Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 17
1.1 .Эндотелиальная дисфункция как предиктор ряда сердечно- сосудистых заболеваний 17
1.2. Принципы'фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции и основные группы эндотелиопротекторных препаратов - 38
1.3. Потенциальные эндотелиопротекторы 46
1.3.1. Эндотелиопротективные свойства L-аргинина 46
1.3.2. Эндотелиопротективные свойства резвератрола 49
1.3.3. Эндотелиопротективные свойства антиоксидантов 51
1.3.4. Эндотелиопротективные свойства метаболического корректора 3-(2,2,2-триметилгидрозиний) пропионата дигидрат (милдронат) - 55
1.3.5. Эндотелиопротективные свойства импазы 59
1.3.6. Эндотелиопротективные свойства фосфолипидов и глицирризиновой кислоты- 65
1.4. Сосудистый эндотелий и его роль в ангиогенезе 71
ГЛАВА 2. Материалы и методы 77
2.1. Моделирование L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота и оценка эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых сосудистых реакций 77
2.2. Исследование функционального состояния миокарда на наркотезированных крысах - 78
2.3. Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции 78
2.4. Морфологические методы оценки сердечно-сосудистых изменений при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции- 80
2.5. Моделирование хронической ишемии задней конечности 81
2.6. Оценка уровня микроциркуляции в мышцах голени крыс методом лазерной допплеровской флоуметрии- 83
2.7. Морфологическое исследование препаратов мышц конечности 85
2.8. Внутримышечное введение раствора плазмиды гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) - 86
2.9. Иммуногистохимическая визуализация кровеносных сосудов в срезах мышц голени крыс 87
2.10. Исследуемые химические соединения и дизайн эксперимента 88
2.11. Интегральный анализ функциональных, биохимических и морфологических показателей при оценке эндотелио- и кардиопротективной активности исследуемых препаратов 99
2.12. Статистическая обработка результатов исследования 101
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 103
3.1. Разработка комплекса методических подходов для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-иидуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований- 103
3.2. Исследование эндотелиопротективной активности L-аргинина SR при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований 131
3.3. Исследование эндотелиопротективной активности резвератрола при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований 144
3.4. Исследование эндотелиопротективной активности препаратов мексикор и аскорбиновая кислота при L-NAME- индуцированной 4 модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований 158
3.5. Исследование эндотелиопротективной активности препаратов фосфоглив (капсулы), фосфоглив форте (капсулы) и фосфоглив (лиофилизат) при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований 172
3.6. Исследование эндотелиопротективной активности препарата милдронат при L-NAME- индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований 196
3.7. Исследование эндотелиопротективной активности препарата импаза при L-NAME- индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований 209
3.8. Исследование влияния L-аргинина на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте 222
3.8.1. Результаты флоуметрического и морфологического исследо- вания ишемизированной конечности при коррекции L-аргинином в эксперименте 224
3.8.2. Результаты сравнительной оценки ангиогенного эффекта L-аргинина и сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) при экспериментальной ишемии конечности 239
Заключение 246
Выводы 285
Список литературы 289
- Принципы'фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции и основные группы эндотелиопротекторных препаратов
- Исследование функционального состояния миокарда на наркотезированных крысах
- Исследование эндотелиопротективной активности L-аргинина SR при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований
- Исследование эндотелиопротективной активности препаратов фосфоглив (капсулы), фосфоглив форте (капсулы) и фосфоглив (лиофилизат) при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований
Принципы'фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции и основные группы эндотелиопротекторных препаратов
Изучение ЭД, состояния сосудистой стенки артерий у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, включая АГ, и поиск возможностей лечения ЭД являются важными клиническими задачами. Усилия исследователей направлены на поиск препаратов, которые наряду с гипотензивным эффектом могли бы уменьшать выраженность ЭД и способствовать обратному ее развитию. Точками приложения терапии ЭД являются восстановление равновесия описанных выше факторов, ограничение действия одних эндотелиальных медиаторов и компенсация дефицита других. Нитраты восстанавливают дефицит NO; ингибиторы АПФ (иАПФ) блокируют синтез АТИ и препятствуют разрушению кининов; антагонисты кальция (АК) тормозят активность ATII и эндотелина в гладких мышцах сосудов, усиливая вазо-дилатирующий эффект NO; ингибиторы эндотелинпревращающего фермента и блокаторы эндотелиновых рецепторов тормозят действие этого пептида [95, 129]. Однако в настоящее время не существует препаратов для специфической коррекции ЭД. В связи с этим большой интерес представляют данные о влиянии разных лекарственных средств на функциональное состояние эндотелия. Ингибиторы АПФ (иАПФ) В опытах на животных и клинических исследованиях показано, что тканевые эффекты и АПФ восстанавливают функцию эндотелия, подавляют пролиферацию и миграцию, усиливают эндогенный фибринолиз, снижают афегацию тромбоцитов, обладают антиатерогенным действием и стабилизируют атеросклеротические бляшки у животных [8, 31, 48, 65]. Наиболее перспективны в этом отношении иАПФ, которые обладают большей афинностью к эндотелиальной ренин-ангиотензиновой системе (РААС) (периндоприл, рамиприл, хинаприл, трандолаприл и др.). В эксперименте на крысах со спонтанной АГ каптопрол и цилаза-прил способствовали восстановлению эндотелиальной функции, повышая продукцию релаксирующих факторов, в частности NO; при этом уровень простагландина F2a оставался неизменным [257]. При изучении способности эналаприла и кандесартана восстанавливать функцию эндотелия артерий брыжейки крыс со спонтанной АГ была выявлена их одинаковая эффективность в отношении ЭД, что в последующем было доказано и в других экспериментах, в частности с каптоприлом и лозартаном [40, 208, 255].
Одна из возможностей воздействия на ЭД связана с восстановлением метаболизма брадикинина, нарушенного при сердечно-сосудистых заболеваниях. Была экспериментально доказана способностьрамиприла предотвращать ЭД, опосредованную действием недоокисленных липопротеидов низкой плотности. Положительный эффект связывают с накоплением в эндотелии брадикинина, что, в свою очередь, ведет к повышению продукции N0 [447]. Эти данные позволили предположить, что результаты долговременных клинических испытаний также будут благоприятными. Однако в контролируемом 6-месячном испытании TREND (Trial on Reversing Endotelial Dysfunction) не было отмечено влияния иАПФ на функцию эндотелия у больных АГ. Но в этом же исследовании выявили способность иАПФ корректировать ЭД у пациентов с ИБС без АГ [15, 47, 58, 158]. Испытание QUIET (Quinapril Ischemic Event Trial), длившееся 3 года, не подтвердило существенного улучшения клинических и ангиографических исходов под влиянием терапии иАПФ у больных ИБС [527]. На моделях гипертензии у животных и при эссенциальной гипертонии у человека доказано, что иАПФ улучшают ацетилхолинопосредован-ную и брадикининобусловленную дилатацию артерий различной локализации и что данная группа препаратов способна улучшать эндотелиальную функцию [9, 14, 62, 83, 84, 85, 56, 136].
В одном из контролируемых исследований продемонстрировано, что лизиноприл способствует реверсии ЭД у больных АГ, в другом - отмечено близкое по выраженности ослабление ЭД при использовании эналаприла и лозартана [35, 88, 114, 119, 128, 131]. В остальных случаях клинические результаты гораздо менее благоприятны, чем экспериментальные [86, 47, 475, 505]. Блокаторы рецепторов ангиотензина II Благоприятное действие на ЭД блокаторов рецепторов ангиотензина II у больных АГ реализуется, по-видимому, за счет блокады АТ1-рецепторов, что приводит к снижению продукции супероксидных радикалов, уменьшению связывания NO и его накоплению. Так как стимуляция ATI- рецепторов способствует образованию супероксидов, инактивирую-щих NO, а стимуляция АТП-рецепторов приводит к вазодилатации и на-трийурезу за счет активации системы брадикинина, NO, цГМФ, то направленность эффекта ангиотензина II зависит то того, на какие рецепторы преимущественно он действует. Поэтому очевидно, что на фоне блокады ATI-рецепторов создаются условия для повышенного функционирования незаблокированных АТП-рецепторов, что приводит к накоплению NO [12, 11,49,51, 101,115,223,367,155]. Клинические исследования у больных с эссенциальной АГ показали, что на фоне терапии лозартаном улучшается эндотелиальная функция ре-зистивных артерий за счет увеличения синтеза NO [57, 90, 100, 102, 216]. Статины Исследования эффектов правастатина, ловастатина, аторвастина и симвастатина показали, что одним из наиболее ярких «нелипидных» эф
Исследование функционального состояния миокарда на наркотезированных крысах
Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика P23ID «Gould», США, АЦП L-154 и компьютерной программы «Bioshell» регистрировали показатели кардиогемоди-намики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dtmax), максимальную скорость расслабления (-dp/dtmax), частоту сердечных сокращений (ЧСС) и интенсивность функционирования структур (ИФС) (произведение частоты сердечных сокращений и давления, развиваемого левым желудочком (мм рт. ст. х уд. мин) [94]. Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности: 1. Нагрузка объёмом (внутривенное одномоментное введение 0,9 % раствора NaCl, из расчёта 0,4 мл на 100 г) [116, 45]. 2. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида Г10"5моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г) [116, 45]. 3. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек [116, 45]. 4. 3-х минутную гипоксию [94, 98, 97]. Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO,-позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов [80].
Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски, интенсивность кото спектрофотометрически при длине волны 540нм. Анализ 100 мкл депротеинизированной сыворотки- проводили в 96 луночных планшетах с плоским: дном.-Чувствительность метода, на приборе Labsysems Multiskan МСС/340 составляет 1,7 мкМ. Для колориметрического определения , нитрит-иона использовали реактив Грисса, состоящий из равных частей раствора I (0;05% раствор N-нафтилэтилендиамина в, воде) и раствора II (1% раствор сульфаниламида- в 30% уксусной кислоте) [80], Оба раствора хранятся в темноте при температуре 4С в течение нескольких месяцев:- Для приготовления раствора хлористого ванадия 400 мг VG13 растворяли в 50 мшШНЄІ с последующим фильтрованием через бумажный фильтр. Всегда использовалихвежеприготовленныйраствор. Уровень метаболитов NO (то; есть, суммарную концентрацию нитратов и нитритов; NOx) определяли- колориметрическим методом ПО развитию окраски в реакциигдиазотированияі нитритом: сульфаниламида, входящего в состав:реактива1 FpHccaJ Для построения калибровочной; кривой использовали lM;pacTBop;NaN2.B воде, который хранили при температуре:-20Є; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию . разведении для построения кривой. Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида- азота (е-NOS)1 определяли в клеточном лизате по методу R.J. Hendrickson [127] с небольшими модификациями. Уровень экспрессии eNOS в аорте крыс измеряли с помощью поликлональных мышиных антител против eNOS (BD» Transduction Labs) с последующим проявлением методом; усиленной хеми-люминесценции ECL.
После выведения животного из эксперимента отрезок крысиной аорты (20-30 мг промывали в 0,9% р-ре NaCl и хранили в жидком ;азоте. В ходе эксперимента отрезок аорты взвешивали, измельчали в1 ступке при добавлении; жидкого азота, w экстрагировали белки добавлением- 10-кратного; объема денатурирующего буфера 6,25 мМ? Трис рН 6;8, 2% ДСН; 5% меркаптоэтанол, .10% глицерин, 0,005% бромфеноловый си ний с последующим кипячением в течении 3-х минут. Подготовленные образцы подвергали электрофорезу в полиакрил амид ном геле с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану методом Western-блоттинга. Мембрану инкубировали с мышиными поликлональными антителами против eNOS, затем обрабатывали по методу ECL и экспонировали с рентгеновской пленкой в течение суток. Затем пленку проявляли и сканировали полосы, рассчитывая их интенсивность с помощью компьютер-. ной программы TotalLab (Amersham). В качестве контроля использовали стандартно приготовленные образцы из 1 млн. культивируемых эндотели-альных клеток бычьей аорты (ВАЕС), интенсивность полос которых принимали за 100% (рис. 2.1). e JOS, 140 kDa . Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов проводили гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента), почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий). Материал фиксировали в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Использовали окраски гематоксилином Рего и эозином для выявления ранних повреждений миокардиоцитов, по Ван Гизон, ставилась ШИК-реакция. При морфометрии сердца использован метод раздельного взве шивания миокарда с определением индексов, определение диаметра кар-диомиоцитов по методике Г.Г. Автандилова [1]. Определяли абсолютную и относительную массу надпочечников, в почках оценивали диаметр почечных телец и их клубочков.
Определяли соотношение интима/медиа в участках сонной артерии и брюшной аорты. Моделирование хронической ишемии задней конечности осуществляли под наркозом этаминалом натрия в дозе 35 мг/кг после соответствующей подготовки кожи (сбривание шерсти и обработка 70% спиртом). Затем производили разрез по внутренней поверхности области бедра на всю1 длину области. Рассекали собственную фасцию. Выделяли элементы основного сосудисто-нервного пучка бедра. Бедренную артерию отделяли от вены и нерва, мобилизовали (пересекали и перевязывали отходящие от нее ветви первого-порядка). Затем накладывали лигатуры на артерию в месте ее начала (под паховой связкой) и пересекали. Перевязывали и пересекали a. saphena, которая является аналогом глубокой бедренной артерии человека. Выделяли подколенную артерию и начальные отделы артерий голени (бифуркация подколенной артерии), которые пересекали. Участок магистрального сосуда, включающий бедренную, подколенную артерию и начальные отделы артерий голени удаляли. Значимого ретроградного кровотечения из артерий голени при операции не наблюдалось, поэтому лигатуры на культи артерий голени не накладывались. Рану на бедре послойно ушивали непрерывным швом. Описанные этапы операции моделирования ишемии конечности изображены на рис. 2.2-2.5. В литературе описаны способы моделирования хронической ишемии, которые включают в себя перевязку бедренной артерии у места отхождения, у места деления, а также перевязку всех ее ветвей на бедре [2]. Нами в дополнение к указанному способу предпринято уда ление участка магистрального сосуда конечности для предотвращения образования прямых анастомозов по «vasa vasorum». Данная модификация модели приводит к развитию ишемии более тяжелой степени. Методика моделирования описана в работах S. Takeshita et al. (1998) [488].
Исследование эндотелиопротективной активности L-аргинина SR при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований
Согласно дизайну исследования, в контрольной группе животных эндотелиальную дисфункцию моделировали ежедневным в течение 7 суток внутрибрюшинным введением L-NAME. Исследуемый препарат L-аргинин SR 30 мг/кг (медленно высвобождающаяся форма «L-аргинин SR», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства») вводили внутрижелудочно однократно через 30 мин после введения L-NAME в течение 7 суток. По протоколу на восьмые сутки наркотизированное животное брали в эксперимент. Влияние L-аргинина SR на исходные показатели артериального давления у наркотизированных крыс с моделированием L-NAME-индуцированной патологии представлены нарис. 3.18. Обнаружено, что изучаемый препарат в дозе 30 мг/кг не предотвращал развития выраженной гипертензии и значения САД и ДАД были достоверно выше значений интактных животных во всех сериях экспериментов (рис. 3.18). Коэффициент эндотелиальной дисфункции. В табл. 3.7 представлены результаты функциональных проб на эндотелийзависимое (ацетилхолин 40 мкг/кг в/в) и эндотелийнезависимое (нитропруссид 30 мкг/кг в/в) расслабление сосудов у животных с L-NAME индуцированной патологией на фоне лечения L-аргинином SR 30 мг/кг, с последующим расчетом КЭД (рис. 3.19). Обнаружено, что L-аргинин SR 30 мг/кг снижал КЭД до 2,6±0,2, тогда как в группе животных, получавших L-NAME, он составлял 5,4±0,6. Обращает на себя внимание, что L-аргинин SR в использованных дозах снижал КЭД на фоне L-NAME- индуцированной патологии, не приводя цифры давления к заданному уровню. Это, с одной стороны, свидетельствует о том, что КЭД имеет самостоятельное значение, а с другой - то, что L-NAME-индуцированная артериальная гипертензия на 7-сутки вовлекает в патогенетический процесс не только нитроергическую систему, но и все элементы гуморального и нейрогенного контуров регуляции- системы кровообращения.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об эффективном снижении КЭД под влиянием L-аргинина SR у животных с моделированием L-NAME индуцированной артериальной гипертензии при отсутствии снижения заданных цифр артериального давления. При переводе животных на управляемое дыхание обнаружено, что исходные показатели сократимости левого желудочка у животных, получавших L-NAME на фоне L-аргинина SR 30 мг/кг, достоверно оказались меньше, чем в; контрольной группе. Выраженное гиподинамическое действие оказывал L-аргинина SR в дозе 30 мг/кг, значения ЛЖД которого были достоверно ниже группы животных, получавших L-NAME (табл. 3.8). При этом позволим предположить, что повышение ЛЖД, +dp/dt, -dp/dt в условиях L-NAME-индуцированной патологии вызвано, как повышением постнагрузки на левый желудочек, связанное с повышением общего периферического сопротивления, так и включением ангиотензинзависимыми механизмами гипертрофии миокардиоцитов. Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных с L-NAME-индуцированным дефицитом оксида азота проводились нагрузочные пробы (табл. 3.9, рис. 3.20, 3.21). Проба на адренореактивность характеризовалась выраженным приростом абсолютных значений ЛЖД, +dp/dt, -dp/dt, ИФС. В контрольной L-аргинин SR дозозависимо предотвращал повышение адренореактивности, вызванное L-NAME-индуцированной патологией, и в дозе 30 мг/кг адренореактивность не отличалась от таковой у интактных животных (табл. 3.9, рис. 3.20). При проведении пробы на нагрузку сопротивлением L- аргинин SR предотвращал падение сократимости с 5 на 25 секунду пережатия аорты (рис. 3.21). Так, ЛЖД на 25 секунде проведения пробы у интактных животных составило 83,6% от величины на 5 секунде (что принято за 100%). В контрольной группе (L-NAME - индуцированный дефицит NO) -данный показатель соответствовал 66,0%. Тогда как результат у животных, получавших L-аргинин SR в дозе 30 мг/кг обладал наилучшей эффективностью и предотвращал исчерпание миокардиального резерва, сохраняя значение ЛЖД на уровне 88,3 %. Учитывая, что проба на нагрузку сопротивлением направлена на выявление скрытой сердечной недостаточности, анализ полученных результатов будет проведен в сопоставлении с данными морфологических исследований. Результаты гипоксической пробы (табл. 3.9) у интактных животных характеризовались увеличением сократимости в первые минуты реоксигенации после пробы с 3-х минутной гипоксией. Как видно из представленных данных, L-аргинин SR в дозе 30 мг/кг вызывал максимальное увеличение ЛЖД (259,4±9,2 мм рт. ст.), скоростных показателей (+dp/dt 10138±650 мм рт.ст./с, -dp/dt -5401 ±670 мм рт.ст./с) и ИФС (63105+3914 мм рт.ст. уд/мин ) по сравнению с контрольной группой животных.
Таким образом, результаты исследования функционального состояния миокарда при проведении нагрузочных проб выявили отчетливое кардиопротективное действие L-аргинина SR 30 мг/кг, выражающееся в предотвращении увеличения адренореактивности, падения ЛЖД при проведении пробы на нагрузку сопротивлением и увеличении сократимости на пике реоксигенации по сравнению с животными у которых моделировали L-NAME-индуцированный дефицит NO. NO-продуцирующая функция эндотелия исследована на основании данных о содержания нитрит-ионов NOx (рис. 3.22). Обнаружено, что концентрация нитрит-ионов (NOx) под влиянием L-аргинина SR 30 мг/кг увеличивалась и статистически достоверно не отличалась от показателей интактных животных. L-аргинин SR 30 мг/кг оказьюал существенное влияния на содержание нитрит-ионов в плазме Примечание: -р 0,05-в сравнении с L-NAME, - р 0,05 - в сравнении с интактными Таким образом, на модели L-NAME-индуцированного дефицита азота L-аргинин SR 30 мг/кг полностью предотвращал падение содержания концентрации нитрит-ионов NOx и повышал NO-продуцирующую функцию эндотелия. При морфологическом исследовании сердца и почек также обнаружен протективный эффект L-аргинина SR (рис. 3.23). В сердце контрольной группы (L-NAME-индуцированный дефицит NO) обнаружена гипертрофия кардиомиоцитов левого желудочка до 18,5±0,9 (в норме 9Д±0,1 мкм), сосудистые изменения в виде спастического состояния артериол, утолщения их стенок. При окраске гематоксилином Рего выявлялись очаговые сегментарные или тотальные повреждения кардиомиоцитов контрактурного типа. L-аргинин SR 30 мг/кг почти полностью предотвращал увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов (рис. 3.23). Одновременно более благоприятная картина морфологических изменений под влиянием лечения обнаруживалась в почках, сосудах и головном мозге. В головном мозге отмечены очаговые нарушения в виде полнокровия сосудов оболочек, спастических изменений мелких артерий, проявлявшиеся гофрированностью интимы, сужением просвета, очагов периваскулярного отека. Комплекс изменений в сердце, головном мозге и почках позволяет оценить их как соответствующие периоду стойкого повышения артериального давления с развитием поражения сосудов. Таким образом, L-аргинин SR в дозе 30 мг/кг предотвращал развитие гипертрофии миокарда на фоне L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота, что выражалось в уменьшении поперечного сечения кардиомиоцитов по сравнению с группой животных не получавших лечения. Интегральный анализ. Для оценки эндотелио- и кардиопротективной активности L-аргинина SR 30 мг/кг нами
Исследование эндотелиопротективной активности препаратов фосфоглив (капсулы), фосфоглив форте (капсулы) и фосфоглив (лиофилизат) при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований
Согласно дизайну исследования, в контрольной группе животных эндотелиальную дисфункцию моделировали ежедневным в течение 7 суток внутрибрюшинным введением L-NAME. Объектом настоящего исследования являлись препарат фосфоглив форте (капсулы) производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (г.Курск), препараты фосфоглив (капсулы) и фосфоглив лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения производства НИИ «Биомедхимии им. В.Н. Ореховича РАМН» (г.Москва). Состав препарата фосфоглив форте в пересчете на одну капсулу, г: Состав препарата фосфоглив лиофилизат для приготовления раство ра для внутривенного введения:в пересчете;на один флакон, г: Исследуемые препараты фосфоглив (капсулы) в дозе 2,2 г/кг, фос . фоглив форте (капсулы) в дозе 0,515 г/кг и входящие в их состав субстан ции глицират в дозе 0,2 г/кг, липоид С80 в дозе 0,3 г/кг вводили; внутри желудочно, а фосфоглив (лиофилизат) в дозе 5,0 и 0,5 мл/кг вводили внут рибрюшинно однократно через,30 мин после введения L-NAME в течение: По протоколу на восьмые сутки наркотизированное животное брали в эксперимент. Влияние препаратов фосфоглив (капсулы) в дозе 2,2 г/кг, фосфоглив форте (капсулы) в дозе; 0-515 т/кг,, фосфоглив (лиофилизат) в дозе 5,0-и 0 5 мл/кг и входящих в их состав субстанций глицират в дозе 0,2т/кг и липоид С80 в дозе 0,3 г/кгнаі исходные показатели артериального давления у наркотизированных крыс/с моделированием L-NAME-индуцированной патологии представлены на»рис. 3.39. Обнаружено, что изучаемые препараты не предотвращали развития выраженной гипертензииіи значения САД и ДАД были достоверно выше значений интактных животных во всех сериях экспериментов (рис. 3.39). Коэффициент эндотелиальной дисфункции. В табл. 3.16 и рис. 3.40 представлены результаты функциональных проб на эндотелийзави-симое (ацетилхолин 40 мкг/кг в/в) и эндотелийнезависимое (нитропрус-сид 30 мкг/кг в/в) расслабление сосудов у животных с L-NAME индуцированной патологией на фоне лечения препаратами фосфоглив (капсулы) в дозе 2,2 г/кг, фосфоглив форте (капсулы) в дозе 0,515 г/кг, фосфогливС (лиофилизат) в дозе 5 j0 и 0;5 мл/кг, а также входящих в их состав суб станций глицират в дозе 0,2 г/кг и липоид С80 в дозе 0,3 г/кг, с последующим расчетом КЭД. Обнаружено, что все исследуемые препараты, а также входящие в их состав субстанции глицират и липоид С80 достоверно снижали КЭД по сравнению с группой животных, получавших L-NAME.
Обращает на себя внимание, что в использованных дозах фосфоглив (капсулы), фосфоглив форте (капсулы), фосфоглив (лиофилизат), глицират и липоид С80 снижали КЭД на фоне L-NAME- индуцированной патологии, не приводя цифры давления к заданному уровню. Это, с одной стороны, свидетельствует о том, что КЭД имеет самостоятельное значение, а с другой - то, что L-NAME-индуцированная артериальная гипер тензия на 7-сутки вовлекает в патогенетический процесс не только нитро-ергическую систему, но и все элементы гуморального и нейрогенного контуров регуляции системы кровообращения. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об эффективном снижении КЭД под влиянием исследуемых препаратов и входящих в их состав субстанций у животных с моделированием L-NAME индуцированной артериальной ги-пертензии при отсутствии снижения заданных цифр артериального давления. При переводе животных на управляемое дыхание обнаружено, что исходные показатели сократимости левого желудочка у животных, получавших L-NAME на фоне лечения препаратами фосфоглив (капсулы) в дозе 2,2 г/кг, фосфоглив форте (капсулы) в дозе 0,515 г/кг, фосфоглив (лиофилизат) в дозе 5,0 мл/кг, а также входящих в их состав субстанций глицират в дозе 0,2 г/кг и липоид С80 в дозе 0,3 г/кг, достоверно оказались меньше, чем в контрольной группе. Выраженное гиподинамическое действие оказывали фосфоглив (капсулы) в дозе 2,2 г/кг, фосфоглив форте (капсулы) в дозе 0,515 г/кг, фосфоглив (лиофилизат) в дозе 5,0 мл/кг, а также входящие в их состав субстанции глицират в дозе 0,2 г/кг и липоид С80 в дозе 0,3 г/кг, значения ЛЖД которых были достоверно ниже группы животных, получавших L-NAME (табл. 3.17). Исключение составили крысы, получавшие фосфоглив (лиофилизат) в дозе в десять раз меньшей, по сравнению с соответствующей серией экспериментальных животных, при этом значения ЛЖД было выше по сравнению с животными, получавшими другие исследуемые препараты, и животными контрольной группы. Можно предположить, что повышение ЛЖД, +dp/dt, -dp/dt в условиях L-NAME-индуцированной патологии вызвано, как повышением постнагрузки на левый желудочек, связанное с повышением общего периферического сопротивления, так и включением ангиотензинзависимыми механизмами гипертрофии миокардиоцитов, а введение препарата фосфоглив (лиофилизат) в дозе 0,5 мл/кг не обеспечивало снижения исходных показателей сократимости левого желудочка и не способствовало проявлению гиподинамического эффекта препарата в указанной дозе. Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных с L-NAME-индуцированньш дефицитом оксида азота проводились нагру t зочные пробы (табл.3.18, 3.19, 3.20, рис.3.41, 3.42). Проба на адренореактивность характеризовалась выраженным при t ростом абсолютных значений ЛЖД, +dp/dt, -dp/dt, ИФС. В контрольной 179 группе (животные, получавшие L-NAME) ЛЖД, +dp/dt, -dp/dt, ИФС составили, соответственно, 247,3±4,8, 12109±263 и -6820±303 и 91767±2800. Фосфоглив (капсулы) в дозе 2,2 г/кг, фосфоглив форте (капсулы) в дозе 0,515 г/кг и фосфоглив (лиофилизат) в дозе 5,0 мл/кг предотвращали повышение адренореактивности, вызванное L-NAME-индуцированнои патологией, а в дозах 2,2 г/кг и 0,515 г/кг адренореактивность на фоне фос-фоглива (капсулы) и фосфоглива форте (капсулы) не отличалась от таковой у интактных животных (табл. 3.18, рис. 3.41). Обращает на себя внимание значительное повышение адренореак-тивности у животных, получавших глицират 266,9+4,5 мм рт. ст., на фоне применения только фосфолипида С80 существенных сдвигов ЛЖД по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения не отмечалось -245,0±7,9 и 247,3+4,8 мм рт. ст. соответственно. Однако при применении глицирата и фосфолипида С80 совместно в составе препаратов фосфоглив и фосфоглив форте, наблюдалось снижение адренореактивности - максимальное ЛЖД в ходе проведения нагрузочной пробы составляло 214,5 + 13,5 и 220,9+13,7 мм рт.ст.
В данном случае наиболее вероятным представляется различная направленность фармакологических эффектов глицирата, обладающего как иммуномодулирующим, противовоспали тельным, антиоксидантным свойствами,, так и псевдокортикостеройдным эффектом при повреждении клеточных мембран, вызванных комплексом патологических изменений под действием L-NAME и предупреждением данных повреждений под влиянием: фосфолипидов. И: хотя достоверных различий между гемодинамическими показателями под действием фос фоглива и фосфогливав форте; не обнаружено! можно предположить что соотношение в лекарственной: форме глицирата и фосфолипидов также представляется весьма значимым:. . Для исследования; кардиопротективных свойств препаратов нами была использована нагрузка сопротивлением (пережатие дуги восходящей аорты» в:течение:30-тшсекунд); Экспериментальное моделирование дефицита оксида азота привело к достоверному: снижению приростов ЛЖД; в\% отисхода, как на:5-й, так ина 25-й секунде: пережатия аорты (рис.3.45). На фоне введения исследуемых препаратов фосфоглив; (капсулы), в дозе 2 2: г/кг, фосфоглив.форте (капсулы) в; дозе 0 515 г/кг, фосфоглив;(лиофилизат) в; дозе 5,0 мл/кг и липоида: С80 в дозе 0;3 г/кг, имело место- выраженное кардиопротективное действие, которое проявлялось в значительном увеличении; приростов ЛЖД в % от исхода: на 5-й и 25-й секунде по сравнению группой животных,, получавшей L-NAlVffi При проведении пробы на нагрузку сопротивлением в качестве критерия эффективности использовалась способность миокарда поддерживать максимально высокое ЛЖД на всем протяжении пробы. На 5-й секунде пробы измерялся прирост ЛЖД и принимался за 100% (миокардиальный резерв сократимости), затем прирост ЛЖД относительно исходного давления измерялся на 25-йсекунде и выражался в процентах от величины миокардиально-го ходе проведения- пробы было очевидно, что введение Ь-NAME вызывало серьезные нарушения в, способности миокарда переносить максимальные нагрузки, в течение-длительного- периода времени. Применение препаратов; фосфоглив (капсулы) В дозе 2,2 г/кг,,фосфоглив.форте (капсулы) в дозе;0,515
