Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 13
2.1. Дофаминергические системы мозга 13
2.1.1 Нейрохимия дофаминергической нейропередачи 15
2.1.2. Дофаминовые рецепторы 18
2.1.2.1. Классификация рецепторов дофамина
2.1.2.2. Сигнальная функция рецепторов дофамина 22
2.1.2.3. Области экспрессии и локализации рецепторов
дофамина. Ауторецепторы, их функциональное значение 27
2.1.3.Фармакологическая модуляция дофаминергической нейропередачи
2.1.4. Функциональная роль рецепторов дофамина 36
2.2. Психостимуляторы 47
2.2.1 Общая характеристика класса психостимуляторов
2.2.2. Амфетамин и сиднокарб 53
3. Материалы и методы 58
3.1 Экспериментальные животные
3.2. Метод внутримозгового микродиализа
3.3. Методика оценки стереотипного поведения животных 60
3.4. Регистрация спонтанной двигательной активности мышей 61
3.5. Оценка активности гена c-Fos 63
3.5.1. Оценка двигательной активности мышей линий С57В1 и BALB/c
3.5.2 Иммуногистохимическое выявление c-Fos белка. 64
3.6. Материалы 65
4. Результаты исследований 66
4.1. Изучение эффектов веществ, модулирующих дофаминергическую нейропередачу, на динамику изменения содержания дофамина, ДОФУК и ГВК в дорзальном стриатуме крыс in vivo.
4.1.1. Влияние d-амфетамина на нейрохимические параметры дофаминергической нейропередачи в дорзальном стриатуме крыс.
4.1.2. Влияние сиднокарба на нейрохимические параметры дофаминергической нейропередачи в дорзальном стриатуме крыс .
4.1.3. Влияние селективного антагониста Д2-подтипа дофаминовых рецепторов раклоприда на параметры дофаминергической нейропередачи в дорзальном стриатуме крыс линии Вистар
4.1.4. Влияние селективного антагониста Д1-подтипа дофаминовых рецепторов SCH23390 на параметры дофаминергической нейропередачи в дорзальном стриатуме крыс линии Вистар
4.1.5. Влияние антагониста Д4-подтипа дофаминовых рецепторов клозапина на параметры дофаминергической нейропередачи в дорзальном стриатуме крыс линии Вистар
4.2. Изучение эффектов веществ, модулирующих дофаминергическую нейропередачу, на динамику развития стереотипного поведения
4.2.1. Влияние d-амфетамина и сиднокарба на развитие стереотипного поведения.
4.2.2. Влияние селективного Д1-антагониста SCH23390 на динамику развития стереотипного поведения, вызванного введением d-амфетамина и сиднокарба.
4.2.3. Влияние селективного Д2-антагониста раклоприда на динамику развития стереотипного поведения, вызванного введением d-амфетамина и сиднокарба
4.2.4. Влияние Д4-антагониста клозапина на динамику развития стереотипного поведения, вызванного введением d-амфетамина и сиднокарба.
4.3. Влияние веществ, модулирующих дофаминергическую передачу мозга, на локомоторную активность мышей С57В1.
4.3.1. Эффект d-амфетамина на локомоторную активность мышей С57В1.
4.3.2. Эффект сиднокарба на локомоторную активность мышей С57В1.
4.3.3. Влияние селективного антагониста Д1-подтипа рецепторов SCH23390 на локомоторную активность мышей С57В1.
4.3.4. Влияние селективного антагониста Д2-подтипа рецепторов раклоприда на локомоторную активность мышей С57В1.
4.3.5. Влияние антагониста Д4-подтипа рецепторов клозапина на локомоторную активность мышей С57В1
4.4. Сравнительный анализ влияния d-амфетамина и сиднокарба на локомоторную активность и паттерны экспрессии белка c-Fos в мозге мышей инбредных линий С57В1 и BALB/c
4.4.1. Изучение эффектов d-амфетамина и сиднокарба на локомоторную активность мышей линий С57В1 и BALB/c
4.4.2. Эффект однократного введения d-амфетамина и сиднокарба на уровень экспресии белка c-Fos в структурах мозга мышей двух линий
5. Заключение 154
6. Выводы 163
7. Список сокращений 165
8. Список цитируемой литературы
- Нейрохимия дофаминергической нейропередачи
- Методика оценки стереотипного поведения животных
- Влияние сиднокарба на нейрохимические параметры дофаминергической нейропередачи в дорзальном стриатуме крыс
- Влияние антагониста Д4-подтипа дофаминовых рецепторов клозапина на параметры дофаминергической нейропередачи в дорзальном стриатуме крыс линии Вистар
Введение к работе
Психомоторные стимуляторы до настоящего времени находят применение в клинической практике при лечении ряда психоневротических расстройств, таких как адинамические, анергические и апатические состояния, нарколепсия, а также синдрома гиперактивности с нарушением внимания у детей. Вещества, близкие по структуре к фенилалкиламинам применяются для коррекции избыточного веса [Машковский, 1993; Арушанян, 2003; Holmes, 1995; Poulin, 2001].
Вместе с тем, использование психостимуляторов в значительной степени ограничено наличием серьезных побочных эффектов (периферическое симпатомиметическое действие, возможность развития моторной гиперактивности, агрессивных реакций, психотических шизофреноподобных состояний с бредом и галлюцинациями, нарушения аппетита и сна, нейротоксический потенциал).
Существенной особенностью фармакологического спектра психомоторных стимуляторов является характерный эйфоризирующий эффект, с которым связан высокий риск развития физической и психической зависимости. Указанное обстоятельство является причиной широкого немедицинского использования психостимуляторов, что влечет за собой развитие наркомании.
Наиболее распространенными психостимуляторами являются представители группы фенилэтиламина (d-амфетамин, метамфетамин, катинон, метилфенидат и их многочисленные структурные производные). Близким по действию к фенилэтиламинам является растительный алкалоид кокаин.
Медицинское, а особенно немедицинское применение психостимуляторов в последние годы постоянно растет, представляя собой серьезную социальную проблему. Так, по данным зарубежной статистики, немедицинское потребление амфетаминов среди подростков в США и Канаде в период 80-90х годов прошлого века выросло в 1,5-2 раза [Poulin, 2001]; в то же время число людей, официально зарегистрированных в качестве потребителей кокаина в США оценивается приблизительно в 25 млн человек [Lange and Hillis, 2001].
Таким образом, одной из актуальных задач современной психофармакологии является изучение тонких механизмов, лежащих в основе психостимулирующего и нейротоксического действия соединений данной группы. Не менее важной задачей психофармакологии представляется создание нетоксичных заменителей амфетаминов с одной стороны, и веществ эффективных для профилактики и лечения патологических состояний, связанных с хроническим приемом психостимуляторов.
Механизм действия наиболее популярных психомоторных стимуляторов (кокаин, амфетамины) тесным образом увязывается с их способностью влиять на состояние катехоламинергической нейропередачи мозга [Seiden et al., 1993; Cho and Segal, 1994; Berke et al., 1998; Jones et al., 1998]. В частности, принято считать, что развитие психостимулирующего эффекта амфетамина и его аналогов, в значительной степени, обусловлено воздействием на процесс «обратного захвата» пресинаптическими нервными окончаниями. Другими вероятными «мишенями» действия психостимуляторов являются стимуляция перераспределения внутриклеточного неиротрансмиттера из везикулярного «депо» в цитоплазму, а также прямое ингибирование активности моноаминооксидазы (ключевого фермента метаболизма дофамина) [Cho and Segal, 1994; Jones et al., 1998].
Многочисленные исследования, проведенные в последнее время, подтвердили высказанное ранее предположение, согласно которому нейрохимической основой механизма действия амфетаминов является их способность избирательно связываться со специфическим мембранным белком -дофаминовым транспортером (ДАТ), обеспечивающим процесс обратного захвата (re-uptake) нейротансмиттера из синаптической щели в нервные окончания дофаминергических нейронов соответствующих структур мозга.
Результатом этого является значительное возрастание внеклеточной концентрации дофамина и усиление функциональной активности дофаминергической нейропередачи [Seiden et al., 1993; Cho and Segal, 1994; Jones etal., 1998].
Недавние исследования, выполненные на мышах с делецией гена ДАТ (так называемые ДАТ-нокаутированные мыши) показали, что эти животные характеризуются повышенной локомоторной активностью, значительно более высоким уровнем внеклеточного дофамина и состоянием длительной гиперактивации дофаминовых рецепторов. Обнаружено также, что ДАТ-нокаутированные мыши неадекватно реагируют на амфетамин: введение психостимулятора этим животным не сопровождается накоплением внеклеточного дофамина, а изменения на поведенческом уровне характеризуются парадоксальным успокаивающим ответом, который предположительно связан с ингибиторным влиянием психостимулятора на серотониновый мембранный транспортер [Jones et al., 1998; Gainetdinov et al., 1999].
В клинической практике получены доказательства генетического полиморфизма ДАТ, ассоциированные с той или иной патологией мозга.
Все вышеизложенное позволяет заключить, что именно механизм регуляции функциональной активности дофаминового транспортера является ведущей «мишенью» фармакологических воздействий, модулирующих эффективность нейропередачи, в частности - действия амфетаминоподобных стимуляторов.
По мере высвобождения во внеклеточное пространство, дофамин способен взаимодействовать со специфическими дофаминовыми рецепторами, инициируя активацию таких процессов, как запуск каскадов вторичных мессенджеров, изменение проницаемости Na+-, К+-, Са2+ - каналов, индукцию генов раннего ответа и т. д., что опосредует клеточный ответ [Missale et al., 1998].
Традиционно дофаминовые рецепторы подразделяют на 2 основных семейства: Д2-подобные (включает Д2-, ДЗ- и Д4-рецепторы) и Д1-подобные (содержит Д1- и Д5-рецепторы, соответственно). Отличительной особенностью Д2/ДЗ дофаминовых рецепторов считается их локализация на самих дофаминергических нейронах, что, очевидно, подразумевает ауторецепторную функцию.
В последнее время, применение различных фармакологических и генетических манипуляций позволило выявить наличие сложной регуляторной взаимосвязи между дофаминовым транспортером и Д2-подтипом дофаминовых рецепторов. В частности было показано, что введение Д2-антагониста раклоприда значительно удлиняет время клиренса дофамина в структурах мозга крыс, обнаруживая тем самым непосредственное модулирующего влияние со стороны Д2-подтипа дофаминовых рецепторов на функциональную активность дофаминового транспортера. [Cass et al., 1994]. С другой стороны, стимуляция Д2-рецепторов опосредует повышение скорости работы ДАТ и обратного захвата дофамина (по-видимому, через К+-опосредованную гиперполяризацию нейрональной мембраны) [Lacey et al., 1987; Malenka et al., 2000].
Использование методики внутримозгового микродиализа на свободно-подвижных животных, позволяющей оценить in vivo изменения нейрохимических параметров (внеклеточного содержания нейротрансмиттеров и их основных метаболитов) в условиях комбинированного введения Д2-антагонистов и соединений, вызывающих функциональную блокаду «обратного захвата» дофамина дало противоречивые результаты [Sharp et al., 1986; Pehek, 1999; Rahman et al., 2001a]. Принципиальную роль, как предполагается, в этом случае может играть механизм «отрицательной обратной связи», опосредованный участием Д2-ауторецепторов [Iravani and Kruk, 1995; Schmitz et al., 2001].
Тем не менее, истинная роль как пре-, так и постсинаптического рецепторного компонента в механизме действия психостимуляторов изучена явно недостаточно.
Планируемое в данной работе детальное изучение возможной роли отдельных подтипов дофаминовых рецепторов в нейрохимических и фармакологических эффектах соединений психостимулирующего типа, открывает принципиально новый подход к изучению данной проблемы.
Наряду с хорошо известным психостимулятором d-амфетамином, в представленной работе использовался оригинальный отечественный препарат сиднокарб (З-(р-фенилизопропил)-Ы-фенилкарбамоилсиднонимин). Сиднокарб обладает сходным с амфетамином спектром фармакологической активности, при умеренном побочном действии. Известно также, что в отличие от амфетамина сиднокарб не угнетает активность МАО. Важным шагом вперед в изучении механизма действия пихостимуляторов явилось применение метода внутримозгового микродиализа [Андяржанова и соавт., 1999; Zetterstrom et al., 1983; Gainetdinov et al., 1997; Afanas ev et al., 2001]. Эти исследования показали, что сиднокарб по ряду показателей существенно отличается от амфетамина [Gainetdinov et al., 1997; Anderzhanova et al., 2000; Afanas ev et al., 2001]. Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы явилось изучение функциональной роли рецепторного звена дофаминергической нейропередачи мозга, в том числе участие отдельных подтипов дофаминовых рецепторов, в механизме действия психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба. Для достижения этой цели в исследовании были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба на динамику изменения внеклеточной концентрации дофамина и его метаболитов (ДОФУК и ГВК) в дорзальном стриатуме свободноподвижных крыс in vivo.
2. Оценить влияние антагонистов Д1-, Д2- и Д4-подтипов дофаминовых рецепторов на изменение внеклеточного уровня дофамина и его метаболитов (ДОФУК и ГВК), обусловленное введением психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба.
3. Оценить эффекты антагонистов различных подтипов дофаминовых рецепторов на динамику стереотипного поведения крыс, вызванного психостимуляторами.
4. Оценить вклад отдельных подтипов дофаминовых рецепторов (Д1, Д2 и Д4) в механизмы формирования локомоторной гиперактивности, обусловленной воздействием d-амфетамина и сиднокарба.
5. Изучить эффекты психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба на локомоторную активность и паттерн экспрессии белка c-Fos (продукта «раннего гена» c-fos) в мозге мышей инбредных линий С57В1 и BALB/c
Научная новизна.
В данной работе впервые продемонстрировано различное влияние Д1, Д2 и Д4-ПОДТИПОВ дофаминовых рецепторов на изменение дофаминергической нейропередачи в стриатуме крыс линии Вистар (in vivo), обусловленное введением оригинального психостимулятора сиднокарба. Впервые проведен сравнительный анализ участия отдельных подтипов (Д1, Д2 и Д4) дофаминовых рецепторов в механизме развития стереотипного поведения, вызванного введением d-амфетамина и сиднокарба. С помощью методики регистрации двигательной активности животных в установке "Opto-Varimex", впервые продемонстрировано неодинаковое вовлечение Д1, Д2 и Д4 дофаминовых рецепторов в механизм локомоторной гиперактивности, вызванной введением d-амфетамина и сиднокарба. В представленной работе впервые продемонстрирована экспрессия белка Fos (продукта гена «раннего ответа» c-Fos) в мозге мышей инбредных линий, вызванная острым введением психостимулятора сиднокарба. Теоретическая и практическая значимость.
Был проведен сравнительный анализ изменения нейрохимических и поведенческих параметров в условиях воздействия психостимуляторами d-амфетамином и сиднокарбом. Продемонстрированы значительные отличия в участии дофаминовых рецепторов Д1-, Д2- и Д4-подтипов в механизме психостимулирующего действия. Учитывая сниженный риск возникновения лекарственной зависимости, а также менее выраженные побочные эффекты отечественного психостимулятора по сравнению с d-амфетамином, выяснение тонких механизмов действия этих соединений вносит существенный вклад в определение стратегии направленного поиска агентов обладающих необходимым психостимулирующим спектром действия, при сниженном риске возникновения побочных эффектов.
Апробация работы.
Результаты исследований были доложены и обсуждены на 5th ECNP Regional Meeting, С.-Петербург, Россия, 2000, на VIII Всероссийской школе молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии», Россия, Казань, 2001, на XXIII Congress of Neuropharmacology, Montreal, 2002, Международном симпозиуме «Neuron differentiation and plasticity - regulation by intercellular signals», Москва, Россия, 2003, Ежегодной Всероссийской конференции «Человек и лекарство», Москва, Россия, 2003, на лабораторных и межлабораторных семинарах НИИ Фармакологии РАМН. Публикации. Основное содержание работы отражено в 11 публикациях (8 тезизов и 3 статьи).
Нейрохимия дофаминергической нейропередачи
Существует и альтернативная модель депонирования дофамина (Рис. 2), в которой рассматриваются два основных пула нейротрансмиттера: лабильное депо (цитоплазматический пул) и стабильное депо (везикулярный пул) [Leviel et al., 1989].
Высвобождаясь из варикозных окончаний нейронов в синаптическую щель, нейротрансмиттер взаимодействует с дофаминовыми рецепторами, локализованными как пре-, так и постсинаптически (см. ниже) и/или инактивируется во внеклеточном пространстве, либо после захвата прилегающими глиальными клетками. Значительная часть дофамина интенсивно закачивается из внеклеточного пространства обратно в нейрон при участии специфического переносчика (дофаминового транспортера) и подвергается внутринейрональному метаболизму [Cooper et al. 1991; Feldman et al., 1997].
Основными ферментами, катализирующими реакции превращения моноаминов, являются моноаминоксидаза (МАО) и КОМТ (Рис.2). Главные метаболиты дофамина - 3,4-диоксифенилуксусная кислота (ДОФУК), образующаяся из дофамина под действием МАО и гомованилиновая кислота (ГВК), в меньшей степени - 3-метокситирамин [Zetterstrom et al., 1988]. В отличие от ДОФУК, два последних метаболита образуются внеклеточно при участии КОМТ [Cooper et al. 1991; Feldman et al., 1997].
В поддержании и регуляции необходимого гомеостаза дофаминергического нейрона важную роль играют специфические переносчики данного катехоламина - дофаминовый транспортер (ДАТ) и везикулярный моноаминовый транспортер (ВМАТ) [Miller et al., 1999; Fumagalli et al., 1999; Gainetdinov and Caron, 2002].
Первый принадлежит к семейству NaVCF-зависимых субстратспецифичных нейрональных транспортеров и представляет собой мембранно-локализованный белок, обеспечивающий функцию обратного захвата дофамина из внеклеточного пространства. ДАТ играет ключевую роль в поддержании нейрохимического гомеостаза на уровне синаптическои передачи сигнала, а также мишенью различных фармакологических агентов: антидепрессантов, амфетаминов и кокаина, номифензина [Машковский, 1993; Jones et al., 1999; Gainetdinov et al., 1999; Gainetdinov and Caron, 2002 Gainetdinov and Caron, 1998]. ВМАТ является членом семейства TEXAN (т.н. «антипортеры» выкачивающие токсины) и участвует в процессе транспортировки дофамина в синаптические везикулы [Miller et al., 1999]. Нарушение механизма нормального функционирования обоих переносчиков дофамина (ДАТ и ВМАТ) тесным образом увязывается с дисфункцией транссинаптической передачи сигнала, процессами нейротоксического повреждения нейронов и рядом нейропсихиатрических заболеваний (синдром Паркинсона, алкогольная зависимость, шизофрения, депрессия) [Fumagalli et al, 1999; Miller et al., 1999]. На рубеже 1970/80-ых годов прошлого века, были накоплены многочисленные данные о существовании и функциональной гетерогенности специфических рецепторов дофамина [Caron et al., 1978; Stoof and Kebabian, 1981]. Согласно эффектам, оказываемым на систему внутриклеточной генерации цАМФ, эти рецепторы разделили на две основные группы: Д1-подтип (активирующий аденилатциклазную систему клетки (АЦ), что вызывает генерацию накопления вторичного посредника цАМФ) и Д2-подтип, (ингибирующий аденилатциклазу или не оказывающий на нее заметного действия) [Clark and White, 1997; Missale et al., 1998].
Последующие работы подтвердили правильность предложенной классификации и позволили детально оценить различия фармакологических, физиологических и биохимических свойств данных рецепторных подтипов. Также были получены доказательства участия дофамина в периферических реакциях организма и выделены два соответствующих подтипа периферических рецепторов дофамина, которые впоследствии отнесли к тем же Д1 и Д2 подтипам [Missale et al, 1998].
Подобная концепция рецепторного дуализма оставалась доминирующей на протяжении двух десятилетий, сохранившись в целом неизменной до сегодняшнего времени [Hiroi et al., 2002; Emilien et al., 2002]. Вместе с тем, бурное развитие молекулярной и клеточной биологии (в частности, техники генного клонирования), позволило идентифицировать и охарактеризовать в 1988-91 годах прошлого века три новых рецепторных подтипа - ДЗ, Д4 и Д5 [Sokoloff et al., 1990; Van Тої etal., 1991; Sunahara et al., 1991].
Все описанные выше рецепторы дофамина относятся к большому семейству метаботропных рецепторов нейротрансмиттеров и гормонов, сопряженных с гетеротримерным гуанин-нуклеотидным регуляторным белком (G-белком).
Методика оценки стереотипного поведения животных
Гипертермическая реакция на фоне сиднокарба также представляется менее выраженной, чем таковая при введении амфетамина. Однократная инъекция сиднокарб в дозе 25 мк/кг вызывает у мышей повышение ректальной температуры на 0,5-1С, при этом с увеличением дозы до 100 мг/кг, существенного усиления гипертермии не наблюдается. В то же время, амфетамин, в дозах 15-25 мг/кг, повышает ректальную температуру животных гораздо отчетливее (в среднем на 1,5-2,5С) [Альтшулер и соавт., 1973].
Еще одним преимуществом сиднокарба перед амфетамином является сниженный нейротоксический эффект. В частности, по данным Шуваловой и соавт. [Шувалова и соавт., 1976] сиднокарб приблизительно в 4 раза менее эффективен по тесту «острой групповой токсичности» у крыс. Сравнение двух психостимуляторов в этом же тесте на мышах, выявило более чем 10-кратную переносимость сиднокарба над амфетамином [Шувалова и соавт., 1976].
Эти данные подтверждаются результатами, полученными Afanas ev и соавт. [Afanas ev et al., 2001]. Используя методику внутримозгового микродиализа на свободноподвижных животных, авторы продемонстрировали, что 4-х кратное субхроническое введение амфетамина и сиднокарба в эквимолекулярных дозах, сопровождается достоверным увеличением уровня гидроксильных радикалов в стриатуме крыс линии Вистар. При этом повышение уровня гидроксильных радикалов в диализатах крыс на фоне d-амфетамина, приблизительно в три раза превосходило таковое для сиднокарба [Afanas ev et al., 2001].
Относительно медленное (по сравнению с амфетамином) развитие эффектов сиднокарба может быть связано с тем, что после всасывания в кишечнике (при пероральном введении), препарат депонируется в жировых тканях, откуда относительно медленно поступает в кровь [Альтшулер и соавт., 1977]. При попадании в кровь препарат и его метаболиты довольно быстро выводятся из организма: время полувыведения радиактивного сиднокарба 20,3 ± 1,2 часа [Альтшулер и соавт., 1977].
Предполагается, что нейрохимической основой действия сиднокарба является его способность влиять на еатехоламинергическую нейропередачу в мозге, путем инигибирования обратного захвата катехоламинов нервными терминалями [Альтшулер и соавт., 1976; Gainetdinov et al., 1997].
В частности, показано, что сиднокарб оказывает более выраженный блокирующий эффект на обратный захват дофамина, по сравнению с амфетамином. В то же время, амфетамин более эффективен в отношении «обратного захвата» норадреналина; наконец, «re-utake» серотонина предотвращается амфетамином и сиднокарбом наименее эффективно [Erdo et al., 1981].
Стимулирующий эффект сиднокарба на поведенческую активность проявляется в усилении локомоции [Альтшулер и соавт., 1973, Середенин, Ведерников, 1979; Witkin et al., 1999]. У мышей и крыс эффект развивается при введении препарата в дозах 10-20 мг/кг через 10-15 минут, и продолжается в течение нескольких часов. Возбуждение не сопровождается проявлениями агрессивности. Увеличение дозы сиднокарба приводит к появлению элементов стереотипного поведения [Машковский и соавт., 1973].
Сиднокарб вызывает ослабление угнетающего эффекта галоперидола на локомоторную активность [Witkin et al., 1999]. В то же время, блокада дофаминовых рецепторов Д1- и Д2-подтипа (SCH 39166 и спипероном, соответственно) предотвращала локомоторную гиперактивность, обусловленную как сиднокарбом, так и метамфетамином (структурный аналог амфетамина) [Witkin et al., 1999]. Таким образом, представленные данные позволяют предположить наличие существенного дофаминергического компонента в психостимулирующих эффектах сиднокарба. В то же время тонкие нейрохимические особенности механизма действия сиднокарба, определяющие его оригинальный фармакологический профиль, остаются практически неизвестными.
Влияние сиднокарба на нейрохимические параметры дофаминергической нейропередачи в дорзальном стриатуме крыс
Раклоприд в дозе 1,2 мг/кг п/к вызывало достоверное повышение внеклеточного уровня дофамина (Рис. 8а). Максимальный эффект наблюдался к концу первого часа с момента инъекции Д2-антагониста и составлял 210±15% по сравнению с базальным уровнем. После этого отмечалось постепенное снижение содержания дофамина в диализатах крыс до исходных значений.
Динамика изменения внеклеточного содержания ДОФУК была аналогичной таковой для дофамина: на протяжении первых 60 минут после введения раклоприда наблюдалось достоверное повышение диализатной концентрации ДОФУК, сменявшееся затем постепенным снижением уровня содержания метаболита (Рис. 86).
Максимальное повышение внеклеточной концентрации ГВК наблюдалось к 120 минуте с момента введения раклоприда, составляя приблизительно 240% по отношению к базальным значениям (Рис. 8в). В дальнейшем уровень содержания метаболита возвращался к базальным значениям.
Полученные нами результаты согласуются с данными, опубликованными ранее [See et al., 1991; Gainetdinov et al., 19946], и подтверждают хорошо известное свойство антагонистов Д2-подтипа дофаминовых рецепторов оказывать выраженный стимулирующий эффект на процессы синтеза и метаболизма дофамина в структурах мозга животных [Moghaddam and Bunney, 1990; Waters et al., 1993; Gainetdinov et al., 19946].
В частности, подобное повышение тканевого содержания ДОФУК и ГВК, а также внеклеточного уровня дофамина и его метаболитов в диализатах мозга было продемонстрировано для селективного антагониста Д2-подтипа рецепторов, раклоприда [Magnusson et al., 1986; Ogren et al, 1986; See et al, 1991; Gainetdinov etal., 19946].
Данный эффект рассматривается как следствие функциональной блокады Д2-подтипа ауторецепторов, расположенных на дофамин-содержащих нейронах и регулирующих процессы нейрональной электрической активности, биосинтеза и высвобождения дофамина, и, в «нормальных» условиях, находящихся под ингибиторным контролем внеклеточного «пула» нейротрансмиттера [Roth, 1983; Santiago and Westerink, 1991; See et al., 1991; Waters et al., 1993].
Тогда как повышение уровня дофамина в диализатах животных отражает активирующий эффект раклоприда на процесс высвобождения нейротрансмиттера, увеличение содержания ДОФУК и ГВК, по-видимому, свидетельствует о стимуляции биосинтеза дофамина на фоне введения Д2-антагониста [Zetterstrom et al., 1988]. Соответственно этому, приблизительно одинаковое влияние раклоприда на повышение внеклеточной концентрации дофамина и его основных метаболитов предполагает эквиэффективность действия Д2-антагониста в отношении процессов биосинтеза и высвобождения нейротрансмиттера [Gainetdinov et al., 19946].
Таким образом, согласно представленным результатам, селективный Д2-антагонист раклоприд в дозе 1,2 мг/кг п/к, обеспечивающей эффективную блокаду дофаминовых рецепторов Д2-подтипа [Magnusson et al., 1986; Ogren et al., 1986], вызывает достоверное повышение внеклеточного уровня дофамина, ДОФУК и ГВК в дорзальном стриатуме крыс in vivo.
Эффекты раклоприда на изменение внеклеточного содержания дофамина, ДОФУК и ГВК, вызванное d-амфетамином
Системное введение раклоприда в указанной дозе оказывало достоверный потенциирующий эффект на уровень высвобождения внеклеточного дофамина, обусловленного введением d-амфетамина в дозе 5мг/кг (Рис. 9а). Максимальный эффект как при комбинированном действии раклоприда и d-амфетамина, так и в случае одного психостимулятора, наблюдался через 20 минут после введения d-амфетамина, составляя соответственно 1300% и 835% по отношению к исходному уровню.
На протяжении последующего часа в диализатах мозга крыс, получавших раклоприд и d-амфетамин, отмечалось выраженное снижение внеклеточного уровня дофамина, однако, абсолютные значения содержания нейротрансмиттера были значимо выше, по сравнению с таковыми у животных, получавших один d-амфетамин (Рис. 9а).
Влияние антагониста Д4-подтипа дофаминовых рецепторов клозапина на параметры дофаминергической нейропередачи в дорзальном стриатуме крыс линии Вистар
На фоне последовательного введения SCH23390 и d-амфетамина наблюдался «амфетаминоподобный» эффект снижения уровня ДОФУК в диализатах, что может рассматриваться, как следствие преимущественного влияния психостимулятора на активность МАО. Кривые динамики изменений уровня ДОФУК и ГВК на фоне SCH23390 и сиднокарба носят сложный характер. Тенденция к повышению внеклеточной концентрации ГВК при последовательном введении SCH23390 и сиднокарба позволяет предположить возможность суммации индивидуальных эффектов Д1-антагониста и психостимулятора.
Результаты, представленные в данном разделе работы позволяют заключить, что селективная блокада Д1-подтипа рецепторов оказывает позитивный модулирующий эффект на повышение внеклеточного уровня содержания дофамина, индуцированное действием d-амфетамина и сиднокарба.
Принимая во внимание отсутствие достоверного стимулирующего эффекта SCH23390 на внеклеточный уровень дофамина в данной работе, возможным объяснением наблюдавшегося аддитивного эффекта Д1-антагониста и психостимуляторов на уровень дофамина в опытных диализатах, могло бы являться участие иных путей внутриклеточного проведения сигнала.
Так, дофамин, высвобождающийся во внеклеточное пространство под действием d-амфетамина или сиднокарба, специфически взаимодействует с дофаминовыми рецепторами различных подтипов [Missale et al., 1998]. На фоне блокады SCH23390 Д1-«пути» внутриклеточной сигнализации, нейротрансмиттер способен вызывать в этих условиях активацию Д2-подтипа рецепторов. Дополнительный вклад в подобное, «Д2-опосредованное» повышение внеклеточного уровня дофамина, может вносить рассогласование «нормальной» деятельности Д1 и Д2 рецепторних подтипов, проявляющих в исходных условиях кооперативный [Walters et al., 1988; Waddington et al., 2001], а в других случаях инверсный характер [Daly and Waddington 1992; Eilam et al., 1992; Waddington et al., 1995].
Существование подобного механизма, тем не менее, кажется маловероятным, так как стимулирующий эффект Д2-подтипа рецепторов на накопление внеклеточного дофамина, обусловленное введением психостимуляторов, наблюдается исключительно на фоне селективной блокады данного рецепторного подсемейства Д2-антагонистами, но не в условиях его стимуляции [Sharp et al., 1986; Watanabe et al., 1989; Pehek, 1999; Schmitz et al., 2001].
Можно предположить, что аддитивное влияние SCH23390 и d-амфетамина или сиднокарба на повышение уровня содержания дофамина определяется сложными взаимодействиями на уровне внутриклеточных каскадов вторичных посредников, регуляции ферментативной активности, работы ионных каналов и т.п. [Sohnders et а!., 1997; Zahnister et al., 1998; Nicola et al., 2000]. В частности, известно, что введение d-амфетамина оказывает дозо-зависимый эффект на функциональную активность ключевых ферментов, регулирующих синтез дофамина - декарбоксилазы ароматических аминокислот и тирозингидроксилазы [Nielsen et al., 1983; Elverfbrs and Nissbrand, 1992; Cho and Segal, 1994]. Влияние SCH23390 на процесс биосинтеза дофамина в мозге также было показано [Masserano et al., 1996; Cho et al, 1997; Salvatore et al., 2000].
Еще одно объяснение позитивного модулирующего влияния SCH23390 на повышение внеклеточного уровня дофамина, вызванное введением двух психостимуляторов, подразумевает вовлечение рецепторов, принадлежащих к другим подсемействам. О возможной роли Д5- и 5-НТ2-рецепторных механизмов в действии SCH23390 на дофаминергическую нейропередачу уже говорилось выше (см. раздел 4.1.4.1). В данном случае, необходимо отметить, что инъекция d-амфетамина в дозе 5мг/кг (аналогичной той, что была использована в данной работе) вызывает достоверное повышение диализатной концентрации серотонина в стриатуме [Cho and Segal, 1994; Kuczenski et al., 1995]. Наличие серотонин зависимого компонента продемонстрировано также и для сиднокарба [Арушанян и Батурин, 1981]. Таким образом, мы не можем исключить возможное участие серотонинергической нейропередачи мозга в механизме взаимодействия эффектов SCH23390 и d-амфетамина или сиднокарба, при их последовательном введении.
Клозапин в дозе 10 мг/кг в/б вызывал градуальное увеличение уровня дофамина в опытных диализатах (Рис. 14а). К концу первого часа с момента введения Д4-антагониста внеклеточная концентрация нейротрансмиттера составляла 138+9%, достоверно отличаясь от контрольных значений. В течение последующих 60 минут уровень дофамина продолжал повышаться, достигая своего максимума (161+27% к 100 минуте с момента инъекции). После этого наблюдалось постепенное снижение содержания нейротрансмиттера до базального уровня (Рис. 14а).
