Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы
1. Стресс, тревога и роль индивидуальной чувствительности для реализации антистрессорного действия препаратов.
2. Характеристика мозгоспецифического белка S100 и антител к белку S-100.
1. Экспериментальные исследования.
2 Изучение антистрессорного действия тенотена и диазепама в зависимости от типа индивидуальной реакции животных на стресс. Методы и материалы
1. Метод разделения животных на разные типы индивидуального реагирования на стрессорную ситуацию.
1.1. Оценка типа индивидуального эмоционального реагирования на стрессорную ситуацию и разделение животных на высоко- и низкоактивных по методике Nomura.
1.2. Оценка типа индивидуального эмоционального реагирования' на стрессорную ситуацию и разделение животных на высоко- и низкоактивных на освещенной малой площадке по методике Broudy, Nauta.
2. Методика оценки эмоционального стресса у высоко- и низкоактивных животных на модели конфликтной ситуации.
3. Методика оценки эмоционального стресса у высоко- и низкоактивных животных на модели приподнятого крестообразного лабиринта.
4. Методика оценки эмоционального стресса у высоко- и низкоактивных животных в тесте открытого поля.
5. Методика стресса ожидания боли на модели условного эмоционального рефлекса («условный страх»).
5.1. Методика оценки спонтанной эмоциональной реакции в условиях стресса ожидания боли у высоко- и низкоактивных животных.
5.2. Методика оценки эмоциональной реакции в условиях стресса ожидания боли при дополнительной провокации у высоко- и низкоактивных животных.
6. Методика оценки нарушения координации движений
7. Животные; вещества, способ их введения и дозы.
8. Методы статистической обработки результатов.
3 Результаты экспериментального исследования
1. Разделение крыс на различные типы индивидуального реагирования на стрессорную ситуацию.
1.1. Оценка типа эмоционального реагирования на стрессорную ситуацию и разделение животных на высоко- и низкоактивных по методике Nomura.
1.2. Оценка индивидуальной эмоциональной реакции на стресс высоко- и низкоактивных животных (разделенных по методу Nomura) в тесте освещенной малой площадки по методике Broudy, Nauta.
1.3. Оценка индивидуальной эмоциональной реакции на стресс высоко- и низкоактивных животных (разделенных по методу Nomura) в тесте освещенной малой площадки при использовании провоцирующих тест стимулов.
2. Изучение действия тенотена и диазепама на эмоциональную реакцию на стресс высоко- и низкоактивных животных по методике Broudy, Nauta.
3. Изучение действия тенотена и диазепама на проявления эмоционального стресса у высоко- и низкоактивных животных на модели конфликтной ситуации.
4. Изучение действия тенотена и диазепама на проявления эмоционального стресса у высоко- и низкоактивных животных на модели приподнятого крестообразного лабиринта.
5. Изучение действия тенотена и диазепама на проявления эмоционального стресса у высоко- и низкоактивных животных в тесте открытого поля.
6. Изучение действия тенотена и диазепама на стресс ожидания боли у высоко- и низкоактивных животных на модели условного эмоционального рефлекса («условный страх»).
6.1. Изучение влияния тенотена и диазепама на спонтанную эмоциональную реакцию в условиях стресса ожидания боли.
6.2. Изучение влияния тенотена и диазепама на эмоциональную реакцию в условиях стресса ожидания боли при дополнительной аверсивной провокации.
7. Изучение миорелаксатного действия тенотена и диазепама у высоко- и низкоактивных крыс.
8. Изучение антистрессорного действия тенотена в сравнении с диазепамом у пациентов с разным типом эмоциональной реакции на стресс на поликлиническом стоматологическом приеме.
8.1. Методы и материалы клинического исследования.
8.2. Результаты клинического исследования.
Заключение. Обсуждение результатов.
Выводы.
- Характеристика мозгоспецифического белка S100 и антител к белку S-100.
- Методика оценки эмоционального стресса у высоко- и низкоактивных животных на модели приподнятого крестообразного лабиринта.
- Оценка индивидуальной эмоциональной реакции на стресс высоко- и низкоактивных животных (разделенных по методу Nomura) в тесте освещенной малой площадки при использовании провоцирующих тест стимулов.
- Изучение влияния тенотена и диазепама на эмоциональную реакцию в условиях стресса ожидания боли при дополнительной аверсивной провокации.
Введение к работе
Приоритетным достижением отечественной науки является установление зависимости эффекта психотропных веществ от наследственно контролируемого типа ответа на эмоционально-стрессовую реакцию (Середенин СБ. и соавт., 1982, 1998, 2001; Середенин С.Б.,2004). Установлена связь наследственно детерминированного типа эмоционально-стрессовой реакции с качественным эффектом бензодиазепиновых транквилизаторов (диазепама, феназепама и гидазепама) и анксиолитиков нового типа (афобазол, ладастен).
В последние годы при поиске новых нейропсихотропных препаратов внимание исследователей привлекают нейропептиды и мозгоспецифические белки. Среди них существенный интерес представляет семейство мозгоспецифических белков S-100, которые являются важнейшими регуляторами интегративной деятельности мозга, принимая участие в реализации фундаментальных базовых функций нейронных систем, таких как генерация и проведение нервного импульса, синаптическая передача (Штарк М.Б., 1985; Donato, 2001; Heizmann et al., 2002) и определяют иммунные функции ЦНС (Adami et al., 2001; Rothermundt et al., 2003). В ряде экспериментов показана стресс-протекторная роль белка S100B в условиях острого повреждающего воздействия.
В настоящее время не существует низкомолекулярных лигандов, с помощью которых можно было бы регулировать активность белка S100. Однако воздействие на функции белка S100 возможно осуществить с помощью поликлональных антител к белку S100, которые способны блокировать индукцию длительной потенциации (ДПТП) в срезах гиппокампа и изменять мембранотропные эффекты (Lewis, Teyler, 1986; Эпштейн О.И. и соавт. 1999а; Мотин В.Г. и соавт., 2002; Rebaudo et al., 2000). Принципиально новым направлением регуляторного воздействия на белок S100 является использование антител к белку S100 в сверхмалых дозах (Эпштейн О.И.,1999; 2002; 2003).
Установлено, что антитела к мозгоспецифическому белку S-100 в сверхмалых дозах оказывают модифицирующее влияние на подавляющий эффект нативной антисыворотки к белку S-100, вызывая отмену ее блокирующего действия на развитие ДПТП и восстанавливают нарушенную индукцию ДПТП. (Эпштейн О.И. и соавт. 1999; Штарк М.Б. и соавт.,2000). Основываясь на этой идеологии был создан препарат пропротен (НПФ «Материа Медика Холдинг»), который представляет собой аффинно очищенные антитела к мозгоспецифическому белку S-100 в сверхмалых дозах (разведение С1000). В настоящее время пропротен широко применяется в медицинской практике в качестве средства лечения алкогольного абстинентного синдрома и алкогольной мотивации. (Бохан НА и соавт.,2003; Гофман А.Г., и соавт.1997, 2003; Крылов Е.Н.,2003).
В развитие этого направления исследований в НПФ «Материа Медика Холдинг» разработан препарат тенотен, который представляет собой аффинно очищенные антитела к мозгоспецифическому белку S-100 в сверхмалых дозах в разведении С12, СЗО, С200. В экспериментальных исследованиях получены данные о том, что тенотен обладает выраженным стресспротективным, анксиолитическим действием у животных в тесте конфликтной ситуации и по эффективности превосходит пропротен (Хейфиц И.А. и соавт., 2006).
В связи с вышеизложенным, представлялось целесообразным исследовать особенности антистрессорного действия тенотена в сравнении с диазепамом в зависимости от типа индивидуальной реакции животных на стресс, а также изучить особенности антистрессорного эффекта тенотена и диазепама у пациентов с различным типом реагирования на стресс при их применении в качестве средств премедикации на амбулаторном стоматологическом приеме.
Цели и задачи исследования.
Целью исследования явилось изучение особенностей антистрессорного действия тенотена и диазепама в зависимости от типа индивидуальной реакции на стресс у животных в эксперименте и у пациентов на амбулаторном стоматологическом приеме.
Задачи исследования.
1. Изучить особенности антистрессорного действия тенотена и диазепама у высоко- и низкоактивных животных по шкале Broudy, Nauta.
2. Изучить эффекты тенотена и диазепама у высоко- и низкоактивных животных в условиях наказуемого поведения в конфликтной ситуации.
3. Изучить действие тенотена и диазепама на моторные и сомато- вегетативные проявления стресса у высоко- и низкоактивных животных в условиях приподнятого крестообразного лабиринта.
Изучить действие тенотена и диазепама на проявления эмоционального стресса у высоко- и низкоактивных животных в тесте открытого поля.
Изучить действие тенотена и диазепама на стресс ожидания боли у высоко-и низкоактивных животных с оценкой моторных и сомато-вегетативных проявлений стресса.
Изучить особенности антистрессорного действия тенотена в сравнении с диазепамом у пациентов с разным типом эмоциональной реакции на стресс на поликлиническом стоматологическом приеме.
Научная новизна
Показано, что белые нелинейные крысы, разделенные по типу индивидуальной реакции на эмоциональный стресс на высоко- и низкоактивных (пассивных) в тесте вынужденного плавания по Nomura, сохраняют тип поведенческого ответа и в других стрессорных ситуациях: конфликтной ситуации, приподнятого крестообразного лабиринта, тесте Broudy, Nauta, открытого поля. Вместе с тем, высоко- и низкоактивные крысы достоверно не отличаются по выраженности вегетативных реакций на стресс.
Установлено, что антистрессорный эффект тенотена (2,5 мл/кг) и диазепама (1,5 мг/кг) в тестах Broudy, Nauta, конфликтной ситуации, приподнятого крестообразного лабиринта, открытого поля, стресса ожидания боли зависит от типа индивидуальной реакции животного на стресс. Тенотен и диазепам нормализуют поведение высокоактивных крыс, в тесте Broudy, Nauta, уменьшая их активность, однако у низкоактивных животных тенотен активирует поведение, тогда как диазепам не обладает достоверным эффектом. Тенотен обладает выраженным антистрессорным эффектом у высокоактивных и, особенно, у низкоактивных крыс при стрессе ожидания боли, в условиях конфликтной ситуации и приподнятого крестообразного лабиринта, тогда как диазепам, наоборот, более эффективен у высокоактивных животных. Оба препарата уменьшают сомато-вегетативные проявления стресса ожидания боли как у пассивных, так и у активных крыс.
На стоматологическом поликлиническом приеме тенотен, также как диазепам (седуксен) и феназепам, устраняет тревогу, улучшает самочувствие и настроение у больных с низким, умеренным и высоким уровнем ситуационной тревожности. Тенотен не вызывает изменения артериального давления, но уменьшает частоту сердечных сокращений. Не уступая диазепаму и феназепаму по антистрессорной активности, тенотен не вызывает свойственных им побочных эффектов. Тенотен обладает значительно большей эффективностью, чем диазепам в устранении проявлений беспокойства, тревоги и страха у пациентов с заторможенной реакцией на стресс и имеет сходную активность с диазепамом в устранении тревоги у пациентов с активной реакцией.
Научно-практическая ценность.
Установлено, что тенотен обладает выраженным 1 анксиолитическим, антистрессорным действием и имеет преимущества перед известными препаратами - диазепамом и феназепамом. На стоматологическом поликлиническом приеме показано, что тенотен (4 таблетки) оказывает выраженное анксиолитическое действие у больных, испытывающих тревогу и страх перед лечением, не уступает по эффективности седуксену (5 мг) и феназепаму (1 мг) и не имеет побочных эффектов. Уровень ситуационной тревожности под влиянием тенотена нормализуется в среднем у 80-90% пациентов.
Полученные данные обосновывают целесообразность использования тенотена в качестве эффективного и безопасного средства премедикации пациентов на амбулаторном стоматологическом приеме у лиц с высокой, средней и низкой степенью напряжения, тревоги и страха у пациентов с пассивной и с активной индивидуальной реакцией на стресс.
Основные положения, выносимые на защиту.
Тенотен обладает выраженным антистрессорным, анксиолитическим эффектом и имеет преимущества перед известными анксиолитическими средствами диазепамом и феназепамом, которые заключаются в отсутствии побочных эффектов, свойственных для этих препаратов.
Антистрессорный эффект тенотенаи диазепама в тестах Broudy, Nauta, конфликтной ситуации, приподнятого крестообразного лабиринта, открытого поля, стресса ожидания боли зависит от типа индивидуальной реакции животного на стресс. В противоположность диазепаму тенотен оказывает активирующее действие у животных с пассивной, заторможенной реакцией на стресс и нормализующее действие у высокоактивных животных.
Тенотен обладает выраженным антистрессорным действием у больных, испытывающих тревогу и страх перед лечением на стоматологическом поликлиническом приеме, и не уступает по эффективности диазепаму и феназепаму. При этом, эффект тенотена наблюдается как у пациентов с заторможенной, так и с активной индивидуальной реакцией на стресс.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на: международном конгрессе «Прогресс в нейронауках для медицины и психологии» Крым, Судак, 2004 и 2005 г. и Международном междисциплинарном семинаре "Прогресс в биотехнологии и нейробиологии - интегративная медицина. Хургада, Египет, 2004 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы: 2 статьи в научных журналах и 2 тезисов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, собственных экспериментальных исследований, изложенных в 2-х главах, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего работу.
Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 18 рисунками.
Характеристика мозгоспецифического белка S100 и антител к белку S-100.
Фундаментальными базовыми функциями нейронных систем являются генерация нервного импульса, его проведение и синаптическая передача. Интегративная деятельность мозга регулируется белками S100, принимающими участие в реализации базовых функций. Длительная посттетаническая потенциация гиппокампа (ДПТП) обеспечивается, наряду с другими кальций регуляторными системами, белками S100, относящимися к кальций связывающей группе (Штарк М.Б., 1985; Barraclough, 1998). Семейство белков S100 - низкомолекулярные кислые кальций-, цинк-и медь-связывающие белки, содержащие в своей структуре кальций-связывающие домены (Heizmann et al., 2002). Белок S100 в ЦНС представлен преимущественно димером (S100B), состоящим из двух S100-beta субъединиц. Экспрессирование и секретирование димера S100B осуществляется в основном астроцитами и клетками микроглии. S100B внутри клетки подвергается транслокации между различными органеллами и секретируется, оказывая цитокиноподобное аутокринное и паракринное действие на глию, нейроны и микроглию (Heizmann et al., 2002). Белок S100B - показано в экспериментах in vitro - связывается с большим количеством белковых лигандов в разных клеточных структурах (с ферментами, транскрипционными факторами, белками цитоскелета), и регулирует их функциональную активность (Donato, 2001; Heizmann et al., 2002). Участвуя в модулировании пролиферации и дифференцировке нейронов и глии, в регуляции энергетического метаболизма клеток ЦНС, в трансдукции сигнала, S100B определяет некоторые иммунологические функции ЦНС (Adami et al., 2001; Rothermundt et al., 2003). Нейропротективный (в наномолярных концентрациях), нейродегенеративный или проапоптотический эффект могут быть инспиророваны секретируемым белком S100B (в микромолярных концентрациях) (Rothermundt et al., 2003). Развитие целого ряда заболеваний, таких как рак, кардиомиопатия и нейродегенеративные расстройства (Heizmann et al., 2002), связано с семейством S100 белков. При метастазах рака, гипоксических и травматических поражениях мозга, болезни Альцгеймера и синдроме Дауна, остром инфаркте миокарда, эпилепсии и ряде других заболеваний используются в качестве диагностических маркеров S100B белок и специфические антитела (Kiewitz et al.,2000; Rommer et al.,2000; Sheng et al.,2000;Yu, Fraser, 2001).
Чувствительным маркером травматического и гипоксического повреждения ткани мозга является содержание белка S100B в сыворотке и ликворе. Его уровень в сыворотке хорошо коррелирует с размером очага и прогнозом при ишемическом инсульте. Появление этого белка в сыворотке, как утверждают авторы, связано с нарушением гематоэнцефалического барьера при повреждении ткани мозга. Регуляция энергетического обмена и клеточного цикла нейронов и глии происходит через стимуляцию активности ряда ферментов белком S100B (Donato, 2001). Сопрягая повышение внутриклеточной концентрации кальция с состоянием фосфорилирования белков, с которыми он взаимодействует (т.е. «переносит сигнал» от вторичного мессенджера - кальция), внутриклеточный белок S100B принимает участие в трансдукции сигнала. Особенный интерес для патогенеза тревожных и депрессивных состояний, алкоголизма, инсульта и нейродегенеративных заболеваний представляют функции и эффекты внеклеточного (секретируемого) белка S100B. Нейрональная пластичность - способность нейронов к изменению обмена нейромедиаторов, экспрессии и чувствительности рецепторов, образованию синаптических контактов, регенерации отростков и другим адаптивным перестройкам - является универсальным механизмом адаптации в ЦНС (Manji, Duman, 2001; Stiles, 2000; Силькис И.Г., 2000). Модель синаптической потенциации является наиболее достоверной для исследования важнейших процессов нейрональной пластичности - обучения и памяти. Постсинаптическое повышение внутриклеточной концентрации кальция через активацию NMDA рецепторов является одним из результатов индукции длительной посттетанической потенциации (ДПТП) в большинстве структур мозга (в т.ч. в гиппокампе). В результате фосфорилирования / дефосфорилирования глутаматных рецепторов NMDA и АМРА происходит стимуляция ДПТП/ДПТД (длительной посттетанической депрессии), тогда как фосфорилирование / дефосфорилирование ГАМК рецепторов фосфорилирование рецепторов осуществляется при участии протеинкиназы G (цАМФ-зависимый процесс), протеинкиназы С и кальмодулина (кальций-зависимые процессы) - определяет подавление ДПТП/ ДПТД (Rebando et al., 2000; Силькис И.Г., 2000). Белок S100B является важнейшим модулятором ДПТП, о чем свидетельствует, в частности, способность антител к белку блокировать индукцию ДПТП (Lewis, Teyler, 1986; Эпштейн и соавт., 1999а; Мотин В.Г. и соавт., 2002). При избыточной экспрессии S100B нарушается кратковременная память, нейрофизиологическим аналогом которой и является ДПТП.
Белок S100 (а также антитела к S100) непосредственно взаимодействует с ГАМКд-бензодиазепиновым хлор-ионофорным рецепторным комплексом (в частности, за счет ко-локализации в нейроне - преимущественно с хлорным каналом этого комплекса, стимулируя вход хлора в клетку. Это позволяет оказывать ГАМК-миметическое действие как самому белку S100, так и модуляторам его функциональной активности (в частности, антителам). Белок S100 модулирует внутриклеточный кальциевый гомеостаз (как в нейронах, так и в глии) через повышение специфической проводимости мембраны и высвобождения кальция из внутриклеточных депо. Он оказывает регуляторное действие на активность кальций-зависимых белков и ферментов (в частности, кальмодулина, протеинкиназы С, кальпаина и др.) (Donato, 2001). В свою очередь, выброс кальция из внутриклеточных депо играет важную роль в управлении как «быстрыми» процессами пространственно-временной организации передачи сигнала и синаптической пластичности, так и «медленными» процессами роста отростков, структурной синаптической пластичности, апоптоза и регенерации нейронов и глии. Модулирующая роль белка S100 при ишемическом повреждении ЦНС показана на модели NMDA-зависимой эксайтотоксичности. После преходящей гипоксии в срезе мозга развивается глутамат-зависимая аноксическая синаптическая потенциация (аноксическая потенциация, АП). Индукция АП обусловлена входом в клетку ионов кальция вследствие активации NMDA-рецепторов. АП и ДПТП имеют общий клеточный механизм, связанный с избыточным выделением глутамата, постсинаптическим NMDA-зависимым ответом, который определяется кальций-зависимыми процессами. Развитие аноксической потенциации (так же, как и ДПТП) блокирует антисыворотка к белку S100. В ряде экспериментов подтверждена стресс-протекторная роль белка S100B в условиях острого повреждающего воздействия. Так, in vitro S100B препятствует гибели нейронов гиппокампа и нарушению функции митохондрий в условиях дефицита глюкозы. In vitro в концентрации 1-10 нг/мл S100B защищает культивируемые нейроны от глутаматного повреждения. Учитывая ключевую роль, которую играет в патогенезе стресса и тревоги дефицит серотонинергической передачи, следует отметить, что белок S100, вырабатываемый астроцитами, служит нейротрофическим фактором для серотонинергических нейронов, способствует их регенерации и защищает от токсического действия этанола.
Методика оценки эмоционального стресса у высоко- и низкоактивных животных на модели приподнятого крестообразного лабиринта.
Для оценки уровня тревожности крыс был использован приподнятый крестообразный лабиринт (Pellow и соавт., 1985). Лабиринт представляет собой перекрещенные полоски (рукава) размером 50x10 см. два противоположных отсека имеют вертикальные стенки высотой 40 см (темные рукава), а два других открыты и стенок не имеют (светлые открытые рукава). Лабиринт приподнят от пола на 50 см. В месте перекрестка плоскостей находится центральная платформа 10x10 см. Крыс помещали на центральную площадку хвостом к открытому светлому рукаву. Регистрировалось время, проведенное животными в открытых светлых рукавах, число заходов в светлые и темные рукава. Общее время наблюдения для каждого животного составляло 5 мин. В качестве критерия анксиолитического или анксиогенного эффекта использовали показатели: число выходов в открытые, опасные рукава, время проведенное в открытых рукавах число свешиваний с открытых рукавов. Животным за 40 минут до помещения в приподнятый крестообразный лабиринт вводили тенотен или диазепам. 4. Методика оценки эмоционального стресса у высоко- и низкоактивных животных в тесте открытого поля. Методика освещенного открытого поля представляет собой квадратный ящик размером 1x1x1 метр с прозрачной крышкой. Пол камеры равномерно разделен линиями на 9 квадратов с 16 отверстиями диаметром 2,5 см. Предварительно крыс перед экспериментом в течение 3-х минут выдерживают в темноте, после чего помещают на один из периферийных квадратов открытого поля. Наблюдение за животным производится в течение 3-х минут, как правило, с поминутной регистрацией. Регистрировали: - число пересеченных квадратов на периферии - - число пересеченных квадратов в центре, - число вертикальных стоек, - число заглядываний в отверстия, - количество выходов в центр квадрата. Животным за 40 минут до помещения в открытое поле вводили тенотен или диазепам. 5. Методика стресса ожидания боли на основе условного эмоционального рефлекса («условный страх»). Исследовали действие тенотена в сравнении с диазепамом при стрессе ожидания боли, основанном на условном эмоциональном рефлексе с регистрацией как спонтанного поведения в стрессорной ситуации, так и эмоциональной реакции при усилении стресса дополнительным раздражителем.
Для создания условного эмоционального рефлекса (стресса ожидания боли) использовали прием повторного помещения животного в камеру, где оно ранее получало болевое раздражение. Исследования проводились в соответствии с традиционной методикой условного эмоционального рефлекса (Воронина, Середенин, 2005; Lang etal.,2000; Oliver etal.,1991). Условный эмоциональный рефлекс вызывали повторным помещением животного в запомнившуюся им аверсивную ситуацию, где они ранее получали болевое раздражение через лапы. 5.1. Методика оценки спонтанной эмоциональной реакции в условиях стресса ожидания боли у высоко- и низкоактивных животных. В опыте было использовано 120 животных. Эксперимент проводили следующим образом. На первом этапе крысу помещали в экспериментальную установку "Lafayette Instrument Со" (США) и после ознакомительного нахождения в ней животному наносили неизбегаемое электроболевое раздражение через электродный пол. После получения болевого раздражения крыса извлекалась из камеры и помещалась в обычную клетку. После прекращения действия болевого раздражителя в условиях экспериментальной камеры у животных развиваются выраженные эмоциональные нарушения поведения, которые оценивались в альтернативной форме по изменению двигательных показателей. Крысы не осуществлявшие перемещений по камере регистрировались как крысы заторможенные, с реакцией замирания ("фризинга"); животные с активной реакцией, предпринимающие попытки выбраться из экспериментальной камеры, оценивались как крысы активные. Кроме того, выделяли животных, у которых реакция не отличалась от ориентировочно-исследовательского поведения при первом помещении крысы в камеру. Через 24 часа осуществляли второй этап опыта. Каждая группа с индивидуальным реагированием на ситуацию (активные, фризинговые, спокойные) была разделена на подгруппы, которым вводились вещества. После введения веществ крысы повторно помещались в «опасную» камеру, где они ранее получали болевое раздражение. Крыса, находясь в опасной камере, не получала на этом этапе опыта болевого раздражения, но, несмотря на это, испытывала стресс ожидания боли, поскольку помнила о болевом раздражении, полученном здесь ранее. У животных развивались выраженные эмоциональные нарушения поведения в условиях экспериментальной камеры, хотя действие болевого раздражителя отсутствовало. Эмоциональная реакция крыс имела качественные различия: животные реагировали на нее активным или пассивным поведением. Крысам контрольной группы вводили воду из расчёта 2,5 мл/кг. Животным опытных групп вводили тенотен в дозе 2,5 мл/кг или диазепам в дозе 1 мг/кг. Все вещества вводили интрагастрально специальным зондом за 40 минут до эксперимента - повторного помещения животных в опасную камеру. Фиксировали число заторможенных животных с реакцией замирания ("фризинга"), число активных животных, с активным двигательным поведением, предпринимающих попытки выбраться из экспериментальной камеры и число животных с обычным ориентировочно-исследовательским поведением. 5.2. Методика оценки эмоциональной реакции в условиях стресса ожидания боли при дополнительной провокации у высоко- и низкоактивных животных. Для усиления действия стрессорной обстановки, через 4 минуты после нахождения крысы в камере, осуществляли «провокацию» - подносили к голове крысы карандаш.
После этого дополнительного стрессорного воздействия также определяли тип эмоционального реагирования (пассивный, активный, спокойный), реакцию на провокацию - фризинговую (оборонительную) или агрессивную и регистрировали писк, учащенное дыхание, дефекацию и уринацию. Регистрацию всех этих показателей осуществляли в течение 1 минуты. В каждой группе было по 20 животных. Крысам контрольной группы вводили внутрь воду из расчёта 0,2 мл/100 г массы. Животным опытных групп вводили тенотен или диазепам внутрь. Регистрацию эффектов осуществляли через 60 минут после введения препаратов. Фиксировали число заторможенных животных с реакцией замирания ("фризинга"), число активных животных, с активным двигательным поведением, предпринимающих попытки выбраться из экспериментальной камеры и число животных с обычным ориентировочно-исследовательским поведением. 6. Методика оценки нарушения координации движений Для оценки возможного нейротоксического действия препаратов, проявляющегося в миорелаксации и нарушении координации движений, исследовалось поведение животных на специальном вращающемся стержне, расположенном на высоте и вращающемся со скоростью 10 оборотов в минуту (Rota-rod test) (Воронина, Середенин, 2005). Крысам контрольной группы вводили внутрь воду из расчёта 0,2 мл/100 г массы. Животным опытных групп вводили тенотен или диазепам внутрь. Вычислялся процент животных с неврологическим дефицитом (нарушениями координации движений). 7. Животные; вещества, способ их введения. Исследование проводили на белых нелинейных крысах самцах массой 250-280 г. из питомника «Столбовая» Московской области. Животные содержались в условиях вивария при свободном доступе к воде и брикетированному корму при стандартном освещении, при комнатной температуре окружающей среды. Каждая доза вещества была изучена на 10-12 животных, а в отдельных исследованиях - на 20-ти животных. В исследовании использовали препарат тенотен, который представляет собой аффинно-очищенные антитела к мозгоспецифическому белку S-100 в сверх малых дозах: разведения С12 СЗО С200 (НПФ «Материа Медика Холдинг»). Тенотен в большинстве экспериментов вводили в дозе 2,5 мл/кг массы тела. Крысам контрольной группы вводили дистиллированную воду в таком же объеме.
Оценка индивидуальной эмоциональной реакции на стресс высоко- и низкоактивных животных (разделенных по методу Nomura) в тесте освещенной малой площадки при использовании провоцирующих тест стимулов.
Для усиления стрессирующей ситуации дополнительно использовали провоцирующие тест стимулы, согласно методике Broudy, Nauta: поглаживание крысы рукой, попытка взятия ее в руку и несильный угрожающий толчок крысы линейкой. При использовании этих провоцирующих тест стимулов оценивали следующие реакции животного: - активную реакцию, которая выражалась в отказе от контакта, в побеге от раздражителя, а у некоторых животных в агрессивных попытках защититься. - пассивную реакцию, которая выражалась в замирании и принятии позы подчинения (фризинг). - спокойное поведение. В контрольной группе низкоактивных животных при поглаживании их рукой 70% крыс реагировали реакцией замирания, фризингом, 10% животных убегали при попытке дотронуться до них и 20% реагировали внешне спокойным поведением и позволяли себя погладить (Таблица 2, рис.3). При попытке взятия крыс рукой 80% животных реагировали реакцией замирания, фризингом, 10% животных убегали и только 10% реагировали внешне спокойным поведением (Таблица 2, рис.3). При усилении провокации и толчке линейкой 90% крыс показывали реакцию замирания и 10% животных убегали и в группе отсутствовали животные со спокойным поведением (Таблица 2, рис.3). В контрольной группе высокоактивных животных при поглаживании крыс рукой 70% крыс реагировали активной реакцией и старались избежать контакта, 20% реагировали реакцией замирания, фризингом и 10% реагировали внешне спокойным поведением и позволяли себя погладить (Таблица 2, рис. 3). При попытке взятия крыс рукой 80% животных реагировали реакцией убегания, 10% - реакцией замирания и 10% животных - внешне спокойным поведением. При усилении провокации и толчке линейкой 80% крыс показывали реакцию убегания и 20% животных замирали. В этой группе также отсутствовали животные со спокойным поведением (Таблица 2, рис. 3). Таким образом, крысы, разделенные по типу индивидуальной реакции на эмоциональный стресс на высокоактивных и низкоактивных животных в тесте Nomura, сохраняли тип индивидуального ответа и в других стрессорных ситуациях, а именно в тесте освещенной малой площадки и при использовании провоцирующих тест стимулов по методике Broudy, Nauta. Во всех трех ситуациях: 1.стресс по Nomura в сосуде с водой и свободно вращающимися колесами; 2.стресс на малой освещенной площадке и 3.стресс при использовании провоцирующих тест стимулов высокоактивные животные сохраняли активный тип индивидуальной эмоциональной реакции на стресс, а низкоактивные животные демонстрировали заторможенное, депрессивное поведение.
Следующим этапом работы явилось изучение влияния тенотена и диазепама на животных с разным типом индивидуальной реакции на стресс. 2. Изучение действия тенотена и диазепама на эмоциональную реакцию на стресс высоко- и низкоактивных животных по методике Broudy, Nauta. Тенотен в дозе 2,5 мл/кг и диазепам в дозе 1,5 мг/кг вводили крысам однократно за 40 минут до помещения животного в центр освещенной площадки. Установлено, что тенотен в дозе 2,5 мл/кг активировал поведение у низкоактивных животных, что выражалось в достоверном уменьшении, более чем в 2 раза числа крыс с реакцией замирания и в достоверном увеличении процента крыс со спокойной реакцией (Табл.1, Рис.2). Диазепам в сравнении с тенотеном оказывал меньший эффект у низкоактивных крыс. Под влиянием диазепама процент крыс с нормальной реакцией увеличивался до 40% и был недостоверен. У высокоактивных крыс тенотен достоверно уменьшал процент животных с активной бесполезной деятельностью (60% в контроле и 10% после тенотена) и процент животных с реакцией замирания и достоверно повышал число крыс (до 70%) с нормальной спокойной ориентировочно-исследовательской реакцией. Аналогичный эффект на высокоактивных животных оказывал диазепам в дозе 1,5 мг/кг (Табл.1, Рис.2). Таким образом разделенные по методу Номура низкоактивные и высокоактивные крысы при помещении их в новую обстановку на освещенную площадку сохраняют тип индивидуального реагирования. В контроле низкоактивные крысы (по тесту Номура) остаются низкоактивными и в новой ситуации стресса, а высокоактивные животные - остаются высокоактивными. Тенотен и диазепам оказывают сходный антистрессорный эффект и увеличивают число крыс со спокойным типом реагирования в ситуации другого стресса как в группе высокоактивных, так и в группе низкоактивных животных. Однако, если у высокоактивных крыс тенотен и диазепам оказывают сходное действие, то у низкоактивных животных тенотен оказывает более выраженный эффект, чем диазепам; эффект диазепама у низкоактивных животных недостоверен. 3. Изучение действия тенотена и диазепама на эмоциональную реакцию на стресс высоко- и низкоактивных животных при использовании провоцирующих тест-стимулов. Тенотен в дозе 2,5 мл/кг и диазепам в дозе 1,5 мг/кг вводили крысам однократно за 40 минут до помещения животного в центр освещенной площадки и использования провоцирующих тест стимулов. Установлено, что тенотен в дозе 2,5 мл/кг активировал поведение у низкоактивных животных, что выражалось в уменьшении числа крыс с реакцией замирания и в достоверном увеличении процента крыс со спокойной реакцией при всех провоцирующих воздействиях (Табл.2, Рис.3).
Диазепам в сравнении с тенотеном оказывал меньший эффект у низкоактивных крыс. У высокоактивных крыс тенотен достоверно уменьшал процент животных с активным типом поведения. Так, при попытке взятия крысы в руку после введения тенотена реакцией побега реагировало 40% животных (в контроле -80% крыс). Тенотен также достоверно повышал число крыс (до 50%) с нормальной спокойной ориентировочно-исследовательской реакцией (в контроле 10%) (Табл.2, Рис.3). Аналогичный по направленности эффект на высокоактивных животных оказывал диазепам в дозе 1,5 мг/кг (Табл.2, Рис.3). Таким образом разделенные по методу Nomura низкоактивные и высокоактивные крысы при помещении их в новую обстановку на освещенную площадку и при использовании дополнительно провоцирующих тест стимулов сохраняют тип индивидуального реагирования. В контроле низкоактивные крысы (по тесту Nomura) остаются низкоактивными и в новой ситуации стресса и при использовании провоцирующих тест стимулов, а высокоактивные животные - остаются высокоактивными. Тенотен и диазепам оказывают сходный по направленности антистрессорный эффект и увеличивают число крыс со спокойным типом реагирования при использовании провоцирующих тест стимулов в группе высокоактивных животных. Однако, у низкоактивных животных тенотен оказывает более выраженный эффект, чем диазепам. Эффект диазепама у низкоактивных животных был недостоверным при использовании таких провоцирующих стресс стимулов как поглаживание крыс рукой или при попытке взятия их в руку, тогда как эффект тенотена в этих условиях эксперимента был статистически достоверным. 3. Изучение действия тенотена и диазепама на проявления эмоционального стресса у высоко- и низкоактивных животных на модели конфликтной ситуации. Эксперимент состоял из двух этапов. На первом этапе, для выявления типа индивидуальной реакции животных на стресс осуществлялось разделение крыс на высоко- и низко - активных в тесте вынужденного плавания в сосуде со свободно вращающимися колесами по Nomura. При помещении крыс в сосуд, в котором находятся свободновращающиеся колеса, животные стараются выбраться из воды с их помощью. Поскольку колеса вращаются свободно, эти попытки остаются безуспешными, и у животных развивается состояние стресса.
Изучение влияния тенотена и диазепама на эмоциональную реакцию в условиях стресса ожидания боли при дополнительной аверсивной провокации.
Эмоциональная реакция тревоги и беспокойства, связанная с ожиданием болевого раздражения в условиях опасной камеры значительно усиливается при использовании дополнительной провокации, а именно при поднесении к голове крысы карандаша. В предлагаемой ситуации вместо обычной ориентировочной реакции на карандаш у крысы усиливается стресс. Усиление эмоционального стресса проявляется в увеличении процента крыс с активным или пассивным поведением и уменьшением числа животных со спокойным поведением (Табл. 13, рис.13). Из 20 исследованных контрольных крыс 10 животных (50%) реагировали "фризингом"- реакцией замирания с низкой двигательной активностью. Животные, на предъявление карандаша, забивались в угол камеры и не совершали перемещений по камере. 45% животных реагировали на провокацию активным тревожным поведением с попытками выбраться из экспериментальной камеры (высокая двигательная активность, вставания на задние лапы, прыжки вверх). И только у одной крысы из 20-ти (5%) поведение оставалось спокойным и не отличалась от ориентировочно- исследовательского поведения при помещении крысы в опасную камеру. У крыс наблюдалось учащение дыхания (75% животных), писк (45% животных), была повышена дефекация (60% животных) и уринация (65% животных). Эти показатели также были значительно более выражены в сравнение с «обычным» (без провокации) стрессом ожидания боли (Табл.13, Рис. 14). При дополнительной провокации некоторые животные реагировали на приближение карандаша агрессивной реакцией (45%). Тенотен в дозе 2,5 мл/кг, введенный за 30 минут до помещения крыс в опасную камеру вызывал уменьшение воздействия эмоционального стресса, вызванного дополнительной провокацией. Эффект препарата выражался в уменьшении числа животных как с пассивной (фризинговой), так и с активной реакциями, и в увеличении числа животных со спокойной реакцией (Табл. 13, рис.13). Так, процент животных с реакцией замирания на стресс уменьшался при провокации до 20%, а процент животных с активной, беспокойной реакцией также уменьшался до 20%. Наиболее демонстративным оказался показатель нормализации поведения крыс в условиях стресса ожидания боли при дополнительной провокации. Процент крыс без замирания и беспокойного активного поведения, с обычной ориентировочно- исследовательской реакцией существенно увеличился после введения пропротена и составил после применения препарата 60%, тогда как в контроле, животные со спокойным поведением составляли только 5% (Табл. 13, рис.13). Под влиянием тенотена нормализовались сомато-вегетативные проявления стресса: уменьшался процент крыс с нарушением дыхания, усиленной дефекацией и уринацией, а также число животных с писком (Табл.13, Рис.14).
Тенотен существенно снижал число крыс, реагирующих на провоцирующий стимул агрессией (до 10%). Диазепам в дозе 1,5 мг/кг в условиях стресса ожидания боли при дополнительной провокации, также как и тенотен, способствовал нормализации поведения. Так, процент животных с реакцией замирания на стресс уменьшался до 40%, но был статистически недостоверным, а процент животных с активной, беспокойной реакцией уменьшался до 5%. После введения диазепама процент крыс без замирания и беспокойного активного поведения, с обычной ориентировочно- исследовательской реакцией также существенно увеличился и составил 55% (Табл. 13, рис.13). Под влиянием диазепама нормализовались сомато-вегетативные проявления стресса: уменьшался процент крыс с нарушением дыхания (до 40%), усиленной дефекацией и уринацией (до 25%) (Табл.13, Рис. 14). Диазепам существенно снижал число крыс, реагирующих на провоцирующий стимул агрессией (до 15%). Сравнение эффектов диазепама и тенотена на стресс ожидания боли при провокации показывает, что в отличие от тенотена диазепам оказывает отчетливое действие преимущественно на животных с активной формой поведения и не изменяет поведение крыс с пассивной реакцией, которое сохраняется у 40 % крыс (в контроле - 50%). Таким образом, выполненные исследования позволили установить, что при помещении контрольных животных в камеру, где они ранее получали болевое раздражение, у них развивается стресс ожидания боли, основанный на условном эмоциональном рефлексе (обусловленный страх). У 45% крыс стресс выражается в пассивном поведении, которое характеризуется замиранием (фризингом), а у 40% - в активном поведении с попытками выбраться из камеры. У животных наблюдается учащение дыхания, писк, учащение дефекаций и уринации. При стрессе ожидания боли, усиленном провокацией (поднесение к голове крысы карандаша) увеличивается число крыс с пассивной и активной реакцией на стресс и процент крыс со спокойной реакцией составляет только 5% (одна крыса из 20-ти). Тенотен (2.5 мл/кг, внутрь за 30 минут до стресса) оказывает выраженное влияние на спонтанное поведение животных в условиях стресса ожидания боли. Препарат оказывает достоверный эффект как на пассивных, так и на активных животных: число крыс с реакцией замирания на стресс уменьшалось в 2,25 раза по сравнению с контролем, а число животных с активной, беспокойной реакцией уменьшалось в 2,6 раза по сравнению с контролем. Соответственно в 4,3 раза после введения тенотена по сравнению с контролем увеличивалось число животных со спокойной реакцией на ситуацию.
При стрессе ожидания боли, усиленном провокацией (поднесение к голове крысы карандаша) тенотен уменьшает число крыс с реакцией замирания в 2,5 раза, а число крыс с активным поведением - в 2 раза. Процент животных со спокойным поведением увеличивается до 60 % (контроль 5%). Под влиянием тенотена значительно уменьшаются сомато-вегетативные проявления стресса ожидания боли как у пассивных, так и у активных крыс (нарушение дыхания, вокализация, учащение дефекации и уринации). По антистрессорной активности тенотен не уступает диазепаму. Однако тенотен оказывает влияние как на животных, реагирующих на стресс замиранием, так и на крыс с активной, в том числе и агрессивной, реакцией на стресс. Диазепам обладает антистрессорным действием преимущественно у крыс с активной реакцией на стресс и малоэффективен у животных с пассивной реакцией замирания. 7. Изучение миорелаксатного действия тенотена и диазепама у высоко- и низкоактивных крыс. Миорелаксантное (возможное побочное действие) тенотена исследовали в тесте вращающегося стержня в опытах на крысах. В течение 2 мин регистрировали число упавших животных и латентные периоды падений со стержня. В качестве препарата сравнения использовали диазепам. Эксперимент состоял из двух этапов. На первом этапе, для выявления типа индивидуальной реакции животных на стресс осуществлялось разделение крыс на высоко- и низко - активных в тесте вынужденного плавания в сосуде со свободно вращающимися колесами по Nomura. При помещении крыс в сосуд, в котором находятся свободновращающиеся колеса, животные стараются выбраться из воды с их помощью. Поскольку колеса вращаются свободно, эти попытки остаются безуспешными, и у животных развивается состояние стресса. Чем ниже число оборотов, тем более выражено это состояние. На втором этапе исследования изучали поведение высоко- и низкоактивных крыс в условиях методики вращающегося стрежня и влияние тенотена и диазепама на поведение крыс с различными типами реакции. Крыс разбивали на 6 групп по 8-10 крыс в каждой. 1.Высокоактивные контрольные крысы, которым вводили дистиллированную воду в объеме 0,25 мл/100 г массы животного. 2. Высокоактивные крысы, которым вводили тенотен в дозе 0,25 мл на 100 г. массы тела животных. 3. Высокоактивные крысы, которым вводили диазепам в дозе 2,5 мг/кг в объеме, эквивалентном объеме тенотену. 4. Низкоактивные контрольные крысы, которым вводили дистиллированную воду в объеме 0,25 мл/100 г массы животного. 5. Низкоактивные крысы, которым вводили тенотен в дозе 0,25 мл на 100 г. массы тела животных. 6. Низкоактивные крысы, которым вводили диазепам в дозе 2,5 мг/кг в объеме, эквивалентном объеме тенотену.
