электрической активности некоторых структур головного мозга кроликов в условиях дефицита и избытка стероидных гонадных гормонов в организме.
Выявить роль М- и Н-холинергических механизмов в становлении полового поведения в пубертатном периоде онтогенетического развития по-
томства и в метаболизме основных нейромедиаторов в структурах мозга самцов крыс.
7. Изучить отдаленные поведенческие, нейрохимические и гормональные эффекты у потомства крыс, подвергнутых пренатальному воздействию М-и Н-холинолитиков.
Научная новизна
В работе впервые исследована роль холинергической системы в становлении половой функции самцов крыс в онтогенезе в зависимости от их нейроэндокринного статуса. Доказано, что действие М- и Н-холинергических средств на половое поведение самцов зависит от гормонального статуса организма. В условиях экспериментально индуцированного гормонального дефицита активация М-холинергической системы полностью восстанавливает нарушенную половую функцию самцов. Кроме того, показано, что в нейрохимических эффектах холииергических средств на половую функцию помимо прямой активации М-холинергической системы мозга важную роль играет активация дофаминергических механизмов лимбических образований мозга.
Несомненно важным результатом работы является выявление высокой чувствительности медиаторных систем головного мозга эмбрионов к воздействию селективных антагонистов М- и Н-холинергической системы в пренатальном периоде, особенно в ранние сроки гестации. Вызванные ими нарушения сохраняются в ходе постнатального онтогенеза и проявляются при реализации поведенческих реакций, в частности, полового поведения у взрослых самцов. Пренатальное воздействие Н-холинолитиком ганглероном и в меньшей степени М-холинолитиком метамизилом приводит к отдаленным поведенческим нарушениям, характеризуемым низкой половой активностью и нарушениями полового поведения у половозрелых потомств самцов.
Важным является доказательство того, что механизм нарушения
половой функции у половозрелых потомств связан с дисбалансом содержания нейромедиаторов дофамина (ДА) и серотонина (5-ГТ) в мозге плодов. Так, отдаленным последствием пренатального воздействия холинолитиков на организм беременной самки является снижение дофаминергической активности в лимбических структурах мозга плода в постнатальном периоде. Блокада Н-холинорецепторов ганглероном ингибирует выброс ДА, НА и 5-ГТ. Медиаторная дисфункция у половозрелых самцов, как отдаленный эффект пренатального воздействия холинолитиков, предопределяет поведенческие нарушения и половую дисфункцию у потомства.
Выявлено разное участие М- и Н-холинергических механизмов в эффектах холинергических средств на половую функцию самцов на этапах онтогенеза. Оно состоит в том, что половая активность цзрослых самцов в пределах холинергической системы регулируется М-холинергическими механизмами, а в период пренатального развития в большей степени зависит от активности Н-холинергической системы.
Впервые выявлена высокая значимость активности холинергической медиаторнои системы для стрессреактивности организма в тестах изучения полового поведения. Стресспротекторное свойство антихолинэстеразного препарата галантамина зависит от вида стресса; при этом наиболее значительный потенцирующий эффект от применения холинергических средств наблюдается при эмоциональным стрессе в сравнении со стрессом, обусловленным воздействием физического фактора. Показано, что механизм действия галантамина при стрессе, помимо прямой М-холинергической активации нейрональных структур мозга, включает также нейроэндокринную и дофаминергическую системы, участвующие в реализации половой функции.
В работе показана, что влияние холинергических средств на половую активность самцов связано с изменением возбудимости нейрональных
структур лимбической системы мозга, что наиболее ярко проявляется в условиях дефицита андрогенов. При этом активность М-холинорецепторов играет важную роль для реализации эффектов половых стероидов, их взаимодействия со стероидочувствительными ядрами головного мозга. Показано, что нарушение рецепции андрогенов при гонадэктомии вызывает изменение характера действия холинергических средств на биоэлектрическую активность нейронных популяций центральных нервных структур и, тем самым, обусловливает дальнейшее изменение поведенческого ответа на внешний сексуальный стимул.
Научно-практическая значимость. Теоретическая значимость работы заключается в обосновании положения, что половая функция самцов в значительной степени определяется состоянием холинергической медиа-торной системы мозга и уровнем андрогенов. При гормональном дефиците фармакологическая активация М-холинергической системы полностью восстанавливает нарушенную половую функцию самцов. Нейрофизиологические механизмы реализации половой функции у гипогонадных самцов связаны с активацией М-холинорецепторов, которые обусловливают высокоамплитудную возбудимость нейрональных структур и более длительную потенциацию этого возбуждения по сравнению с нормальным гормональным фоном. В процессе холинергической регуляции половой функции решающая роль принадлежит непосредственной активации М-холинер-гических механизмов мозга и опосредованной активации дофаминергиче-ской системы лимбических структур. В пренатальном периоде, особенно в ранние сроки гестации, отмечена высокая чувствительность основных ме-диаторных систем мозга эмбрионов к воздействию селективных антагонистов М- и Н-холинергической системы, приводящих к отдаленным нарушениям половой функции у половозрелых потомств самцов. Важным практическим выводом работы является доказательство, что дефицит половой активности взрослого потомства может быть компенсирован с помощью
агонистов ДА и АХ. Полученные в работе данные могут способствовать разработке новых методов лечения половых расстройств, в том числе и наследственно обусловленных и решению проблемы коррекции половых расстройств с целью гармонизации межполовых отношений. Основные положения, выносимые на защиту:
М-холинергическая система мозга, являющаяся важным звеном в центральной регуляции полового поведения самцов крыс, регулирует количественные и качественные параметры полового поведения. Действие холинотропных средств на половую активность зависит от гормонального статуса организма, в частности, от уровня андрогенов.
Холинергические механизмы активации половой функции самцов связаны с активностью дофаминергических механизмов лимбических структур мозга. При этом агонисты М-холинергической и дофаминергиче-ской медиаторных систем мозга активируют половую функцию посредством разных механизмов и усиливают эффекты друг друга. Усиление половой функции зависит от баланса нейромедиаторов ДА, НА, 5-ГТ и уровня стероидов в мозге.
Холинергическая система головного мозга эмбрионов крыс уязвима для действия селективных М- и Н-холинолитиков. Их введение в пренатальном периоде вызывает дисбаланс в функционировании нейромедиаторных систем (преимущественно дофаминергической) лимбической системы мозга и подавление продукции тестостерона.
4. Нарушения нейромедиаторного обмена в пренатальном мозге
самцов сохраняются в ходе постнатального онтогенеза и проявляются
стойкими изменениями половой функции. Основной причиной
пониженной половой активности у потомств самцов является низкая
дофаминергическая активность и низкий уровень продукции гормона
тестостерон в организме.
5. Устойчивость к стрессу в тестах изучения полового поведения у самцов зависит от состояния холинергической и дофаминергической активности структур лимбической системы мозга и уровня тестостерона в крови. Действие холинергических средств на половую активность самцов крыс более выражено в условиях дефицита андрогенов (в гипогонадном состоянии).
Научно-практическая ценность работы
Теоретическая значимость работы заключается в обосновании положения, что половая функция самцов в значительной степени определяется состоянием холинергической медиаторной системы мозга и уровнем андрогенов, регулирующих возбудимость нейрональных структур лимбической системы мозга. При индуцированном гормональном дефиците активация М-холинергической системы полностью восстанавливает нарушенную половую функцию самцов. Нейрофизиологические механизмы реализации половой функции у гипогонадных самцов связаны с активацией М-холинорецепторов, которые обусловливают высокоамплитудную возбудимость нейрональных структур и более длительную потенциацию этого возбуждения по сравнению с нормальным гормональным фоном. В процессе холинергической регуляции половой функции решающая роль принадлежит непосредственной активации М-холинергических механизмов мозга и опосредованная активация дофаминергической системы лимбических структур. Эти механизмы регулируют устойчивость к стрессу и поддержание половой функции в условиях стресса. Большой интерес представляет высокая чувствительность медиаторных систем головного мозга эмбрионов к воздействию селективных антагонистов М- и Н-холинергической системы в пренатальном периоде, особенно в ранние сроки гестации, которые приводят к отдаленным нарушениям половой функции у половозрелых по-томств самцов. При этом нарушается баланс содержания нейромедиаторов (ДА, НА, 5-ГТ) в лимбических структурах мозга. Важным практическим
выводом работы является доказательство, что дефицит половой активности половозрелых потомств самцов может быть компенсирован с помощью агонистов ДА и АХ. Полученные данные будут способствовать разработке новых методов лечения половых расстройств. Работа относится к фундаментальным исследования половой дисфункции, в том числе и наследственно обусловленной, и вносит крупный вклад в решение проблемы коррекции половых расстройств с целью гармонизации межполовых отношений.
Апробация и публикация материалов исследования
Материалы, вошедшие в диссертацию, доложены на 22-м ежегодном конгрессе по нейропсихофармакологии (Брюссель, Бельгия, 2000), на VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2000), в 21-м региональном конгрессе по психонейроэндокринологии (С.Петербург, 2001), на 23-м конгрессе международного общества психонейроэндокринологии (Пиза, Италия, 2003), на международной конференции «Нейрохимия. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), на 8-м конгрессе Европейского общества нейропсихофармакологии (Москва, 2005), 4-й международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006), на 4-м региональном конгрессе по психонейроэндокринологии «Стресс и психоэндокринные изменения в жизненном цикле» (Вильнюс, Литва, 2006), на международной конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности ЦНС» (Пенза, 2006), VII международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, Украина, 2006), 1-й конференции Российской ассоциации психонейроэн-докринологов (С-Петербург, 2008), 3-м Китайско-Российском международном симпозиуме по фармакологии (Китай, Харбин, 2008).
Апробация диссертации состоялась в мае 2008 г. на совместном заседании академической группы академика РАМН Ф.Г.Углова при НИИ
акушерства и гинекологии имени Д.О.Отта, кафедры фармакологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова и кафедры урологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова.
По теме диссертации опубликована 31 работа, из них 19 статей (10 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК).
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований (включающей 3 подраздела), обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 304 страницах машинописного текста, иллюстрирована 34 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель содержит 603 наименований, в том числе 74 отечественных и 539 иностранных.
Значение нейромедиаторных систем мозга в регуляции половой функции
Мужская репродуктивная функция регулируется активностью нескольких медиаторпых систем. Их влияние на ПП сложно и часто неоднозначно, при этом эффект каждой медиаторной системы может быть рассмотрен как преобладающий [Gladkova, 2000]. Нейромедиаторы имеют качественно различные функции в течение онтогенеза нервной системы. Во взрослом организме медиаторы, осуществляют передачу сигналов между клетками, однако в развивающейся нервной системе те же медиаторы могут образовывать морфогенетические градиенты, важные для формирования и дифференцировки различных областей нервной системы и нейромедиаторных систем соответственно [Buznikov et ah, 1999]. Некоторые факторы, которые инициируют запуск каскадов нейроналыюго развития включают агонистов и антагонистов нейромедиаторов: у-аминомасляной кислоты, возбуждающих аминокислот, ЛХ и ацетилхолинэстеразы (АХЭ), моноаминов [Patel et al., 1981; Lauder, 1990; Cameron et al., 1998; Owen, Bird, 1995; Grifman et al., 1998; Bain et al., 1998; Gleason et al., 1998]. 1.3.1. Дофаминергическая система ДА играет важную роль в осуществлении моторной функции и обучении. Клетки, синтезирующие ДА в мозге, появляются сравнительно рано, у эмбриона человека примерно на 6-8 неделе внутриутробного развития [Sundstrom et al., 1993]. Причём у эмбрионов женского пола они появляются раньше, чем у мужского. Наиболее высокий уровень дофаминергических рецепторов в период пренатального развития был обнаружен у эмбрионов крыс в бледном шаре [Boyson, Adams, 1997]. Дофаминергические системы головного мозга организованы в компактные системы, выполняющие четко очерченные функции. Наиболее мощными дофаминергическими системами являются нигростриальная, регулирующая моторные функции организма, мезолимбическая и мезокорти-кальная, играющие заметную роль в формировании мотивационных механизмов влечений и гипоталамические системы, контролирующие эндокринные функции. Подавляющее большинство дофаминергических клеток расположено в среднем мозге, они также присутствуют в промежуточном мозге. Дофаминергические нейроны среднего мозга в компактной части черной субстанции (А9 дофаминергическая группа клеток) и вентральной области покрышки (А8 дофаминергическая группа клеток) обеспечивают существенные дофаминергические проекции к коре, хвостатому ядру, putamen, прилежащему ядру, миндалине и перегородке [Fallon, Loughlin, 1995]. Диэнцефальная группа, содержащих
ДА клеток расположена в пределах аркуатного ядра гипоталамуса и проецируется к гипофизу, где регулирует выброс из него различных гормонов. Повреждение различных дофаминергических проекций вызывает различные поведенческие синдромы в зависимости от поврежденной области нейронной системы. Повреждение дофаминергических проекций префронтальной коры приводит к познавательным дисфункциям, гипоактивность ДА в дофаминергических проекциях мезосептальных образований приводит к уменьшению в рабочей памяти [Simon et al., 1986]. Таким же образом, повреждение дофаминергических проекций мезоаккумбентных проекций вызывает дефицит внимания и изменения в двигательной активности [Koob et al., 1978, 1981; Carey et al., 1986]. Эти исследования дают понимание ключевой роли ДА в шизофрении, болезни Паркинсона, хореи Гентингтона и многих других патологических процессов. Роль ДА в половом поведении самцов. Более ранние исследования показали, что ДА в медиальной преопти-ческой области (МПО) очень важен для коитуса. Микроинъекции классического агониста ДА апоморфина в МПО увеличивали частоту и эффективность спаривания [Hull, 1986] и также увеличивали число эрекций без копуляции (ex copula] [Pehek, 1989]. Блокирование доступа ДА к его рецепторам замедляло частоту коитуса, числа эрекций ex copula, и уменьшало половую мотивацию [Warner, 1991]. Позже было демонстрировано, что ингибитор обратного поглощения ДА бупропион, введенный в МПО , уве личивал эндогенный уровень ДА и увеличивал рефлексивные и бесконтактные эрекции [Adachi, 2003]. Таким образом, эндогенный ДА в МРО способствует коитусу и увеличивает половые рефлексы и половую мотивацию. ДА, высвобождаемый в МРО до и в течение коитуса, активно вовлечен в облегчение рефлексивных, моторных и мотивационных аспектов ПП. Различные роли D\ и D? рецепторов дофамина. D] и D2 семейства рецепторов могут регулировать прогрессию копуля-торного поведения [Hull, 1995].
Небольшое увеличение ДА, действующего через D? рецепторы, по-видимому, растормаживает половые рефлексы. Низкая доза D3/D2 агониста квинелорана уменьшала латентиость к первой рефлексивной эрекции или эякуляции, но не снижала число эрекций и эякуляций [Bazzett, 1991]. Умеренная доза агониста Di рецепторов дигидро-фенил-тетрагидротиенопиридина или смешанного агониста D1/D2 рецепторов ДА апоморфина увеличила число парасимпатически опосредованных эрекций и способствовала коитусу, но агонист Di рецептора ДА уменьшал число симпатически опосредованных эякуляций в опытах по изучению полового рефлекса ex copula [Hull, 1992; Markowski, 1994]. Наконец, большая доза агониста Di/D2 рецепторов или апоморфина, вводимого с антагонистом Dj рецепторов ДА, сместила баланс автономного влияния с усилением эякуляции и ингибированием эрекции [Hull, 1989, 1992; Bazzett, 1991]. Поэтому повышение уровня ДА в МПО может сначала растормозить и затем способствовать эрекции, и, наконец, вызывать эякуляцию [Hull, 1992]. Не ясно, опосредован ли растормаживающий эффект низкой дозы агониста D{/D2 рецепторов различием в действии на подтипы семейства D2 рецепторов ДА, опосредующих эрекцию и эякуляцию [Hull, 1992, 2005,]. Возможно, один и тот же подтип рецептора может произвести два различных эффекта, запуская различные группы нейронов с различной эффективностью. Таким образом, ДА, высвобождаемый в нескольких главных инте
Стрессорные воздействия, применяемые к взрослым животным
В качестве иммобилизационного (эмоционального) стрессора для крыс использовали рестрикцию (ограничение подвижности животного) разной продолжительности (30 мин или 1 ч, 3 ч и б ч). Иммобилизацию осуществляли либо непосредственно перед тестом ПП при остром опыте, либо за 4 ч до тестирования при хроническом стрессировании. Иммобилизационный стресс вызывали при ярком освещении. Для исследования влияния стрессоров испытуемые группы животных (п=12) помещали в пластиковые отсеки с ограниченным объемом ( 60 стЗ), и подвижностью хвостовой части для придания индивидуального размера. Контролировали температурный режим комнаты, где проводили стрессирование, чтобы исключить перегрева организма испытуемых крыс. Влияние хронического эмоционального стресса на половую активацию самцов крыс изучали на модели повторного стрессирования в течение 7 дней. Работа выполнялась на самках крыс линии Вистар из питомника «Рап-полово». Все животные содержались на одинаковой диете, включавшей брикетированный корм, овощи и воду. Эксперимент состоял из нескольких серий опытов. Получение самок-крыс с известной датой беременности: самок в стадии проэструс — эструс подсаживали к активным половозрелым самцам на 4-6 часов. День обнаружения спермиев в вагинальных мазках считали первым днём беременности. На следующем этапе эксперимента оказывали пренатальное воздействие холинотропными препаратами на разных сроках развития крысиных зародышей. Пренатальное воздействие. Беременным самкам на 9-11, 12-14 и 17-19 сутках гестации производились трёхразовые внутримышечные инъекции (1 раз в день) Н-холиноблокатора ганглерона в дозе 10 мг/кг или М-холиноблокатора метамизил в дозе 2 мг/кг. Опытные группы формировались по срокам пренатального воздействия и по фармакологическим препаратам. Всего было формирована 7 групп: 1 контрольная и 3 опытные группы с ганглероном -ПО, Г13,Г18иЗ опытные группы с метамизилом -Ml0, М13 и Ml8. Беременные самки интактных крыс являлись группой контроля, которым вводили в эти же сроки стерильный апирогенный физиологический раствор (0.01 мл/г 0.9% NaCl внутрибрюшинно). Беременных крыс рассаживали в индивидуальные клетки. Часть беременных самок на 20 сутки гестации были декапитированы для извлечения 20-дневных плодов крыс.
Помёты родившихся крысят от остальных самок редуцировали до 6-8 детенышей, сохраняя максимальное количество самцов. Пометы из каждой группы смешивали и случайным образом делили на 3 группы. Одна часть потомств в 2-х месячном периоде (по 10 самцов из каждой группы) использовалась для нейрохимических и эндокринных исследований. Вторая часть потомств 3,5-4 месячном периоде (10-12 самцов из каждой группы) была использована для изучения половой функции и приобретения полового опыта. Третья часть потомств этого же возраста была использована для изучения стрессреактивности потомств самцов, подвергнутых пренатальному воздействию холинолитиков. Выделение материала при исследовании 20-дневных плодов крыс: Исследование содержания медиаторов и метаболитов у плодов крыс проводилось на 20-суточных зародышах крыс. Беременных самок на 20-ом дне беременности забивали путём дислокации шейных позвонков, вскрывали и вырезали матку с плодами. Плоды извлекали из матки и отделяли от зародышевых оболочек. Потомство разделяли по половому признаку и отрезали голову и сразу же замораживали в жидком азоте (хранение осуществля лось также в жидком азоте). Далее в криостате, при - 20 С, мозг отделялся от черепной коробки. Выделение материала при исследовании 3,5-4 месячных крыс: Крысы были декапитированы с гильотиной без предшествующей анестезии, головной мозг выделяли из черепной коробки и немедленно фиксировали жидким азотом. Далее в криостате при температуре -20С, используя координаты по атласу Konig (1967) выделяли структуры гипоталамуса, гиппо-кампа, амигдалы, хвостатого ядра и черной субстанции. Выделенные структуры от каждой крысы хранились в жидком азоте до хроматографиче-ского анализа. Концентрацию ДА, НА, СТ и их метаболитов в структурах мозга определяли методом ВЭЖХ на "Beckman System Gold" с электрохимическим детектором LC-4C. В исследованиях использовали структуры, участвующие в реализации поведенческих реакций - гиппокампа, "миндалины, и гипоталамус, которые были выделены при -20С и хранились в жидком азоте до хроматографического анализа. Аналитическая процедура. ЖХВД система состояла из насоса System Gold с контроллером CL-6A, инжектора Rheodyne 9125 с петлей 20 мкл и системы проводящих капилляров, выполненных из материала РЕЕК. Разделение пиков проходило в хроматографи-ческой колонке SphereClone 5ц. ODS 2 (250x4,60 mm) с предколонкой SecurityGuard (ODS 4mm L x 3,0mm ID) производства "Phenomenex", упакованной 5 MKM обращеннофазовым сорбентом ODS 2 (С-18).
Работа элек-трохимического детектора осуществлялось при 0,5-мкА с карбоновым электродом с диаметром рабочих, стеклоуглеродных пластин 3 мм в последовательном включении по отношению к потоку элюента. Потенциалы верхнего и нижнего по течению элюента электродов устанавливались соот ветственно +0,5 V и +0,02 V относительно референтного электрода Ag/AgCl. В качестве потенциостатов и усилителей тока использовали контроллеры LC-4C (BAS). Подвижная фаза состояла из 0,1 моль одноосновного фосфата натрия, 0,1 моль лимонной кислоты (оба Fisher Scientific, США), 80 мг EDTA (Aldrich, США), ацетонитрила (88 мл/л) и 50 мг октилсульфоната натрия (Sigma, США) на 1 литр рН подвижной фазы доводили до 4,0 при помощи 6М NaOH. Подвижную фазу фильтровали через нейлоновые фильтры 0,2 мкм и дегазировали вакуумом. Скорость прокачивания элюента составляла 0,75-1,0 мл/мин. Чувствительность электрохимического детектора путем использования тонких электродных прокладок (16 мкм, В AS) позволяла уменьшить фоновый ток второго по течению (измерительного) электрода, до значений 0,2-0,4 наноампер. Сквозная чувствительность системы была определена на уровне 0,2 пикограмма медиатора в 20 мкл образце (отношение сигнал/шум 2:1). Выделенные структуры мозга гомогенизировали в охлажденной 0,1 N хлорной кислоте, центрифугировали при 14000 g в течение 7 минут при 4С. . Каждая структура из мозга крыс хранилась в отдельной 0,2 mL пробирке и после взвешивания переносилась на 0,5 mL пробирку, где гомогне-низировали в течение 45-60 секунд на ледяной подложке с помощью микрогомогенизатора с наконечником из стальной проволоки. Далее, гомогенат центрифугировали в этой же пробирке в микроцентрифуге (Backman, германия). Слой супернатанта фильтровали через 0,20-мм Millipore фильтр. Часть супернатанта в объеме 20 мкл вводили в систему HPLC-ED. Аналитическое время пробега пробы в хроматографической колонке составляло 18 минут в изократическом режиме при скорости 1.0 мл/мин. Идентификацию и чистоту хроматографических пиков, а также их количественную оценку осуществляли по отношению к пикам, полученным от внешних стандартов. Стандарты для контроля определяемых медиаторов и их мета
Холинергическая модуляция активности основных медиаторных систем и гонадных гормонов у интактных и гипогонадных самцов
Как у интактных, так и у ГГЭ самцов отмечалось изменение уровня медиаторов с тем отличием, что у ГГЭ самцов изменения в содержании медиаторов были более выражены чем у интактных, если учесть, что доза препаратов была несколько раз ниже таковых у интактных крыс. У интактных крыс галантамин достоверно увеличивал содержание ДА, НА и 5-ГТ почти во всех исследуемых структурах, тогда как ингибирующий эффект метамизила был менее выражен, особенно в гипоталамусе. У ГГЭ самцов однократная инъекция галантамином или метамизилом достоверно изменяла содержание ДА и НА в исследуемых структурах. По отношению 5-ГТ, метамизил достоверно снижал уровень этого медиатора в структурах лимбической системы и гипоталамуса. Изменение концентрации 5-ГТ инъекцией галантамина было незначительным и недостоверным. Необходимо отметить, что у ГГЭ самцов эффекты холинотропных препаратов достигались значительно меньшими их дозами, что свидетельствовал о повышении чувствительности холинергических структур мозга к этим препаратам по причине снижения уровня андрогенов в крови после гонадэктомии. По этой же причине, у ГГЭ самцов более низкие дозы холинотропных препаратов вызывали полноценное восстановление сниженной половой функции после гонадэктомии, что значимо отличались от эффекта этих же препаратов на половую функцию у интактных крыс. Исследование гонадных гормонов у самцов показало, что уровень основного андрогена Тс под влиянием галантамина не меняется, тогда как метамизил в дозе 7 мг/кг у интактных крыс и в два раза меньшей дозе у ГГЭ самцов достоверно снижал уровень Тс (соответственно на 15,5% и 23,8%, р 0,05) (табл. 6). Также отмечено достоверное снижение ЛГ в крови после инъекции метамизила. Полученные данные согласуется более ранними исследованиями, проведенными Бехтеровой Э.П. (1967) и другими авторами в отделе нейрофармакологии ИЭМ, в которых было показана, метамизил ингибирует гонадотропную функцию гипофиза и снижает уро вень гипофизарных гормонов в ЛГ и ФСГ в периферической крови интакт-ных самцов [Рыженков В.Б., 1964; Поскаленко А.Н., 1960, 1965]. Вызванное метамизилом снижение уровня Тс в организме интактных крыс, вероятно, является одним из механизмов, посредством которого М-холинергическая система мозга регулирует половую активность самцов. Таким образом активация М-холинергических механизмов хоть и усиливает гормональный эффект Тс на половую активность, но не повышает его продукцию как у интактных, так и у ГГЭ самцов крыс.
Блокада холинергических механизмов М-холинолитиком, нарушающая половую функцию самцов связана как с действием этих препаратов на М-холинорецепторы, так и с нарушением эндокринного статуса самцов. Полученные нейрохимические данные об эффектах холинотропных препаратов на содержание моноаминов в структурах лимбической системы и гипоталамуса свидетельствуют, что усиление половой функции М-холиномиметиками, связано не только с прямой активацией М-холинергической системы, но и с усилением активности нейромедиаторных систем, большей степени дофаминергических механизмов в структурах мозга. Нейростероиды обладают способностью воздействовать на активность различных нейромедиаторных систем мозга, вовлеченные в процессы обучения и памяти, и участвующие в когнитивных функциях [Flood, 1988; Baulieu, 1996]. Введение дегидроэпиандростерона (ДГЭА) и его метаболитов животным и людям выявило значительное разнообразие биологических эффектов, включая улучшение памяти, уменьшение беспокойства, снижение депрессии и оптимизацию когнитивной функции, увеличение возбудимости нейронов [Frye, 1995; Baulieu, 1996; Reddy, 1997]. Механизмы различных биологических свойств ДГЭА до сих пор недостаточно изучены. В хроническом эксперименте нами исследовано доза зависимое влияние ДГЭА на половую функцию, на моноаминергическую активность в структурах лимбической системы и гипоталамуса в условиях дефицита половых гормонов у самцов крыс, а также на радиолигандное связывание ( Н)-тестостерона в преоптической области гипоталамуса. В хроническом эксперименте исследовали влияние ДГЭА на половую функцию ГГЭ самцов (табл. 7). Комбинированное применение галантамина с нейростероидом ДГЭА значительно модифицировало структуру ПП самцов. Инъекция только ДГЭА в течение 7 дней усиливала ПП гипогонадных самцов по сравнению с контролем. После 7-кратного введения ДГЭА и однократной инъекции галантамина перед тестированием половая функция
Эффект М- и Н-холинолитиков на пренатальное развитие моноаминергическое системы головного мозга у 20-дневных плодов крыс
Эмбриональный период онтогенеза играют исключительно важную роль в развитии головного мозга, которое определяются, прежде всего, ге нетическими факторами. Нормальное течение данного процесса может быть также нарушено под влиянием многих факторов внешней среды, которые оказывают воздействие, как на дифференцировку нейронов, так и на выбор нейромедиатора в них, используемых для коммуникации с ближайшими клетками [Le Douarin, 1981; Pendleton, 1998]. Большинство факторов, воздействующих на развивающийся мозг в этот период, нарушают нормальный онтогенез нейромедиаторных систем: НА, 5-ГТ, ДА и АХ, что показывает высокую чувствительность мозга в критические периоды своего развития [Williams, 1992; Oliff, 1999; Qiao, 2004]. Несмотря широкое изучение химических соединений с холинотроп-ными свойствами, оказывающими неблагоприятное воздействие на развивающийся мозг эмбриона, в литературе отсутствуют сведения о нейрохимических эффектах пренатального применения холинотропных препаратов избирательного М- и Н-типа действия. Поэтому, целью исследований в пределах этой темы явилось изучение воздействия известных селективных блокаторов М- и Н-холинергической системы на динамику развития нейромедиаторных систем мозга эмбрионов крыс, назначенных в различные сроки пренатального периода, проследить их динамику в подростковом периоде и во взрослом состоянии в сопоставлении с поведенческим статусом в тесте на ПП у самцов крыс. Исходя из сформулированных выше предпосылок, задачи настоящего раздела работы состояли в следующем: 1. Изучить эффекты пренатального воздействия селективных блокато ров М- и Н-холинергической системы на динамику развития нейромедиа торных систем мозга 20-дневных эмбрионов крыс, в различные сроки гес тации. 2. Исследовать нейрохимический статус структур головного мозга, участвующих в становлении и регуляции нейроэндокринной и поведенче ских функцией организма у 2-месячных потомств крыс, подвергнутых пренатальному воздействию М- и Н-холинолитиков. 3.
Исследовать половые нарушения у 3-4 месячных самцов потомств крыс и возможности их фармакологической коррекции. 4. Исследовать стрессреактивность потомств самцов, подвергнутых пренатальному воз действию М- и Н-холинолитиков в тесте 1111. 3.2.1. Эффекты М- и Н-холинолитиков на пренатальное развитие мо-ноаминергической системы головного мозга у 20-дневных плодов крыс. Анализ полученных нейрохимических данных медиаторного статуса мозга 20-дневных эмбрионов различного генетического пола показали, что пренатальное воздействие холинотропными препаратами центрального действия метамизилом и ганглероном в различные сроки гестации, вызывают дисбаланс содержания нейромедиаторов ДА, 5-ГТ, и их метаболитов в головном мозге опытных групп к 20-му дню пренатального развития по сравнению с контролем. Обмен ДА. У эмбрионов мужского пола с пренатальной экспозицией ганглерону отмечено достоверное снижение концентрации ДА при воздействии на 10 сутки пренатального развития (рис. 15). Уровень ДОФУК — метаболита ДА — в эти же сроки не изменялся (табл. 7). В группе Г-10 снижение содержания ДА сопровождалось увеличением его оборота (рис. 16). При воздействии ганглероном на 13-е сутки гестации отмечали значительное увеличение уровня ДА - на 29,9% (р 0,01), которое не сопровождалось изменением его оборота, что свидетельствует об увеличении интенсивности синтеза медиатора. У эмбрионов женского пола в группах с пренатальным воздействием ганглерона также отмечали достоверное снижение концентрации ДА в 10 сутки пренатального развития и его значительное увеличение - на 18,4% (р 0,01) в 13 сроки гестации. В то же время по содержанию ДОФУК у самок наблюдалось более значительное изменение. Отмечено также, что у эмбрионов женского пола, в отличие от эмбрионов-самцов, изменение уровня ДА сопровождалось более значительным снижением оборота ДА во всех экспериментальных группах. Наиболее значительное снижение отношения ДОФУК/ДА выявлено в ранние сроки гестации при воздействии ганглероном и поздние сроки гестации при воздействии метамизилом. Обмен 5-ГТ.
Изменение уровня 5-ГТ в эмбриональном мозге было более значительным по сравнению с ДА. Отмечали достоверно значимое снижение содержания 5-ГТ в головном мозге эмбрионов при воздействии как метамизила, так и ганглерона во всех периодах гестации по сравнению с группой контроля. У эмбрионов мужского пола отмечено достоверное снижение концентрации 5-ГТ в мозге эмбрионов во всех периодах пренатального воздействия метамизилом. В группах с ганлероном отмечено достоверное снижение концентрации 5-ГТ в мозге эмбрионов в 10- и 18-сутки пренатального развития. Динамика содержания ГИУК - метаболита 5-ГТ аналогична содержанию самого медиатора - отмечали достоверное снижение в группах МІОиМІЗ с метамизилом и ПО при воздействии ганглероном.
