Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 17
1.1 .Эндотелиальная дисфункция как предиктор ряда сердечно-сосудистых заболеваний 17
1.2. Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции и основные группы эндотелиопротекторных препаратов 37
1.3. Потенциальные эндотелиопротекторы 46
1.3.1. Эндотелиопротективные свойства L-аргинина 46
1.3.2. Эндотелиопротективные свойства резвератрола 49
1.3.3. Эндотелиопротективные свойства антиоксидантов 51
1.3.4. Эндотелиопротективные свойства метаболического корректора 3-(2,2,2-триметилгидрозиний) пропионата дигидрат (милдронат) 55
1.3.5. Эндотелиопротективные свойства импазы 59
1.3.6. Эндотелиопротективные свойства фосфолипидов и глицирризиновой кислоты 65
1.4. Сосудистый эндотелий и его роль в ангиогенезе 71
ГЛАВА 2. Материалы и методы 77
2.1. Моделирование L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота и оценка эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых сосудистых реакций 77
2.2. Исследование функционального состояния миокарда на нарко-тизированных крысах 78
2.3. Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции 78
2.4. Морфологические методы оценки сердечно-сосудистых изменений при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции 80
2.5. Моделирование хронической ишемии задней конечности 81
2.6. Оценка уровня микроциркуляции в мышцах голени крыс методом лазерной допплеровской флоуметрии 83
2.7. Морфологическое исследование препаратов мышц конечности 85
2.8. Внутримышечное введение раствора плазмиды гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) 86
2.9. Иммуногистохимическая визуализация кровеносных сосудов в срезах мышц голени крыс 87
2.10. Исследуемые химические соединения и дизайн эксперимента 88
2.11. Интегральный анализ функциональных, биохимических и морфологических показателей при оценке эндотелио- и кардиопротективной активности исследуемых препаратов
2.12. Статистическая обработка результатов исследования 101
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 103
3.1. Разработка комплекса методических подходов для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований 103
3.2. Исследование эндотелиопротективной активности L-аргинина SR при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований 131
3.3. Исследование эндотелиопротективной активности резвератрола при L-NAME- индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований 144
3.4. Исследование эндотелиопротективной активности препаратов мексикор и аскорбиновая кислота при L-NAME- индуцированной 4 модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований
3.5. Исследование эндотелиопротективной активности препаратов фосфоглив (капсулы), фосфоглив форте (капсулы) и фосфоглив (лиофилизат) при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований 172
3.6. Исследование эндотелиопротективной активности препарата милдронат при L-NAME- индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований 196
3.7. Исследование эндотелиопротективной активности препарата импаза при L-NAME- индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований 209
3.8. Исследование влияния L-аргинина на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте 222
3.8.1. Результаты флоуметрического и морфологического исследования ишемизированной конечности при коррекции L-аргинином в эксперименте 224
3.8.2. Результаты сравнительной оценки ангиогенного эффекта L-аргинина и сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) при экспериментальной ишемии конечности 239
ГЛАВА 4. Заключение 246
Выводы 285
Список литературы 289
- Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции и основные группы эндотелиопротекторных препаратов
- Оценка уровня микроциркуляции в мышцах голени крыс методом лазерной допплеровской флоуметрии
- Исследование эндотелиопротективной активности L-аргинина SR при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований
- Исследование эндотелиопротективной активности препарата импаза при L-NAME- индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований
Введение к работе
Актуальность исследования. Доказательства ведущей роли дисфункции эндотелия в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе артериальной гипертензии, в настоящее время весьма убедительны и представляют значительный теоретический и практический интерес (Белоусов Ю.Б., Намсараев Ж.Н., 2004; Романовская Г.А., Акатова Е.В., Гороховская Г.Н., 2005; Остроумова О.Д., Дубинская Р.Э., 2005). При длительном воздействии повреждающих факторов (атеросклеротическое повреждение эндотелия, гипоксия, воспаление, гемодинамическая перегрузка) происходит изменение эндотелиалыюго ответа с тенденцией к доминированию и хронической гиперактивации вазоконстрикции и гемокоагуляции, факторов роста и пролиферации, способствующих ремоделированию сосудистой стенки, что, в свою очередь, приводит к усугублению эндотелиальной дисфункции (Петрищев Н.Н., 2003; Ольбинская Л.И., Найманн Ю.И., 2005). Изучение состояния сосудистой стенки и поиск возможностей целенаправленного лечения эндотелиальной дисфункции являются важными клинико-экспериментальньши задачами. В настоящее время стали известны научные факты, позволяющие по-новому взглянуть на парадигму профилактики сердечно-сосудистого континуума и существенного улучшения, таким образом, качества и продолжительности жизни пациентов при целом ряде массовых пандемий. Так, основным механизмом, лежащим в основе эндотелиальной дисфункции, является снижение образования и биодоступности NO при одновременном повышении продукции мощных вазоконстрикторов (Марков Х.М., 2005). При этом основными причинами дефицита NO в эндотелиальных клетках могут быть: сниженное содержание предшественника NO - L-аргинина, снижение экспрессии или активности eNOS, недостаток кофакторов синтеза NO (особенно тетрагидробиоптерина), повышение уровня эндогенных ингибиторов eNOS асимметричного диметиларгинина (АДМА) и монометил-Ь-аргинина (NMMA), повышенное образование реактивных форм кислорода (в частности, супероксид-аниона), а также липопротеидов низкой плотности (особенно их окисленных форм) (Cai С, Harrison D.G., 2000; Werner E.R., Gorren A.C.F., Heller R., 2003; Feletou M., Vanhoutte P.M., 2006).
Оксид азота синтезируется из L-аргинина под влиянием эндотелиальной
NO-синтазы (eNOS) и является одним из наиболее мощных вазодилататоров,
кроме того, он опосредует сосудорасширяющие эффекты эндотелийзависимых
вазодилататоров (ацетилхолина, брадикинина, гистамина и др.), тормозит
образование эндотелиалыюго сосудосуживающего фактора эндотелина-1 и
высвобождение норадреналина окончаниями симпатических нейронов,
препятствует осуществлению чрезмерных эффектов других вазоконстрикторов
(ангиотензина, тромбоксана А2), обладает противовоспалительным и
антитромбогенным эффектами, оказывает антиоксидантное действие
(Марков Х.М., 2005; Esper R.J., Nordaby R.A., Vilarino J.O., 2006). Широкий спектр биорегуляторных эффектов сосудистого NO указывает на то, что снижение его уровня в эндотелиальных клетках под влиянием тех или иных
факторов вызывает существенные изменения их функций и системы кровообращения в целом,
Молекулярные основы функционирования и дисфункции сосудистого эндотелия - сложная и не до конца изученная проблема. Многочисленные исследования, проведенные в последние годы, свидетельствуют о ведущей роли в этих процессах системы Ь-аргинин-КО-ЫО-синтаза. Значение указанной системы определяется, с одной стороны, многогранным участием N0 в осуществлении эндотелием своих функций, с другой - возможностью коррекции возникающих нарушений путем воздействия на различные звенья этой системы (Зодионченко B.C., Адашева Т.В., Сандомирская А.П., 2002; Бабак О.Я., Шапошникова Ю.Н., Немцова В.Д., 2004; Юшук Е.Н., Васюк Ю.А., Хадзегова А.Б., 2005; Чернявская Т.К., 2005; Марков Х.М., 2006).
Сегодня известно о положительном влиянии на функциональное состояние эндотелия препаратов различных фармакологических групп. Так нитраты восстанавливают дефицит эндогенного NO, ингибиторы АПФ помимо снижения синтеза AT II препятствуют разрушению кининов, антагонисты кальция тормозят активность AT II и эндотслина в гладких мышцах сосудов, усиливая вазодилататорный эффект NO, ингибиторы эндотелин-превращающего фермента и антагонисты рецепторов эндотелина-1 тормозят активность пептида (Бувальцев В.И., 2001; Бабак О.Я., Шапошникова Ю.Н., Немцова В.Д., 2004; Романовская Г.А., Акатова Е.В., Гороховская Г.Н., 2005; Галенко А.С., Шуленин С.Н., 2006; Herman A.G., Moncada S„ 2005).
Однако в настоящее время не существует препаратов для специфической коррекции ЭД, поэтому большую ценность представляют данные о влиянии различных лекарственных средств на функциональные характеристики эндотелия. Будущее за препаратами, обладающими не только гипотензивным эффектом, но и органопротективным действием, опосредованным позитивным влиянием на эндотелиальную функцию. Большой практический интерес может представлять комплексное лечение эндотелиальной дисфункции при артериальной гипертензии, когда антигипертензивная терапия будет сочетаться с применением других препаратов-корректоров нарушений функций эндотелия и немедикаментозными методами улучшения эндотелиальной функции.
В связи с вышеизложенным явилось актуальным изучение эндотелиопротективных свойств препаратов с различными патогенетическими механизмами действия: природного донатора оксида азота - аминокислоты L-аргинина SR, активатора фермента NO-синтазы - резвератрола, антиоксиданта оксипиридинового ряда - мексикора, препарата, содержащего в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды, - фосфоглива, цитопротектора метаболического ряда - милдроната, а также афинно очищенных антител к эндотелиальной NO-синтазе - импазы при экспериментальном дефиците оксида азота.
Таким образом, результаты оценки эффективности различных путей фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции на ADMA-подобной модели дефицита оксида азота позволят раскрыть перспективу целенаправленного и патогенетически осмысленного изучения возможностей их использования как существенного дополнения к существующим методам
лечения сердечно-сосудистых заболеваний и создать на их основе новый класс эндотелиотропных аддитивов.
Цель работы. Оценка возможности фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции препаратами с различными патогенетическими механизмами действия при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота.
Основные задачи исследования.
Оценить развитие эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.
Изучить эндотелиопротективную активность препарата, являющегося природным донатором оксида азота, L-аргинина SR при L-NAME-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.
Исследовать влияние L-аргинина на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.
Изучить эндотелиопротективную активность препарата, являющегося активатором фермента NO-синтазы, резвератрола и резвератрола в составе фосфолипидных наночастиц при L-NAME-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.
Изучить эндотелиопротективную активность антиоксиданта оксипиридинового ряда препарата мексикор при L-NAME-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.
Изучить эндотелиопротективную активность препарата, содержащего в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды - фосфоглив при L-NAME-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.
Изучить эндотелиопротективную активность цитопротектора метаболического действия препарата милдронат при L-NAME-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.
Изучить эндотелиопротективную активность препарата, содержащего в своем составе афинно очищенные антитела к эндотелиальной NO-синтазе, импаза при L-NAME-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.
Провести интегральный векторный анализ для комплексной оценки функциональных характеристик сосудистой реактивности, нитроксидергической системы, показателей сократимости и морфометрии миокарда с последующим расчетом вероятностного процента эндотелиопротекции на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0.
Научная новизна. В работе сформировано новое направление в доклинической опенке эидотелиотропной активности фармакологических препаратов с использованием коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), проведением функциональных проб, определением биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.
Впервые предложен способ оценки эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота с помощью расчета КЭД. Продемонстрировано, что эндотелпальная дисфункция характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхоліні (эндотелийзависимая вазодилатация) и шпропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 раз, резким снижением показателей биохимических маркеров (NOx, экспрессия NO-синтазы), а также отрицательной динамикой морфологических показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр кардиомиоцитов).
По совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей подтверждено эндотелиопротективнос действие природного донатора оксида азота L-аргинина SR. L-аргинин SR 30 мг/кг способствует преобладанию эндотелийзависимого расслабления сосудов, снижает коэффициент эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, предупреждает снижение содержания стабильных метаболитов оксида азота NOx и предотвращает увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов у животных с L-NAME-индуцировапной патологией.
Исследование влияния L-аргинина на уровень микроциркуляцин и ангиогенез в сравнении с рекомбинантными генами, кодирующими синтез эндотелиальных факторов роста (VEGF), показало, что полученные данные позволяют объективно говорить о том, что L-аргинин 200 мг/кг при системном введении способен активировать неоангиогенез и улучшать перфузию ишемизированных мышц.
В качестве потенциального эидотелиопротектора экспериментально обосновано использование перспективного препарата резвератрол (природный 3,5,4-тригидрокси-транс-стильбен), являющегося активатором фермента NO-синтазы. Впервые получены данные об эндотелио- и кардиопротективном эффекте резвератрола в составе фосфолипидных наночастиц при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предупреждении снижения содержания NOx. При этом нагрузочные пробы и морфометрия выявили уменьшение исчерпания миокардиалыюго резерва, одновременно с ограничением увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов.
В ходе проведенного исследования на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0 выявлена эндотелиопротективная активность антиоксиданта оксипиридинового ряда мексикора. Мексикор 30 мг/кг снижает КЭД до значения 1,9±0,2 у.е. по сравнению с группой нелеченых животных, где данный показатель равен 5,4±0,б у.е., а также предупреждает снижение содержания стабильных метаболитов оксида азота NOx.
Оригинальными являются результаты функциональных проб на фоне лечения препаратом фосфоглив, содержащем в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды при L-NAME-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте. При исследовании эндотелио- и кардиопротективного действия препаратов фосфоглив (капсулы) 2,2 г/кг, фосфоглив форте (капсулы) 0,515 г/кг, фосфоглив (лиофилизат) 5,0 мл/кг в дозах, сопоставимых по фосфотидилхолину, выявлено снижение КЭД по сравнению с группой нелеченых животных, предотвращение увеличения адренореактивности и снижения сократительного резерва миокарда.
Впервые установлено выраженное эндотелиопротективное действие цитопротектора метаболического действия препарата милдронат, ингибирующего активность гамма-бутиробетаингидроксилазы и вызывающего индукцию оксида азота в эксперименте. Милдронат 80 мг/кг способствует преобладанию эндотелийзависимого расслабления сосудов, снижает коэффициент эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных и оказывает положительное влияние на NO-продуцирующую функцию эндотелия.
Впервые показано выраженное эндотелиопротективное действие гомеопатически потенцированных антител к eNOS (С 12, СЗО, С200) - препарата импаза на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания NOx. Одновременно результаты нагрузочных проб свидетельствовали о предотвращении повышения адренореактивности, уменьшении исчерпания миокардиального резерва.
Научная новизна подтверждается получением 10 патентов РФ.
Практическая значимость. В работе обоснована эффективность фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции препаратами с различными патогенетическими механизмами действия: природным донатором оксида азота L-аргинином SR, активатором фермента NO-синтазы резвератролом, антиоксидантом оксипиридинового ряда мексикором, препаратом, содержащим в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды, фосфогливом, цитопротектором метаболического действия милдронатом и гомеопатически потенцированными антителами к eNOS (СІ2, СЗО, C20Q) препаратом импаза, для коррекции L-NAME-индуцированной ЭД в эксперименте. Показано, что их использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация), что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД.
Одновременно результаты нагрузочных проб, биохимических и морфологических исследований свидетельствовали о положительной динамике морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (снижение адренореактивности, предотвращение исчерпания миокардиального резерва, уменьшение диаметра кардиомиоцитов) и о восстановлении активности NO-
продуцирующей функции эндотелия (повышение продукции нитрит-ионов NOx).
Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные доклинические и клинические испытания исследуемых препаратов в качестве эндотелиотропных аддитнвов при лечении патологических состояний, связанных с развитием эндотелиалыюй дисфункции.
Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности препаратов фосфоглив форте производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ № ЛСР-008120/08), фосфоглив производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ Р N002528/01), препаратов мексиприм производства ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА» (РУ ЛС-001668) и мельдоний производства ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА» (РУ ЛСР-006481/08), включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ.
Материалы диссертационного исследования, касающиеся
эндотелиопротективной активности биологически активной добавки L-аргинип (свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.2795.3.05 от 18.03.05), включены в состав документов, поданных на регистрацию в ГУ НИИ питания РАМН. Результаты работы используются в работе кардиологического отделения МУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи», кардиологического отделения МУЗ «Городская больница № 1» г. Курска и в лекционных курсах кафедры фармакологии, клинической фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии Орловского государственного университета и кафедры фармхимии и фармакогнозии Белгородского государственного университета.
Основные положении, выносимые на защиту.
Комплекс методических подходов, включающий расчет коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), проведение функциональных проб, определение биохимических маркеров и оценку результатов морфологических исследований, является адекватным способом исследования эффективности фармакологической коррекции эндотелиалыюй дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте.
На основании проведенного комплексного изучения L-аргинина SR, резвератрола, мексикора, фосфоглива, милдроната, импазы на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO можно в качестве потенциальных эндотелиопротекторов предложить следующие фармако-терапевтические группы:
донаторы оксида азота
активаторы эндотелиальной NO-синтазы -антиоксиданты
мембранопротекторы, содержащие «эссенциальные фосфолипиды»
цитопротекторы метаболического действия
гомеопатически потенцированные антитела к eNOS
3. Эндотелио- и кардиоиротективные эффекты исследованных препаратов
на модели L-NAME-индуцнрованного дефицита оксида азота: природного
донатора оксида азота L-аргинина SR, активатора фермента NO-еинтазы резвератрола, антиоксиданта оксипиридинового ряда мексикора, препарата фосфоглив, содержащего в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды, цитопротектора метаболического действия милдроната, гомеопатически потенцированных антител к eNOS (С 12, СЗО, С200) импазы, свидетельствуют о перспективности дальнейшего доклинического и клинического изучения данных препаратов в качестве потенциальных эндотелиопротекторов.
Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых КГМУ в 2004, 2005, 2006, 2007, 2008 гг., XIII-XV Национальном конгрессе «Человек и лекарство», I—II Национальном конгрессе терапевтов, VII съезде аллерголов и иммунологов СНГ, XII Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева (2006). Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, внутренних болезней № 1, внутренних болезней № 2, гистологии, цитологии и эмбриологии, патофизиологии, НИИ Экологической медицины КГМУ (2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 67 печатных работ, 22 из них - в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, получено 10 патентов РФ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 532 источника, из них 132 отечественных и 400 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 348 страницах машинописи, содержит таблиц - 32, рисунков - 103, формул - 6.
Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции и основные группы эндотелиопротекторных препаратов
Хроническое подавление синтеза NO также было изучено у собак на фоне непрерывного внутривенного введения L-NAME. Исследователями показано, что введение L-NAME в дозе примерно 0,15 мг/кг в течение 5 дней собакам, находящимся на диете с нормальным поступлением в организм хлористого натрия, не вызывало повышения АД. Однако у собак, получавших с пищей повышенные количества хлористого натрия, инфузия L-NAME приводила к умеренному, но статистически значимому и устойчивому повышению АД [473]. В другой работе намного более высокие дозы L-NAME и L-NMMA (около 15 мг/кг в сутки) вызывали повышение АД на 16 мм рт. ст., которое сохранялось в течение восьми дней [370, 424]. Этот эффект блокировался введением L-аргинина, что подчеркивает специфический характер отмеченных ингибиторов в отношении NOS [370, 424]. Таким образом, в экспериментах на собаках получено, что повышение АД после блокады синтеза NO также имеет место, но менее выраженное, чем у крыс.
Несомненный интерес представляют данные о нарушении в системе L-аргинин - N0 у больных эссенциальной гипертонией людей. Сниженный уровень N0 в ЭК ослабляет его сосудорасширяющее действие, в том числе эндотелий(Ж))-зависимых вазодилататоров (эффект которых при достаточно низком уровне NO может становиться сосудосуживающим), усиливает вазоконстрикторные влияния эндотелина-1, ангиотензина, тромбоксана А2, норадреналина, способствует ремоделированию (структурной адаптации, гипертрофии) сосудистой стенки [390, 389, 439, 394, 334,403, 106].
Пероральное и парентеральное введение L-аргинина больным эссенциальной АГ восстанавливало уровень NO, снижало АД, улучшало системную» и почечную гемодинамику [294, 180, 178, 181]. Данный эффект был получен при внутривенной инфузии в течение 1 мин 20-30 г L аргинина [372]. В других наблюдениях гипотензивный эффект и снижение сосудистого сопротивления в почках в ответ на инфузию L-аргинина (0,5 г/кг) происходили у больных гипертонической болезнью как с нормальными функциями почек, так и с почечной недостаточностью [386]. Особенно благоприятным в этом плане оказалось применение L-аргинина у больных, у которых, помимо сниженного уровня N0, имело место повышенное со-держание эндогенного ингибитора eNOS N , N - диметиларгинина (несимметричного диметиларгинина - АДМА). При этом гипотензивный эффект L-аргинина сопровождался увеличением содержания N0 в выдыхаемом воздухе.
Аналогичные данные получены у детей и подростков с первичной АГ, у которых продукция N0 в 2 раза ниже, чем у здоровых сверстников. При этом установлена тесная корреляционная связь уровня АД и содержания NO в крови обследованных больных (г=- 0,75 для систолического и г=-0,86 для диастолического АД), что убедительно свидетельствует об уча-стии дефицита NO в патогенезе этой формы гипертензии [68]. При приеме такими больными L-аргинина (фирма "Nutri Pauer", США) в виде пищевой добавки по 500 мг/сут в течение 1 мес на 50-100% повышался уровень NO и до нормальных или близких к ним величин снижалось АД [75].
Анализируя вышеизложенное, можно сказать, что воспроизведение в эксперименте NO-дефицитной гипертонии и наличие NO-дефицитной компоненты в патогенезе других экспериментальных и клинических форм артериальной гипертонии являются в настоящее время доказанным фактом. Не вызывает также сомнения роль эндотелиальной дисфункции в повышении тонуса и реактивности сосудов - основного механизма развития NO-дефицитной гипертонии. Вместе с тем анализ конкретных внутриклеточных нарушений эндотелия, лежащих в основе описанных сдвигов тонуса и реактивности сосудов при NO-дефицитной гипертонии, не позволяет в настоящее время идентифицировать специфическую сигналпередающую систему, ответственную за возникновение отмеченных изменений: Наиболее обоснованной следует считать точку зрения о неселективном изменении функции эндотелия при NO-дефицитной гипертонии.
Таким образом, эндотелиальная дисфункция является системной патологией, сопряженной с нарушением микроструктуры и секреторной функции эндотелиальных клеток, одной из наиболее значимых систем сосудистого ложа. Формирование гипертензивных состояний, ишемических нарушений сердца, изменений гемостаза, гиперхолестеринэмии и гипергликемии, ведущих к патогенезу атеросклероза, диабета (и др.) обусловлено изменениями функции эндотелия и, в первую очередь, нарушениями продукции дилататорных и констрикторных субстанций, а также факторов, регулирующих взаимодействие эндотелия, с клетками крови (рис. 1.3). Базовый механизм развития эндотелиальной дисфункции, являющейся предиктором- ряда сердечно-сосудистых заболеваний, связан с изменениями синтеза-и рилизинга оксида азота, одного из наиболее значимых регуляторов эндотелиально-вазальной системы.
Оценка уровня микроциркуляции в мышцах голени крыс методом лазерной допплеровской флоуметрии
Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика P23ID «Gould», США, АЦП L-154 и компьютерной программы «Bioshell» регистрировали показатели кардиогемоди-намики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dtmax), максимальную скорость расслабления (-dp/dtmax), частоту сердечных сокращений (ЧСС) и интенсивность функционирования структур (ИФС) (произведение частоты сердечных сокращений и давления, развиваемого левым желудочком (мм рт. ст. х уд. мин) [94].
Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности: 1. Нагрузка объёмом (внутривенное одномоментное введение 0,9 % раствора NaCl, из расчёта 0,4 мл на 100 г) [116, 45]. 2. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида Г10"5моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г) [116, 45]. 3. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек [116, 45]. 4. 3-х минутную гипоксию [94, 98, 97]. Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO,-позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов [80]. Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски, интенсивность которой определяли спектрофотометрически при длине волны 540нм. Анализ 100 мкл депротеинизированной сыворотки проводили в 96 луночных планшетах с плоским: дном-Чувствительность метода, на приборе Labsysems Multiskan МСС/3 40 составляет 1,7 мкМ. Для колориметрического определения . нитрит-иона использовали реактив-Грисса, состоящий из равных частей раствора I (0;05% раствор N-нафтилэтилендиамина в, воде) и раствора II (1% раствор сульфаниламида- в 30% уксусной кислоте) [80], Оба раствора хранятся в темноте при температуре 4G в течение нескольких месяцев:- Для приготовления, раствора хлористого ванадия 400 мг V013 растворяли в 50 млШНЄІ с последующим фильтрованием через бумажный фильтр. Всегда использовалихвежеприготовленныйраствор.
Уровень метаболитов NO (то; есть, суммарную концентрацию нитратов и нитритов; NOx) определяли- колориметрическим методом по развитию окраски в реакциигдиазотированияі нитритом: сульфаниламида, входящего в-состав реактива1 FpnccaJ Для построения; калибровочной кривой; использовали lM;pacTBop;NaN2 в воде, который хранили при температуре: -20Є; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию . разведении для построения кривой.
Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида, азота (е-NOS)1 определяли в клеточном лизате по методу R.J. Hendrickson [127] с небольшими модификациями. Уровень экспрессии eNOS в аорте крыс измеряли с помощью поликлональных мышиных антител против eNOS (BD» Transduction Labs) с последующим проявлением методом; усиленной хеми-люминесценции ECL. После выведения животного из эксперимента отрезок крысиной аорты (20-30 мг)? промывали в 0,9% р-ре NaCl и хранили в жидком .азоте. В ходе эксперимента отрезок аорты взвешивали, измельчали В ступке при добавлении; жидкого азота, w экстрагировали белки добавлением 10-кратного-объема денатурирующего буфера 6,25 мМ? Трис рН 6;8, 2% ДОН; 5% меркаптоэтанол, .10% глицерин, 0,005% бромфеноловый синий с последующим кипячением в течении 3-х минут. Подготовленные образцы подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану методом Western-блоттинга. Мембрану инкубировали с мышиными поликлональными антителами против eNOS, затем обрабатывали по методу ECL и экспонировали с рентгеновской пленкой в течение суток. Затем пленку проявляли и сканировали полосы, рассчитывая их интенсивность с помощью компьютер-. ной программы TotalLab (Amersham). В качестве контроля использовали стандартно приготовленные образцы из 1 млн. культивируемых эндотели-альных клеток бычьей аорты (ВАЕС), интенсивность полос которых принимали за 100% (рис. 2.1).
Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов проводили гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента), почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий). Материал фиксировали в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Использовали окраски гематоксилином Рего и эозином для выявления ранних повреждений миокардиоцитов, по Ван Гизон, ставилась ШИК-реакция. При морфометрии сердца использован метод раздельного взвешивания миокарда с определением индексов, определение диаметра кар-диомиоцитов по методике Г.Г. Автандилова [1]. Определяли абсолютную и относительную массу надпочечников, в почках оценивали диаметр почечных телец и их клубочков. Определяли соотношение интима/медиа в участках сонной артерии и брюшной аорты.
Моделирование хронической ишемии задней конечности осуществляли под наркозом этаминалом натрия в дозе 35 мг/кг после соответствующей подготовки кожи (сбривание шерсти и обработка 70% спиртом). Затем производили разрез по внутренней поверхности области бедра на всю1 длину области. Рассекали собственную фасцию. Выделяли элементы основного сосудисто-нервного пучка бедра. Бедренную артерию отделяли от вены и нерва, мобилизовали (пересекали и перевязывали отходящие от нее ветви первого-порядка). Затем накладывали лигатуры на артерию в месте ее начала (под паховой связкой) и пересекали. Перевязывали и пересекали a. saphena, которая является аналогом глубокой бедренной артерии человека. Выделяли подколенную артерию и начальные отделы артерий голени (бифуркация подколенной артерии), которые пересекали. Участок магистрального сосуда, включающий бедренную, подколенную артерию и начальные отделы артерий голени удаляли. Значимого ретроградного кровотечения из артерий голени при операции не наблюдалось, поэтому лигатуры на культи артерий голени не накладывались. Рану на бедре послойно ушивали непрерывным швом.
Исследование эндотелиопротективной активности L-аргинина SR при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований
Иммуногистохимическая визуализация сосудов осуществлялась на срезах мышц голени крысы, моноклональными антителами к CD 31 (BD). Замороженные срезы фиксировались в- 4% растворе формалина в фосфат-ном буфере в течение 5 минут при комнатной температуре, промывали фосфатным буфером (рН 7,4). Для подавления эндогенной пероксидазной активности срезы помещались в 3% раствор перекиси водорода в фосфатном буфере 30 минут при комнатной температуре. Далее срезы инкубировали в 1% растворе БСА с добавлением 10% сыворотки донора вторых антител в течение 30 минут, затем с авидин/биотин блокирующим комплексом (Vector Laboratories) в течение 15 минут с каждым реагентом. Первичные антитела к CD 31 использовали в разведении 1:100 в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина вг течение 1 часа. Контрольные срезы инкубировали с раствором неспецифических иммуноглобулинов.в концентрации, соответствующей концентрации первых антител. Для выявления. комплексов первичных антител с антигенами проводили инкубацию с вторичными антителами в разведении 1:200 в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина в течение 40 минут при комнатной температуре. Для визуализации антител срезы инкубировали в течение 6 минут с комплексом авидин/пероксидаза [Vector Laboratories, в разведениях 1:50 с реагентом а (авидин) и реагентом В (пероксидаза хрена) в фосфатном буфере]. Далее на 10-20 секунд наносили раствор тетрахлорида диаминобензидина (Sigma) (0,5 мг/мл с 0,01% перекиси водорода, профильтрованный через 0,22 мкм фильтр (Millipore, USA). Срезы ополаскивали дистиллированной водой, дегидратировали в водных растворах этанола (80%, 96%, 100%) и в толуоле, заливали в канадский бальзам. Подсчет сосудов на окрашенных гистологических срезах мышц крысы осуществляли на световом микроскопе Zeiss Axiovert 200М преувеличении х 20. На 5 срезах, сделанных на разных уровнях мышцы, обсчитывали по 5 полей зрения. Данные для каждого животного усредняли.
Исследуемые химические соединения и дизайн эксперимента Изучена эндотелиопротективная и кардиопротективная активность природного донатора оксида азота L-аргинина SR, активатора фермента NO-синтазы резвератрола, аскорбиновой кислоты, антиоксиданта оксипи-ридинового ряда мексикора, фосфоглива и входящих в его состав глицира-та и липоида С80, цитопротектора метаболического действия милдроната, гомеопатического препарата импаза, позиционируемых как класс эндоте-лиотропных аддитивов, дополнительно активирующих нитроергическую систему и защищающих эндотелий от повреждения.
В хронических экспериментах при моделировании L-NAME-опосредованного дефицита оксида азота исследуемые вещества вводились в соответствующих дозах один раз в сутки внутрибрюшинно или внутри-желудочно в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME. Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований выполненных на крысах на данной модели патологии [315, 317, 513,451].
Согласно данным литературы, кардиотропные эффекты донатора оксида азота L-аргинина в экспериментах на крысах обнаруживаются в диапазоне доз от 10 до-600 мг/кг [133 , 240]. При этом различают малые дозы -10-30 мг/кг, которые соответствуют суточной дозе L-аргинина в качестве БАД. Большие дозы L-аргинина используются в комплексной терапии ИБС, ХСН для коррекции эндотелиальной дисфункции и в качестве дополнительной терапии к донорам NO - нитратам [18, 240, 258, 293]. Таким образом, эндотелиопротективная активность L-аргинина производства Aji-nomoto Co. INC (Japan), в медленно высвобождающейся форме (L-аргинин SR, производства ОАО «ФармстандартЛексредства»), исследовалась нами в дозе 30 мг/кг при внутрижелудочном введении, что соответствует разрешенной суточной дозе в России по СанПИН - М.Р.2.3.1.1915 (2004) и данным литературы (Alan L. Miller, ND, 2006), в хронических экспериментах на фоне моделирования L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота. Дизайн эксперимента представлен на рис. 2.9.
Эндотелиотропная активность резвератрола производства Green-syn (Guangzhou), Ltd и производства ГУ НИИ биомедицинской химии РАМН4 исследовалась в дозе 0,15 мг/кг, что соответствует разрешенной суточной дозе в России по Сан. ПИН - М.Р.2.3.1.1915 (2004) и в дозе 2 мг/кг, которая определялась нами с учетом максимального его содержания в экстраординарных сортах вин (10 мкмоль/л, 600 мл/сут.). Согласно литературным данным именно в дозе 2 мг/кг резвератрол, проявляет максимальные эндотелио- и кардиотропные эффекты [188, 200, 277, 358, 497, 456, 479]. Дизайн эксперимента представлен на рис. 2.9.
Доза аскорбиновой кислоты (30 мг/кг) и мексикора (30 мг/кг) была определена нами учитывая эндотелио- и кардиотропные эффекты минорного антиоксиданта 7tQ510 (30 мг/кг), являющегося по сути-аскорбиновой кислотой, модифицированой титаном, и в связи с этим для сравнения были выбраны равно эквивалентные дозы этих препаратов. Дизайн эксперимента представлен на рис. 2.9.
При изучении эндотелио- и кардиопротективной активности препарата фосфоглив, животные на фоне L-NAME индуцированного дефицита оксида азота внутрижелудочно получали фосфоглив (капсулы) в дозе 2,2 г/кг, фосфоглив форте (капсулы) в дозе 0;515 г/кг, глицират в дозе 0,2 г/кг, липоид С80 в дозе 0,3 г/кг, внутрибрюшинно фосфоглив (лиофили-зат) в дозе 5,0 мл/кг и-0,5 мл/кг. Дозы препаратов фосфоглив (капсулы) и фосфоглив (лиофилизат) рассчитывались по входящему в их состав фос-фатидилхолину, равноэквивалентно содержанию последнего в препарате эссенциале форте Н (капсулы) и последующему пересчету доз с человека на крысу в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Количественное содержание фосфатидилхолина в пересчете на безводное вещество для- фосфоглива (капсулы) и фосфоглива (лиофилизат) составляло соответственно 73179% и не менее 94,0%. Прирасчете доз, субстанций глицират и липоид С80 также учитывалось содержание последних в препарате эссенциале форте Н1 (капсулы) с последующим пересчетом с человека на экспериментальное животное. Дизайн эксперимента представлен на рис. 2.9.
Исследование эндотелиопротективной активности препарата импаза при L-NAME- индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований
В почках наблюдались закономерные компенсаторные изменения в виде гипертрофии почечных телец (средний диаметр 87,4+0,8; в норме 72,6+0,8 мкм) с расширением полости капсулы, составившей 19,5% площади (в норме 14,6%), что в сочетании с диффузным полнокровием свидетельствует о развитии гиперфильтрации. Заметной реакции мезангия не отмечено: среднее количество клеток на клубочек составило 31,0+0,6, (в норме 37,8+0,9). Со стороны канальцев наблюдалось умеренное расширение, очагово-зернистая дистрофия, в просвете единичных канальцев имелись гиалиновые цилиндры.
В головном мозге отмечены очаговые изменения в виде полнокровия сосудов оболочек, спастических изменений мелких артерий, проявлявшихся гофрированностью интимы, сужением просвета, очагов периваскулярного отека.
Комплекс изменений в сердце, головном мозге и почках позволяет оценить их как соответствующие периоду стойкого повышения артериального давления с развитием поражения сосудов. Таким образом, результаты гистологических исследований обнаружили, что« моделирование L-NAME-индуцированного дефицита NO на 8-е сутки приводит к яркой гипертрофии миокардиоцитов, утолщению мышечного слоя сосудистой- стенки и спазму артериол, наиболее выраженному в почечных артериях, а также «вздыбливанию» эндотелиоцитов.
Интегральный анализ. Для оценки эндотелио- и кардиопротективного действия исследуемых препаратов нами был использован комплекс функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований, позволяющий дать интегральную характеристику эндотелиальной и миокардиальной функции с использованием нескольких параметров, в полной мере характеризующих состояние сердечно-сосудистой системы.
Так, используя интегральный анализ всего спектра проводимых исследований при L-NAME индуцированной модели дефицита NO, мы представили значения САД, ДАД, КЭД, диаметра кардиомиоцитов, Total NO и значение исчерпания миокардиального резерва в виде вектора. Все вектора, каждый из которых соответствовал функциональному, биохимическому и морфологическому показателю, были построены на плоскости в прямоугольной декартовой системе координат Оху, полюсом всех векторов было выбрано начало прямоугольной декартовой системы координат, полярной осью служило положительное направление оси Оу, длина каждого вектора равнялась соответствующему значению исследуемого показателя. Направление каждого вектора задавалось жестко, 1-й вектор (значение САД) совпадал с осью Оу, последующие вектора располагались в порядке проведения нагрузочной пробы по часовой стрелке, угол между соседними векторами составлял 72 (рис. 3.17).
Векторные значения САД, ДАД, КЭД, диаметра кардиомиоцитов, Total NO и исчерпания миокардиального резерва были представлены, в процентном-отношении от соответствующих значений группы интактных животных, принятых за 100%, площадь векторной диаграммы выражалась в условных единицах (усл. ед.).
В качестве интегральной характеристики эндотелиальной функции мы использовали площади векторных диаграмм, которые позволили провести оценку эндотелиопротективной активности исследуемых препаратов на фоне L-NAME индуцированной модели дефицита NO.
Сравнивая площади векторных диаграмм, мы видим выраженные различия между группой интактных животных и животных с эндотелиальной дисфункцией, развившейся на фоне дефицита оксида азота при введении L-NAME (рис. 3.17). Различие в площади векторных диаграмм можно объяснить за счет вклада достоверно более высокого значения систолического и диастолического давлений, КЭД, диаметра кардиомиоцитов, а также исчерпания миокардиального резерва и снижения NO-продуктивной активности эндотелия в группе с NO-дефицитной эндотелиальнои дисфункцией.
Таким образом, значение площади векторной диаграммы в группе с L-NAME индуцированным дефицитом NO, составляющее 10,118 усл.ед., против значения площади векторной диаграммы интактных животных 5,482 усл.ед., соответствует симптомокомплексу выраженной АГ и эндотелиальной дисфункции.
Таким образом, вышеизложенное свидетельствует о том, что длительное, в течение 7 суток, внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 25 мг/кг вызывает у лабораторных животных комплекс функциональных, биохимических и морфологических изменений, связанных с развитием дефицита NO, вследствие блокады NO-синтетазы. Установлено, что введение крысам-самцам блокатора NO-синтазы приводит к выраженной АГ и эндотелиальной дисфункции. L-NAME индуцированный дефицит оксида азота способствовал проявлению гиперреактивности в ответ на адреналовую пробу и снижению сократительной способности миокарда при пробе на нагрузку сопротивлением, а также резкому уменьшению уровня нитрит-ионов и экспрессии eNOS. Гистологически обнаруживалась гипертрофия миокарда и мышечного слоя сосудистой стенки. Описанный симптомокомплекс клинически можно экстраполировать как злокачественную гипертензию.
