Содержание к диссертации
Введение
Глава I. «Полиморфизм гена рецептора гормона роста и эффективность рекомбинантных препаратов гормона роста при соматотропной недостаточности у детей»
Глава II. Материалы и методы исследования, собственные данные
2.1. Клинические и лабораторные методы исследования
2.2. Инструментальные методы исследования
2.3. Клиническая характеристика групп больных
2.4. Исследование гена GHR (делеция экзона 3)
Глава III. Эффективность терапии рекомбинантными препаратами гормона роста
3.1. Частота встречаемости различных аллелей гена GHR при ИДГР, МДГР, внутриутробной задержке роста, синдроме Шерешевского - Тернера
3.2. Эффективность терапии рекомбинантными препаратами гормона роста у пациентов с ИДГР
3.3. Эффективность терапии рекомбинантными препаратами гормона роста у пациентов с МДГА
3.4. Эффективность терапии рекомбинантными препаратами гормона роста у пациентов с внутриутробной задержкой роста
3.5. Эффективность терапии рекомбинантными препаратами гормона роста у пациентов с синдромом Шерешевского-Тернера
3.6. Влияние максимального выброса СТГ на стимуляционных пробах с клофелином и инсулином на эффективность терапии
3.7. Влияние базального уровня ИФР-1 на эффективность терапии
3.8. Влияние возраста начала терапии на эффективность терапии рекомбинантными препаратами гормона роста
3.9. Прогнозирование эффективности терапии рекомбинантными препаратами гормона роста у пациентов с патологией роста
Глава IV. Взаимосвязь эффективности терапии рекомбинантными препаратами гормона роста и делеционным полиморфизмом гена GHR
Глава V. Обсуяедение полученных результатов
Выводы
Практические рекомендации
Список использованной литературы
- «Полиморфизм гена рецептора гормона роста и эффективность рекомбинантных препаратов гормона роста при соматотропной недостаточности у детей»
- Инструментальные методы исследования
- Эффективность терапии рекомбинантными препаратами гормона роста у пациентов с ИДГР
- Взаимосвязь эффективности терапии рекомбинантными препаратами гормона роста и делеционным полиморфизмом гена GHR
Введение к работе
Актуальность исследования.
В настоящее время эффективность, безопасность и доступность рекомбинантных препаратов гормона роста позволяют осуществлять непрерывную заместительную терапию соматотропной недостаточности у детей и взрослых. Основной целью ростостимулирующей терапии в детском возрасте является достижение социально приемлемого роста и улучшение качества жизни пациентов. Пациенты с соматотропной недостаточностью по-разному реагируют на терапию гормоном роста. В ряде зарубежных работ (Binder G., Baur F., Schweizer R., 2005; Sandos C, Essioux L.,Teinturier C, 2004) оценивалось влияние различных факторов на индивидуальную вариабельность эффективности лечения рекомбинантными препаратами гормона роста детей с соматотропной недостаточностью (продолжительность лечения, SDS роста в начале лечения и т.д.). Но все эти факторы лишь частично объясняют индивидуальные отличия в эффективности терапии рекомбинантными препаратами гормона роста.
Различный ответ на лечение рекомбинантными препаратами гормона роста в значительной степени является следствием генетических особенностей пациента. Поэтому, проведение молекулярно-генетического исследования на сегодняшний день является необходимым компонентом комплексного обследования пациента.
Известно, что ростовой эффект на 1-2 году терапии наиболее высокий и отражает общий ростовой эффект. То есть, имея достаточно точный прогноз роста на раннем этапе терапии рекомбинантными препаратами гормона роста, лечащий врач мог бы своевременно принять решение относительно дальнейшей тактики - провести коррекцию дозы или отменить лечение. Влияние полиморфизма гена рецептора гормона роста на сегодняшний день остается неизученным. У человека данный ген представлен двумя изоформами:
полная форма GHRfl и аллельный ген GHR d3 с делецией экзона 3. Общая частота в различных популяциях GHRfl формы составляет 68-75%, GHR d3 аллельного гена - 25-32% (Alexander A., Jorde L., Frederico G., 2005). По предварительным данным зарубежных авторов (Binder G., Baur F., Schweizer R., 2005; Alexander A., Jorde L., Frederico G., 2005), пациенты - носители хотя бы одной аллели GHR d3 — имели статистически значимое увеличение скорости роста при лечении рекомбинантными препаратами гормона роста по сравнению с пациентами, которые являлись гомозиготами по полной форме гена GHRfl (12,3±2,6 и 10,6±2,3 см/год, соответственно). Таким образом, изучение генетических особенностей детей с соматотропной недостаточностью и другими формами низкорослости для прогнозирования эффективности лечения рекомбинантными препаратами гормона роста с целью улучшения показателей роста у конкретного пациента является актуальным. Цель работы.
Изучение взаимосвязи между делеционным полиморфизмом гена рецептора гормона роста (GHR) и эффективностью терапии рекомбинантными препаратами гормона роста у детей с различными формами низкорослости. Кроме того, предполагалось оценить влияние некоторых других факторов на эффективность данной терапии: максимального выброса СТГ на стимуляционных пробах, возраста начала терапии, исходного уровня SDS ИРФ-1.
Задачи исследования: В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
Определить частоту встречаемости различных аллелей гена рецептора гормона роста при соматотропной недостаточности, синдроме Шерешевского -Тернера, внутриутробной задержке роста у детей.
Оценить эффективность терапии рекомбинантными препаратами гормона роста у пациентов с различными аллелями гена рецептора гормона роста.
Сравнить эффективность лечения рекомбинантными препаратами гормона роста у детей при различных вариантах низкорослости.
Оценить влияние следующих факторов (максимального выброса СТГ на стимуляционных пробах, возраста начала терапии, исходного уровня SDS ИРФ-1) на эффективность терапии рекомбинантными препаратами гормона роста.
Научная новизна исследования.
Представленная работа позволит определить влияние полиморфизма гена рецептора гормона роста (GHR) на эффективность терапии рекомбинантными препаратами гормона роста, а также частоту аллельных вариантов гена GHR у детей российской популяции с различными вариантами низкорослости.
Практическая значимость.
Полученные в работе данные позволяют прогнозировать ростовой эффект у детей с различными вариантами низкорослости на фоне терапии рекомбинантными препаратами гормона роста, что позволит повысить ее эффективность и разработать режим дозирования препарата в зависимости от генотипических особенностей пациента.
Определение до начала терапии таких исходных показателей как максимальный выброс СТГ на фоне стимуляционных тестов, уровень ИРФ-1, SDS ИРФ-1, возраста начала терапии, а также показателей скорости роста (SDS скорости роста) через 6 мес лечения позволит прогнозировать реакцию пациента на терапию рекомбинантными препаратами гормона роста с последующей коррекцией терапии.
Апробация работы.
Результаты работы доложены на межотделенческой научной конференции ФГУ ЭНЦ Росмедтехнологий РАМН (Москва, май 2007), V Всероссийской научно -практической конференции «Задачи детской эндокринологии в реализации
национального проекта «Здоровье» (Москва, 2007), на ежегодной научной
конференции молодых ученых (Москва, 2007).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, трех глав
собственных данных, обсуждения полученных результатов, выводов,
практических рекомендаций и списка литературы.
Работа изложена на листах машинописного текста, иллюстративный
материал представлен 22 рисунками и 42 таблицами. Список литературы
включает 143 названия (11 работ отечественных и 132 зарубежных авторов).
«Полиморфизм гена рецептора гормона роста и эффективность рекомбинантных препаратов гормона роста при соматотропной недостаточности у детей»
Соматотропная недостаточность — заболевание, частота которого составляет примерно 1 случай на 4 000-10 000 новорожденных. Использование методов молекулярной генетики способствовало значительному расширению представлений об этиопатогенезе соматотропной недостаточности, выявлению молекулярных дефектов генов, в результате которых происходит нарушение синтеза, секреции или периферического действия гормона роста и ростовых факторов. На сегодняшний день известны мутации шести генов, которые приводят к функциональной недостаточности ГР, которая может быть уменьшена экзогенно вводимым соматотропином. Эти гены или прямо участвуют в развитии передней доли гипофиза, или принимают участие в регуляции и секреции ГР: ген гормона роста ( GH1), ген рецептора рилизинг-фактора гормона роста ( GHRHR), ген гипофизарного фактора транскрипции 1, Pitl, (POUIF1), ген предшественника Pit 1 ( PROP 7), ген гипофизарного Lim- белка ( LHX3), ген гомеобокс-фактора кармана Ратке ( HESX1) (1). Гены POUIF1, PROP 1, LHX3, HESX 1- гомеобокс - гены, кодирующие семью транскрипционных факторов, которые участвуют в органогенезе передней доли гипофиза и в контроле экспрессии из локуса гена гормона роста (GH1). Проведенные молекулярно-генетические исследования позволили сформулировать понятия клинической гетерогенности и молекулярного полиморфизма синдрома дефицита ГР (2). Это научное направление быстро развивается, расширяется клиническое использование ГР. Высокая эффективность и безопасность рекомбинантных форм ГР ( рГР) позволяют в течение многих лет проводить непрерывную заместительную терапию соматотропной недостаточности у детей и взрослых, добиваться уникального эффекта увеличения роста на 12-18 см в год и оказывать положительное влияние на функциональное состояние всех органов и систем. Во многих странах мира лечение рГР получают не только больные с соматотропной недостаточностью, но и пациенты с идиопатической низкорослостью, с синдромом Шерешевского-Тернера (СШТ), дети, родившиеся с малым ростом и/или весом, дети с конституциональной задержкой роста (КЗР), больные с хронической почечной недостаточностью (ХПН). Основным эффектом, ожидаемым от терапии ГР у детей с соматотропной недостаточностью, является стимуляция линейного роста. На начальном этапе лечения таких пациентов, как правило, отмечается выраженное ускорение темпов роста. Этот феномен характерен для первого года терапии, особенно для ее первых месяцев. Скорость роста в этот период не только выше, чем до лечения, но и значительно превышает возрастную норму. Однако уже к концу первого полугодия терапии рост замедляется, и на втором году его скорость в большинстве случаев снижается до возрастной нормы. Так, по результатам исследования, проведенного в ЭНЦ РАМН, скорость роста у детей с дефицитом ГР до лечения была равна в среднем 2,8±1,1 см/год; за первый год терапии она составила 14,2±2,5 см/год, причем максимальные темпы отмечались в течение первых 3 месяцев лечения (18,1±4,7 см/год), а затем происходит их снижение (3,4,5). 30 г Скорость роста (см/год) 10
Это, видимо, связано с постепенным насыщением рецепторов ГР, а также завершением пролиферации основного пула незрелых хондроцитов. Но даже на первом году пациенты с низкорослостью различной этиологии по-разному реагируют на терапию ГР. Здесь могут иметь значение несколько факторов. Это, в первую очередь, степень дефицита ГР. Препараты ГР наиболее эффективны у пациентов с максимально выраженной гормональной недостаточностью. У детей с выраженным дефицитом ГР даже минимальное повышение уровня ГР приводит к значительному увеличению скорости роста, тогда как при относительно сохранной секреции увеличение концентрации гормона сопровождается менее заметным ее изменением. К числу других факторов, связанных с эффектом терапии ГР, относятся возраст ребенка, SDS роста, SDS целевого роста, костный возраст. Кроме того, на эффективность лечения также влияют доза ГР, режим введения препарата, непрерывность терапии. Параллельно значительному ускорению роста в течение первого полугодия терапии у большинства детей определяется также и уменьшение количества подкожного жира, отмечается тенденция к снижению уровня холестерина и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в сыворотке. В течение первого года терапии меняются показатели костного метаболизма: отмечается увеличение уровня остеокальцина в сыворотке и минеральной плотности костей. К факторам, влияющим на эффективность терапии ГР5 относят также наличие спонтанного пубертата и сроки начала пубертата. Чем больше рост в начале пубертата ( или чем позже наступает половое развитие ), тем лучше конечный прогноз. В зарубежной литературе существуют различные определения «хорошего» и «плохого» ответа на терапию рГР. Soliman А.Т., Spagnoli А. и др. считают хорошим эффектом лечения рГР увеличение скорости роста на фоне терапии более 2,0-2,5 см/год по сравнению с предыдущим годом. Wetterau L., Cohen R. и др. определяют приемлемый рост как « увеличение скорости роста в 2-4 раза по сравнению с базальной» в течение первых двух лет лечения (1,2). Однако, эти оценки являются довольно условными. Изучая эффективность терапии рГР, клиницисты пришли к выводу, что ответ на лечение ГР зависит не только от перечисленных выше факторов, но и генетических особенностей пациента. Фармакогенетика гормона роста должна позволить нам связать полиморфизм гена рецептора гормона роста с индивидуальным ответом на терапию гормоном роста. Поэтому, проведение молекулярно-генетического исследования на сегодняшний день является необходимым компонентом комплексного обследования пациента. Эффект гормона роста реализуется через специфический рецептор, расположенный на мембранах клеток-мишеней. Показано наличие специфических рецепторов к СТГ на мембране гепатоцитов и лимфоцитов человека, в жировой ткани, яичках, желтом теле, скелетных мышцах, хрящевой ткани, мозге, легких, поджелудочной железе, кишечнике, сердце, почках и тимоцитах (3,5).
Ген рецептора гормона роста (GHR) человека служит примером сложной единицы транскрипции. Ген имеет протяженную 5 - регуляторную область, содержит множество 5 -нетранслируемых экзонов, которые в результате альтернативного сплайсинга присоединяются к белок кодирующим экзонам. Транскрипция гена определяется несколькими промоторами, которые находятся на большом расстоянии от кодирующей области гена. В настоящее время известна полная нуклеотидная последовательность гена GHR человека. GHR является членом суперсемейства рецепторов, содержащих один трансмембранный домен.
Ген рецептора гормона роста (GHR) с координатами 42423000-42723000 занимает примерно 300 т.п.н. на коротком плече 5-ой хромосомы (5р13.1-р12). GHR является представителем суперсемейства рецепторов GH/PRL/cytokine. Одна из особенностей структуры этого гена - большая протяженность и сложная организация его 5 -регуляторной области. Ген содержит альтернативные 5 -нетранслируемые экзоны (4), которые транскрибируются с нескольких промоторов, функционирующих в разных тканях и типах клеток и на разных стадиях развития организма. В ходе транскрипции и последующего сплайсинга премРНК образуются множественные формы мРНК, кодирующие полноразмерные мембранные рецепторы и укороченные с С-конца растворимые гормон-связывающие белки. Полноразмерная мембранная форма рецептора имеет длину 620 аминокислотных остатков. Он состоит из экстрацеллюлярного домена (экзоны 2-7), содержащего 245 аминокислотных остатков, одной трансмембранной области (экзон 8), содержащей 30 аминокислотных остатков, и внутрицеллюлярного домена (экзоны 9-10), содержашего345 аминокислотных остатков, отвечающего за внутриклеточное проведение сигнала.
Инструментальные методы исследования
Рентгенография кистей рук с лучезапястными суставами осуществлялась в отделе рентгенологии (д.м.н. Ремизов О.В.) ФГУ ЭНЦ Росмедтехнологий РАМН. Оценка степени дифференцировки скелета производилась по методу Greulich&Pyle.
Магнитно-резонансная томография головного мозга проводилась в отделении МР-томографиии (руководитель — проф. Воронцов А.В.) ФГУ ЭНЦ Росмедтехнологий РАМН на томографе фирмы "Siemens Magnetom Impact" (Erlanger, Germany) с напряженностью магнитного поля 1 Тесла. Для получения сагиттальных, фронтальных и аксиальных изображений применялись параметры TR/TF7FA=3 30/12/70 (импульсные последовательности «турбоспин-эхо», взвешенные по ТІ) и 5000.119.186 (импульсные последовательности «турбоспин-эхо», взвешенные по Т2). Толщина среза составляла 3 мм для сагиттальных и фронтальных изображений и 4 мм для аксиальных изображений. Исследование осуществлялось в положении лежа на спине, без предварительной подготовки, премедикации.
Все пациенты получали заместительную терапию рекомбинантными препаратами гормона роста: нордитропин нордилет (Ново Нордиск, Дания), генотропин (Пфайзер Хелс АБ, Швеция), сайзен (Сероно Фарма, Швейцария), растан (Фармстандарт, Россия), хуматроп (Ели Лили, США). Пациенты получали рекомбинантные препараты гормона роста в виде ежедневных подкожных инъекций, в вечернее время в следующих дозировках: 0,033 мг/кг - для пациентов с СТГ-дефицитом; 0,05 мг/кг - для пациентов с синдромом Шерешевского- Тернера; 0,067 мг/кг - при внутриутробной задержке роста.
Исследование гена d3-GHR проводилось в лаборатории молекулярной генетики человека отдела молекулярной биологии и генетики НИИФХМ Росздрава ( зав. лабораторией к.б.н. Генерозов Э.В.). Изучение делеционного полиморфизма d3-GHR осуществлялось с использованием метода ПЦР-амплификации с последующим разделением и анализом фрагментов в агарозном геле. Целью этого метода является увеличение числа копий (амплификация) участка ДНК, содержащего анализируемый SNP. Данный метод был разработан Кэрри Мюллисом в 1983 году и в настоящее время широко используется как для научных исследований, так и для диагностики в практическом здравоохранении. Основой метода является комплементарное достраивание ДНК матрицы in vitro с помощью фермента ДНК-полимеразы, т.е. осуществляется репликация ДНК. Упрошено, естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий: 1. денатурация ДНК 2. образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, працмеров, необходимых для инициации синтеза ДНК) 3. синтез новой цепи ДНК
Термостабильная ДНК-полимераза (Taq-полимераза) была выделена из термофильных бактерий Thermis Aquaticus. Оптимум ее работы находится в оьласти 70-72 С, это позволило сделать процесс репликации циклическим. В результате многократного повторения циклов синтеза, число копий специфического участка ДНК экспоненциально увеличивается. В результате из небольшого количества исследуемого материала можно получить достаточное количество материала ДНК для дальнейшей идентификации. Комплементарное достраивание специфического участка цепи,ДНК начинается с т.н. стартовых блоков. Для создания стартовых блоков в заданном участке ДНК используются две олигонуклеотидные затравки -праймеры (12-20 нуклеотидных пар). Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах фрагмента, прямой и обратной цепи соответственно. Праймеры подбираются таким образом, чтобы их температура гибридизации совпадала, а расстояние до точки полиморфизма было не менее 30 Ь.р. В результате, достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. Таким образом, метод ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой.
Генотипирование любого SNP представляет собой сложный, многоступенчатый процесс, включающий в себя ряд различных этапов: забор клинического материала, выделение ДНК из крови, амплификация, электрофорез, дефосфорилирование, минисеквенирование и масс-спектрометрию. Для выделения геномной ДНК из цельной крови был использован стандартный набор фирмы IsoGene. Следующим этапом генотипирования является проведение полимеразной цепной реакции (PCR), или амплификация необходимого участка ДНК. Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах: этап: денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95С в течение 30-40 секунд. 2 этап: присоединение праймеров (отжиг). Для каждого праймера существует своя температура отжига, значение которой располагается в интервале 50-65С. Обычно праймеры подбираются таким образом, чтобы их температуры отжига совпадали. Время отжига 20-30 секунд. 3 этап: достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5 - конца к З1- концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP), добавляемые в раствор. Синтез катализируется ферментом Taq -полимеразой и происходит при температуре 70-72С. Время протекания синтеза 20-40 секунд. Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла, в котором происходит образование искомого специфического участка ДНК (ампликона). Далее ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Накопление ампликонов в растворе происходит по формуле 2П, где п - число циклов амплификации. Амплификация проводилась в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур с точностью до градуса заданное число циклов амплификации.
Для визуализации и контроля результатов амплификации и окончательной диагностики делеции d3-GHR, хорошо различимой в геле использовался этап электрофореза. Электрофорез проводился на агарозном геле, содержащем 2% агарозы и бромистый этидий - вещество, связывающееся с молекулой ДНК и флуоресцирующее в УФ свете. Для анализа наличия/отсутствия делеции 3 экзона гена GHR были подобраны специфичные комлементарные праймеры. Прямой праймер G1 лежал в консервативном участке, не затронутом делециеи и не далеко от ее начала. Два обратных праймера были подобраны следующим образом: - G2 был комплементарен консервативной области, находящейся непосредственно после границ делеции. В норме расстояние между G1 и G2 составляет 3248 пар оснований, а при делеции 3 экзона области, комплементарные праймерам, сближаются и расстояние составляет 532 пары оснований. - G3 был комплементарен области, затрагиваемой делециеи. В норме расстояние между G1 и G3 составляло 935 пар оснований. В случае делеции, ПЦР с использованием данного праймера оказывалась невозможной. На рисунке 2.1. схематично представлено расположение праймеров относительно делеции (А) и фрагмент агарозного геля после электрофореза и визуализации в УФ.
Эффективность терапии рекомбинантными препаратами гормона роста у пациентов с ИДГР
В группу исследования были включены 41 пациент (31 мальчик и 10 девочек) с установленным диагнозом изолированный дефицит гормона роста в возрасте от 2,8 до 16,9 лет (11,63 ± 0,66). Возраст начала терапии в данной группе пациентов составил 9,30 ± 0,58 года. До лечения рГР у всех пациентов были измерены следующие показатели: рост и SDS роста, вес, ИМТ, скорость роста, SDS целевого роста, костный возраст, коэффициент «костный возраст/хронологический возраст», уровень ИРФ-1 и SDS ИРФ-1, уровень максимального выброса СТГ на стимуляционных пробах. Показатели SDS роста до начала терапии составляли -3,41 ±0,16 (от -6,13 до 1,60). Уровень ИРФ-1 в сыворотке крови до начала терапии рГР в общей группе пациентов варьировал от 5,2 до 254 нмоль/л, среднее значение SDS ИРФ-1 составило -2,75 ±0,17. Показатели костного возраста до начала терапии находились в пределах от 0,2 до 11,00 лет (6,0 ± 0,6 лет). Все пациенты ранее не получали лечение генноинженерными препаратами гормона роста. Лечение рекомбинантными препаратами гормона роста начато в стандартной дозе 0,033 мг/кг/сут в виде подкожных ежедневных инъекций. Для оценки эффективности терапии рекомбинантными препаратами гормона роста у пациентов оценивались следующие антропометрические показатели: SDS роста, Л SDS роста, скорость роста, SDS скорости роста через 6 месяцев, 1 год и 2 года после начала терапии. Все пациенты этой группы были разделены на 3 подгруппы в зависимости от наличия в их генотипе различных аллельных вариантов гена dS GHR. В группу 1.1. включены пациенты с полной аллельной формой,///)? (п=28); В группу 1.2. -пациенты с гетерозиготным вариантом dS/fl гена GHR (п=12); В группу 1.3. - пациенты с гомозиготной формой d3/d3 гена GHR(n=X). Пациенты этих подгрупп оказались сопоставимыми по антропометрическим показателям (SDS роста до лечения, скорость роста до терапии), возрасту начала терапии рГР, костному возрасту, отставанию костного возраста от хронологического. При сравнении ростовых показателей (SDS роста, скорости роста) через 6 месяцев после начала терапии в данных трех подгруппах статистически достоверных различий получено не было (р 0,05). Антропометрические показатели через 1 год после начала терапии рекомбинантными препаратами гормона роста были проанализированы у 39 пациентов (25 мальчиков и 14 девочек).
Анализируя показатели роста, SDS роста, A SDS роста, скорости роста, SDS скорости роста детей, можно заметить, что пациенты, с полной аллельной формой гена GHR выросли несколько больше (фактическая скорость роста 12,64 ± 0,96 см/год), чем пациенты с гетерозиготной аллельной формой (11,90 ± 1,12) и гомозиготной аллелью GHR (10,20 ± 0,90), однако различия оказались статистически недостоверными (р 0,05). Результаты сравнения и средние значения клинических показателей пациентов указанных подгрупп через 1 год после начала терапии рГР представлены в таблице 3.3. Аналогичные закономерности получены в этой группе пациентов через 2 года после начала терапии рГР. Всего было обследовано 36 пациентов (23 мальчика и 13 девочек). При анализе показателей роста за второй год терапии, можно заметить, что сохраняется прежняя тенденция: пациенты 1 подгруппы имели более высокие показатели SDS роста через 2 года после начала терапии (-1,81 ± 0,36), по сравнению с пациентами 2 и 3 подгрупп (-1,82 ± 0,35 и -2,02 ± 0,99 соответственно). Фактическая скорость роста за второй год терапии рГР пациентов с «диким» типом гена dS GHR была выше (8,58 ± 1,50 см/год), чем у детей, несущих гетерозиготную аллель гена GHR (1.11 ± 1,52 см/год) и гомозиготную аллель GHR (7,58 ± 1,10 см/год), однако эти различия также оказались статистически недостоверными (р 0,05). При сопоставлении показателей SDS скорости роста через 2 года терапии в различных подгруппах обнаружилось, что данный показатель у пациентов диким» типом гена d3 GHR оказался достоверно выше (3,53 ±1,26), чем в группе пациентов с гетерозиготной аллелью гена GHR (2,89±1,06) р 0,05. В таблице 3.4. представлены средние значения ростовых показателей пациентов с ИДГР на втором году терапии рГР. Динамика роста пациентов с ИДГР в зависимости от делеционного полиморфизма гена GHR Таким образом, анализируя антропометрические показатели пациентов с ИДГР на первом и втором году терапии рекомбинантными препаратами гормона роста можно сделать вывод, что динамика роста таких детей не зависит от делеционного полиморфизма гена GHR. Однако имеет место тенденция, что пациенты с полной формой гена d3 GHR росли несколько лучше, чем дети, которые имели гомозиготную и/или гетерозиготную аллельную форму гена GHR (рисунок 3.3.)
В данную группу включены 41 пациент (32 мальчика и 9 девочек) с установленным диагнозом: множественный дефицит гормонов аденогипофиза. Средний возраст пациентов данной группы на момент включения в исследование составил 12,29 ± 0,76 года (78% - мальчики и 22% - девочки). Возраст начала терапии в данной группе пациентов составил 9,50 ± 0,57 года. При рассмотрении группы пациентов с МДГА обращает на себя внимание, что в ней отсутствуют пациенты с пангипопитуитаризмом, а большинство пациентов (56,2%) наряду с дефицитом гормона роста имели проявления вторичного гипотиреоза, у 29,3% пациентов отмечено сочетание СТГ дефицита, вторичного гипотиреоза и вторичного гипокортицизма, 9,6% пациентов данной группы имели сочетание СТГ дефицита, вторичного гипотиреоза и вторичного гипогонадизма, у 4,9% пациентов СТГ дефицит сочетался с дефицитом АКТГ. Также как и у пациентов 1 группы, до начала терапии в данной группе пациентов были оценены следующие показатели: рост и SDS роста, вес, ИМТ, скорость роста, SDS целевого роста, костный возраст, коэффициент «костный возраст/хронологический возраст», уровень ИРФ-1 и SDS ИРФ-1, пик выброса СТГ на стимуляционных пробах.
Показатели SDS роста до начала терапии составляли -3,93 ±0,16 (от -6,27 до -1,89). Уровень ИРФ-1 в сыворотки крови до начала терапии рГР в общей группе пациентов варьировал от 4,3 до 164 нмоль/л, среднее значение SDS ИРФ-1 составило -3,40 ± 0,31 (от - 12,24 до - 1,28). Показатели костного возраста до начала терапии находились в пределах от 1,4 до 11,00 лет (5,76 ± 0,54 лет).
Все пациенты ранее не получали лечение генноинженерными препаратами гормона роста. Лечение рекомбинантными препаратами гормона роста начато в стандартной дозе 0,033 мг/кг/сут в виде подкожных ежедневных инъекций. Так же как и в случае с ИДГР все пациенты этой группы были разделены на 3 подгруппы в зависимости от наличия в их генотипе различных аллельных вариантов гена d3 GHR. При сравнении ростовых показателей (SDS роста, скорости роста) через 6 месяцев после начала терапии в данных трех подгруппах статистически достоверных различий получено не было (р 0,05). Средние значения антропометрических показателей и результаты их сравнения в разных подгруппах приведены в таблице 3.5.
Взаимосвязь эффективности терапии рекомбинантными препаратами гормона роста и делеционным полиморфизмом гена GHR
Известно, что эффективность терапии рекомбинантными препаратами гормона роста зависит от многих факторов (возраст, степень дефицита гормона роста, доза препарата, кратность инъекций и т.д.). В зарубежной научной литературе появились данные о том, что некоторые генетические особенности пациента, в частности, отсутствие/наличие экзона 3 в гене GHR оказывает влияние на эффективность лечения пациентов с различной патологией роста, в частности дефицитом гормона роста, синдромом Шерешевского - Тернера, внутриутробной задержкой роста у детей. Данное нарушение структуры гена GHR было расценено как полиморфизм гена рецептора гормона роста (GHR). Генетики расценивают полиморфизм как мутацию, имеющую устойчивую частоту в популяции, т.е. частота полиморфизма подчиняется закону Харди-Вайнберга.
С помощью метода ПЦР-амплификации с последующим разделением и анализом фрагментов в агарозном геле у всех пациентов данной группы изучен интересующий нас участок гена рецептора гормона роста, а именно наличие/отсутствие делеции 3 экзона гена GHR. Мы проанализировали эффективность терапии рГР у пациентов различных диагностических категорий в зависимости от делеционного полиморфизма гена GHR. Пациенты данных подгрупп были сопоставимы по возрасту начала терапии, полу, SDS роста до начала терапии, скорости роста до начала лечения, костному возрасту до терапии, SDS целевого роста и исходному показателю SDSMPtP-l.
Полученные результаты показали, что скорость роста пациентов с так называемым «диким» типом гена рецептора гормона роста (fl/fl) на 1-2 году терапии была несколько меньше, чем у пациентов с гетеро- и гомозиготной делецией экзона 3 гена GHR, но эта разница не была статистически достоверной (р 0,05). В абсолютных цифрах скорость роста за первый год терапии пациентов с полноразмерным геном составила 11,92 ± 0,68 см/год; с гетерозиготным аллельным вариантом - 10,59 ± 0,50 см/год; с гомозиготной формой гена GHR - 10,50 ± 0,66 см/год.
Показатели SDS роста через 1 год после начала терапии у пациентов с «диким» типом гена были несколько выше (-2,55 ± 0,18), чем у пациентов с гетерозиготным вариантом гена GHR ( - 2,40 ± 0,18) и пациентов с гомозиготным вариантом гена (-3,46 ± 0,59). Причем разница данных показателей у пациентов из 2 и 3 подгрупп оказалась статистически достоверной (р 0,05).
Такая же тенденция сохранялась и на втором году терапии. Показатели SDS роста пациентов 1 подгруппы через 2 года терапии (- 1,99 ± 0,21) статистически достоверно отличались от данного показателя в 3 подгруппе пациентов (р 0,05), который оказался значительно ниже и составил -3,53 ± 0,30. Фактическое значение скорости роста пациентов с полно формой гена на 2 -м году терапии составило 7,15 ± 0,62 см/год, в то время как пациенты с гетеро- и гомозиготной формами гена GHR выросли на 7.08 ± 0,52 и 5,43 ± 0,84 см/год соответственно (р 0,05), таблица 4.1. Таким образом, убедительных данных о влиянии делеционного полиморфизма гена GHR на эффективность терапии рекомбинантными препаратами гормона роста в общей группе пациентов не получено. В зависимости от диагностической категории все пациенты были разделены на 4 группы: 1-я группа (п=41): пациенты с изолированным дефицитом гормона роста (ИДГР); 2-я группа (п=41): пациенты с множественным дефицитом гормонов аденогипофиза; 3-я группа (п=28): пациенты с внутриутробной задержкой роста; 4-я группа (п=33): пациенты (девочки) с синдромом Шерешевского-Тернера. Аналогично общей группе пациентов, в каждой конкретной группе также были выделены пациенты с «диким» типом гена GHR (fl/fl, 1 подгруппа), пациенты с гетерозиготным вариантом гена (d3/fl, 2 подгруппа), пациенты с гомозиготным вариантом (d3/d3, 3 подгруппа). В таблице 4.2. представлена сравнительная характеристика эффективнсоти терапии рГР в каждой подгруппе пациентов.
В каждой из представленных групп отмечается следующая тенденция: пациенты, у которых отсутствует экзон 3 в обеих аллелях гена GHR (3 подгруппа), росли несколько хуже, чем дети, которые являлись гетерозиготными по данному аллельному варианту (2 подгруппа) и пациенты с нормальным геном GHR (1 подгруппа), р 0,05.
При сравнении динамики роста пациентов с полной формой гена GHR и различным диагностическими категориями (1 подгруппа) выяснилось, что скорость роста пациентов с ИДГР значительно выше, чем у пациентов с внутриутробной задержкой роста (р 0,001) на 1 году терапии рГР и у пациентов с синдромом Шерешевского -Тернера (р 0,05) и эта разница оказалась высоко достоверной. Пациенты с МДГА из 1 подгруппы также имели значительно лучшую динамику роста, чем пациенты 1 подгруппы с внутриутробной задержкой роста (р 0,05) и синдромом Шерешевского -Тернера (р 0,05). Абсолютная скорость роста пациентов полной формой гена GHR на первом году терапии составляет: в когорте пациентов с ИДГР - 12,64 ± 0,96 см/год; МДГР - 12,63 ±1,01 см/год; SGA - 6,95 ± 0,67 см/год; СШТ - 8,12 ± 0,66 см/год. Динамика роста пациентов с ИДГР и МДГА практически не отличалась друг от друга, рисунок 4.1.
![Состояние и модификация клеточной [В]-адренорецепции и роль полиморфизма генов [В]-адренорецепторов в терапии АГ и хронической сердечной недостаточности](/i/i/4264/405081.png "Состояние и модификация клеточной [В]-адренорецепции и роль полиморфизма генов [В]-адренорецепторов в терапии АГ и хронической сердечной недостаточности Манешина Ольга Александровна")
![Полиморфизм G1846A гена GYP2D6 и фармакологический ответ на [в]1 -адреноблокаторы](/i/i/4345/360495.png "Полиморфизм G1846A гена GYP2D6 и фармакологический ответ на [в]1 -адреноблокаторы Казаков Руслан Евгеньевич")
