Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Экстракт корня солодки - фармакопейный препарат 10
1.2. Краткая характеристика системы детоксикации организма 22
1.3. Обладают ли экстракт корня солодки и его компоненты антитоксическим действием?
1.4. Взаимоотношения опухолевого процесса и активности ферментов биохимической детоксикации 29
1.5. Роль ферментов биохимической детоксикации в проявлении фармакологической активности и токсичности цитостатиков 34
1.6. Антиканцерогенная и противоопухолевая активность экстракта корня солодки и его компонентов 39
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Поэтапная схема постановки эксперимента 46
2.2. Экспериментальные животные 46
2.3. Характеристика опухолевой линии и условий ее поддержания 48
2.4. Тестируемые лекарственные препараты и вещества 49
2.5. Модель перевиваемой опухоли 52
2.6. Изучение ростовых характеристик опухолевой линии т УИГО 55
2.7. Модель острого цитостатического токсикоза 59
2.8. Тест «гексобарбиталового сна» 59
2.9. Изучение перекисного окисления липидов 60
2.10. Определение глюкуронидов и свободной глюкуроновой кислоты в печени 61
2.11. Статистическая обработка результатов 62
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 63
3.1. Исследование противоопухолевой активности экстракта корня солодки 63
3.2. Влияние экстракта корня солодки на некоторые биохимические показатели детоксикации у мышей с лимфолейкозом Р388 73
3.3. Влияние экстракта корня солодки на токсичность циклофосфамида 78
3.4. Влияние экстракта корня солодки на противоопухолевый эффект циклофосфамида 87
3.5. Влияние экстракта корня солодки на некоторые биохимические показатели детоксикации при лечении циклофосфамидом лимфолейкоза Р388 90
3.6. Может ли экстракт корня солодки «превратить» токсичную дозу циклофосфамида в терапевтическую? 94
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 96
Выводы 107
Литература 108
- Взаимоотношения опухолевого процесса и активности ферментов биохимической детоксикации
- Антиканцерогенная и противоопухолевая активность экстракта корня солодки и его компонентов
- Изучение ростовых характеристик опухолевой линии т УИГО
- Влияние экстракта корня солодки на противоопухолевый эффект циклофосфамида
Введение к работе
Актуальность темы
В медицинской практике средства растительного происхождения всегда занимали важное место. И на сегодняшний день не ослабевает интерес к изучению не только чистых химических соединений растительного происхождения, но и цельных растительных препаратов. Это связано, в первую очередь, с многокомпонентностью их состава, где одни вещества усиливают эффективность других и, нередко, невозможно выделить вещество, ответственное за те или иные эффекты [47].
Использование препаратов растительного происхождения является одним из перспективных направлений терапии злокачественных новообразований [23, 85, 118, 149], но до настоящего времени этот источник используется недостаточно. Действие различных биологически активных компонентов растений может быть направлено на подавление пролиферации опухолевых клеток (противоопухолевое действие) [85, 118, 119, 120, 149, 166], стимуляцию противоопухолевой резистентности организма (антиканцерогенное действие) [150, 173, 189, 190, 194], а также на усиление эффективности и ослабление токсического действия на организм используемых цитостатиков [27, 28, 49, 50]. - -
Распространенный злокачественный опухолевый процесс сопровождается нарушением работы регуляторных систем гомеостаза, в том числе, и процессов детоксикации, что обусловливает развитие токсикоза и кахексии. Химиотерапия, занимающая в настоящее время одно из лидирующих мест в лечении злокачественных новообразований, характеризуется низкой избирательностью по отношению к мишени: высокой агрессивностью не только для опухолевых, но и для нормальных клеток. Повреждение и гибель опухолевых и, в определенной степени, нормальных клеток приводит к накоплению в организме токсических метаболитов, перегружает систему детоксикации. Таким образом, возникает токсикоз сочетанного генеза: с одной стороны обусловленный прогрессированием злокачественного новообразования, а с другой - противоопухолевой терапией, что серьезно ограничивает достижение максимального лечебного эффекта, и, в ряде случаев, приводит к прерыванию уже начатого лечения [11]. Формируется своеобразный порочный круг, когда химиотерапия не имеет альтернативы, но не может быть проведена без серьезного риска. Предупреждение и уменьшение этих видов токсичности - это реальный путь к повышению эффективности лечения и качества жизни больных со злокачественными новообразованиями.
Цель работы
Изучить эффективность экстракта корня солодки (ЭКС) в экспериментальной терапии злокачественных новообразований.
Задачи исследования
Оценить противоопухолевый эффект ЭКС на модели перевиваемого лимфолейкоза Р388 у мышей BDF).
Изучить действие ЭКС на ростовые характеристики клеток линии Р388 in vitro.
Оценить влияние ЭКС на некоторые биохимические показатели детоксикации (активность монооксигеназ, уровень глюкуроновой кислоты и глюкуронидов, интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в печени) у экспериментальных животных с лимфолейкозом Р388 и при введении циклофосфамида (ЦФ).
Исследовать влияние ЭКС на выживаемость животных в модели токсикоза, вызванного летальными дозами ЦФ.
Сравнить противоопухолевый эффект циклофосфамида и комбинации ЦФ+ЭКС на модели лимфолейкоза Р388.
Научная новизна
При оценке прямого противоопухолевого действия было обнаружено, что в условиях культуры ЭКС подавляет пролиферацию опухолевых клеток линии Р388 преимущественно за счет индукции апоптоза. Данный эффект ЭКС не связан с его основным компонентом - глицирризиновой кислотой и не проявляется в условиях in vivo при пероральном введении препарата.
Впервые выявлено, что применение ЭКС при экспериментальном лимфолейкозе Р388 у мышей уменьшает проявления опухолевого токсикоза, подтверждением чему служат укорочение продолжительности гексо- барбиталового сна, понижение интенсивности ПОЛ и увеличение содержания глюкуроновой кислоты и глюкуронидов в печени.
Впервые показано, что ЭКС повышает переносимость летальных доз ЦФ за счет снижения явлений цитостатического токсикоза. Данный эффект ЭКС обусловлен глицирризиновой кислотой.
У мышей с лимфолейкозом Р388 впервые экспериментально доказано, что курсовое энтеральное введение ЭКС на фоне токсичных доз ЦФ увеличивает число ремиссий опухолевого процесса и количество выживших животных.
Практическая значимость
Совокупность полученных в работе данных о влиянии ЭКС на опухолевую прогрессию и систему детоксикации организма дополняют сведения о механизмах фармакологического действия препаратов солодки и глицирризиновой кислоты.
Изучение противоопухолевой и антитоксической эффективности ЭКС выявило перспективность этого лекарственного препарата для более углубленного изучения. Обоснована перспективность дальнейшего исследования противоопухолевой эффективности флавоноидной фракции ЭКС при парентеральном введении.
Подобранная схема экспериментальной терапии лимфолейкоза у мышей комбинацией ЭКС и ЦФ может быть рекомендована для дальнейших клинических испытаний с целью повышения эффективности химиотерапии опухолей.
Учитывая, что ЭКС проявлял выраженные антитоксические свойства при значительной нагрузке системы детоксикации организма вследствие опухолевой прогрессии и/или на фоне введения высоких доз цитостатика, можно рекомендовать расширение сфер клинического использования фармакопейного препарата ЭКС и его биологически активных компонентов.
Основные положения, выносимые на защиту
ЭКС дозозависимо подавляет пролиферацию и индуцирует апоптоз в культуре опухолевых клеток линии Р388. Обнаруженный эффект не обусловлен основным компонентом экстракта - глицирризиновой кислотой.
Пероральное многократное введение экспериментальным животным ЭКС снижает проявления токсикоза, индуцированное летальными дозами ЦФ. Антитоксический эффект экстракта обеспечивается глицирризиновой кислотой.
В модели перевиваемого лимфолейкоза Р388 курсовое энтеральное введение ЭКС повышает переносимость высоких доз ЦФ, что позволяет усилить эффективность экспериментальной противоопухолевой терапии.
Публикации и апробация работы
Работа, представленная на II Международной конференции молодых врачей «From prevention to intervention», стала победителем в секции фундаментальных наук (Ереван, 2003). Материалы диссертации были доложены на III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2004); I Международной дистанционной научно-практической конференции «Новые технологии в медицине» (Санкт-Петербург, 2004).
По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ. Работа апробирована на расширенном заседании кафедры фармакологии ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет» Росздрава.
Внедрение результатов исследования
Результаты диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре фармакологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе лаборатории по созданию нетоксичных иммуномодуляторов НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Рсздрава.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками, содержит 9 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных экспериментальных данных, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 71 отечественных и 134 зарубежных источника литературы.
Ликорис цветет - и помереть невозможно в такую пору!
Солодка (Glycyrrhiza)
Танэда Сантока (Японская поэзия Серебряного века)
Взаимоотношения опухолевого процесса и активности ферментов биохимической детоксикации
Множество исследований посвящено противовирусной активности солодки. Имеются экспериментальные факты подавления глицирризином ш vitro репликации вируса гепатита А [93], вируса японского энцефалита [81], вируса сицилийской флеботомной лихорадки [94], вируса коровьей оспы [132], ВИЧ-1 [110]. В качестве возможного механизма анти-ВИЧ-активности показано ингибирование обратной транскриптазы вируса, опосредованное снижением фосфорилирующей активности казеинкиназы II. Среди веществ, перспективных в качестве анти-ВИЧ-агентов, оказались также фосфатидаты глицирретовой кислоты, которые, предположительно, препятствуют связыванию вируса с плазматической мембраной клетки хозяина [18].
В экспериментах in vivo введение мышам глицирризина в дозе 10 мг/кг, инфицированным вирусом гриппа А2, а также трансфекция Т-клеток, полученных из селезенок мышей, пролеченных глицирризином значительно повышали выживаемость и снижали титр вируса в легочной ткани, хотя противовирусный эффект не воспроизводился in vitro или при введении мышам глицирризина вместе с антителами к у-интерферону [187].
Противовирусные препараты, содержащие в качестве remedium basis глицирризиновую кислоту, уже нашли применение в клинике. В России используется препарат эпиген-интим (Cheminova Internacional) в виде крема и спрея для лечения генитального герпеса, остроконечных кондилом, эрозий шейки матки вирусной этиологии. В Японии накоплена довольно солидная статистика успешного клинического использования глицирризина и инъекционного препарата stronger neo-minophagen С (раствор, содержащий 0,2% глицирризиновой кислоты, 2% глицина, 0,1% цистеина и 5% глюкозы) для лечения вирусных гепатитов [77, 188].
Иммунотропная активность выявлена у различных компонентов солодки: фракции полисахаридов, выделенной из побегов и корней [151, 196], флавоноидов [82], глицирризиновой [95, 146, 185, 186, 197, 203, 204] и глицирретовой кислот [121, 155, 156], а также их синтетических дериватов [8].
Индивидуальные химические вещества, содержащиеся в корнях и корневищах солодки, неоднозначно влияют на механизмы естественного и адаптивного иммунитета. Полисахаридная фракция корня солодки повышает продукцию оксида азота (N0) перитонеальными макрофагами [151], фагоцитарную активность, индуцирует секрецию ИЛ-1, повышает активность NK-клеток, проявляет митогенную активность по отношению к В- лимфоцитам, стимулирует секрецию интерферона спленоцитами [196]. Глицирризин не индуцирует продукцию NO покоящимися макрофагами, но повышает образование этого медиатора клетками, активированными у- интерфероном или супернатантом КонА-активированных спленоцитов, увеличивает NO-опосредованную токсичность макрофагов по отношению к опухолевым клеткам [197]. 18Р-глицирретовая кислота стимулирует продукцию NO макрофагами, способствуют экспрессии iNOS, опосредованной ядерным транскрипционным фактором NF-KB [121].
Лимфоциты периферической крови, тонзилярные Т- и В-лимфоциты, NK-клетки, моноциты/макрофаги экспрессируют на своей поверхности белки межклеточных коммуникационных контактов - коннексины Сх40 и Сх43, обеспечивающие метаболическое и электрическое сопряжение между клетками, а также процессы миграции. Повышение функциональной экспрессии коннексинов происходит при стимуляция in vitro Т- и В- лимфоцитов митогенами ФГА и ЛПС [156], при активации культуры моноцитов/макрофагов комбинацией ЛПС+у-интерферон или ФНО-а+у- интерферон [101]. Ингибитор межклеточных коммуникационных контактов 18-а-глицирретовая кислота в культуре смешанных лимфоцитов, а также очищенных В-лимфоцитов существенно подавляет продукцию IgM, IgG и IgA, уменьшает экспрессию мРНК ИЛ-10 [155], значительно снижает секрецию моноцитами/макрофагами матриксных металлопротеиназ (ММР-2, но не ММР-9), а также миграцию последних через модель ГЭБ [101].
Интраперитонеальное введение глицирризина за 12 часов до выделения перитонеальных макрофагов, стимулирует продукцию ими ИЛ-12, индуцированную ЛПС in vitro. Глицирризин увеличивает экспрессию мРНК ИЛ-12-р40, что коррелирует с увеличением активации NF-кВ. При этом глицирризин не увеличивает продукцию GM-CSF и проявляет подобный эффект у мышей, «нокаутированных» по гену у-интерферона [95]. ИЛ-12, продуцируемый моноцитами/макрофагами, служит мощным стимулом продукции Т- и NK-клетками у-интерферона и, следовательно, дифферен- цировки Тх-клеток в Txl. Из селезенок мышей с ожоговой травмой были выделена популяция Тх2-клеток (ИЛ-4/ИЛ-10-продуцирующие CD8+CD11+ y-клетки). Через 6 дней после ожоговой травмы такие мыши не отвечали увеличением сывороточного ИЛ-12 на стимуляцию ЛПС. Однако предварительное интраперитонеальное введение глицирризина в дозе 10 мг/кг восстанавливало ответ до уровня сопоставимого с нормой [186] и стимулировало Txl-иммунный ответ [146]. Глицирризин повышает резистентность MAIDS-мышей (инфицированных вирусом мышиной лейкемии LP- BMS) к инфекции Candida albicans до уровня неинфицированных мышей, индуцируя образование CD4+ Т-клеток, которые подавляют развитие иммунного ответа по Тх2- типу и уменьшают образование ИЛ-4 и ИЛ-10 MAIDS-ассоциированными Т2-хелперами [185].
Антиканцерогенная и противоопухолевая активность экстракта корня солодки и его компонентов
Одним из направлений исследования МОС является изучение роли семейства цитохрома Р-450 в процессах возникновения опухоли. Экспериментальные модели демонстрируют изменение чувствительности животных к химическим канцерогенам при модулировании экспрессии изоэнзи- мов цитохрома Р-450 [87]. In vitro человеческий цитохром Р-450 может активировать многие химические канцерогены. Главными изоформами цитохрома Р450, вовлеченными в активацию канцерогенов, являются: CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2E1 и CYP3A4 [108]. Например, CYP1A2 активирует многие гетероциклические амины, a CYP2A6 — некоторые нит- розамины. Эпидемиологические исследования демонстрируют корреляцию повышенного риска возникновения колоректального рака [133] и высокой активности CYP1А2, а также генотипа со сниженной активностью CYP1А6 и низкой частоты рака легкого в Японии [78].
Большой интерес представляют данные об изменении метаболической активности печени при опухолевом росте. В литературе имеются сообщения об ингибирующем влиянии опухолевого процесса на активность МОС. Многие перевиваемые опухоли, такие как асцитный рак Эрлиха, асцитная саркома 180, карцинома Уокера, лимфома L5178Y и другие в эксперименте значительно уменьшали скорость метаболизма ксенобиотиков [65, 106, 131, 167]. В опытах с лейкозом мышей Р388 было показано снижение уровня цитохрома Р-450, скорости микросомального метаболизма бифенила и почти 2-кратное снижение клиренса циклофосфамида на 8 сутки после перевивки опухоли, в то время как на 6 сутки этих эффектов не отмечали [161], лимфома L5178Y снижала активность цитохрома Р-450 на 6-7 сутки [167].
В опытах на крысах на 6 сутки после трансплантации гепатомы показано снижение активностей монооксигеназ, глутатион-Б-трансферазы, УДФ- глюкуронилтрансферазы печени [131]. Трансплантация лимфосаркомы Плисса и асцитной гепатомы Зайдела приводила к снижению цитохрома Р- 450 на 5-6 день [65]. Фибросаркома молочной железы крыс ингибировала микросомальное окисление на 20 сутки после трансплантации [106].
Ингибирующее влияние опухолевого процесса на активность монооксигеназ прослеживается и у человека. Оценка скорости микросомального метаболизма при опухолях печени [144], у больных с метастазами в печень, с карциномой легкого [12, 75], лимфогранулематозом [12] выявила снижение активности ферментов.
Изменяется экспрессия цитохрома Р-450 и спектр его изоформ в самой опухолевой ткани и на ранних стадиях канцерогенеза, при этом не найдено зависимости между гистологическим строением опухоли, содержанием и активностью в ней цитохрома [38]. В перевиваемых опухолях различных органов содержание цитохрома Р-450 ниже, чем в нормальной гомологичной ткани, однако в первичных опухолях содержание фермента может колебаться в широких пределах [38, 39].
МОС участвует в метаболических превращениях большого числа противоопухолевых препаратов: N-деметилировании (СУРЗА1, ЗА4, 2В1) и 4-гидроксилировании (СУР2С9, 2D6, ЗА4) тамоксифена; О-деметили- ровании этопозида и тенипозида; окислительном десульфировании (СУР2В1, 2С6, 2С11) тио-ТЭФА; гидроксилировании (СУР2С8, ЗА, ЗА4) таксола; в активации путем 4-гидроксилирования (СУР2А6, 2В6, 2С8) циклофосфамида и элиминации последнего N-дехлорэтилированием (ЗА4) [11]. В опыте in vitro с использованием микросом печени человека показана преимущественная активация циклофосфамида с участием изофермен- тов цитохрома Р-450 группы СУР2В [90].
В ходе метаболизма цитостатиков образуются реактивные метаболиты, реализующие специфический противоопухолевый эффект и/или неактивные производные и катализируются реакции конъюгации, в результате которых токсические продукты выводятся из организма. Таким образом, МОС осуществляет активирующую и детоксицирующую функции. Рассуждая о монооксигеназах, как о ферментах, активирующих и инактиви- рующих химиопрепараты, которые локализованы главным образом в печени, надо учитывать, что они присутствуют и в других тканях, в том числе опухолевой. Экспрессия ферментов МОС опухолевой тканью, как отмечалось выше, может быть существенно изменена, тогда терапевтический эффект противоопухолевого препарата, метаболизируемого цитохромом Р- 450, будет определяться балансом активностей ферментов опухоли и печени и, возможно, последнее может служить причиной резистентности опухоли к такому препарату [25].
Циклофосфамид (ЦФ) - один из наиболее широко используемых алкилирующих противоопухолевых препаратов, чье действие зависит от метаболической активации цитохромом Р-450 [135]. Интактная молекула ЦФ обладает очень слабой активностью in vitro в отсутствии этого фермента. Общая схема метаболических превращений ЦФ представлена на рисунке 1.3 [198].
Изучение ростовых характеристик опухолевой линии т УИГО
Промотор, реализуя митогенное действие, одновременно ингибирует гибель клеток, которая происходит по механизму апоптоза [37]. В последнее время стало доминировать представление, что рост новообразования связан не столько с повышением митотической активности, сколько с накоплением клеток, не способных вовремя умереть [30]. Поэтому количество работ, посвященных влиянию солодки на сигнальные пути апоптоза, лавинообразно растет.
При добавлении глицирретовой кислоты в митохондриальную фракцию печени крыс отмечали набухание митохондрий, снижение их мембранного потенциала и освобождение в цитозоль цитохрома С и факторов апоптоза. Эти изменения были Ca -зависимыми, так как предотвращались циклоспорином А и бонгрековой кислотой [170]. Интра- перитонеальное введение 1,0-5,0 мг глицирретовой кислоты мышам C57BL/6 в течение 24 часов вызывало инволюцию тимуса и селезенки, индуцируя апоптоз тимоцитов и спленоцитов, но in vitro этот эффект не проявлялся. При этом в печени и селезенке наблюдали ингибирование фермента 11-бета-ОН-СДГ, коррелирующее с повышением концентрации кортикостерона в крови. Вероятно, апоптоз проявлялся как следствие увеличения эндогенного кортикостерона, а не прямого влияния глицирретовой кислоты [114, 115]. И, наоборот, глицирризиновая кислота при добавлении 25-400 мкг/мл в культуру тимо- и спленоцитов мышей BALB/c индуцировала явные признаки апоптоза. Однократная инъекция глицирризина в дозе 100 мкг/мышь не вызывала, а 7-кратное введение в той же дозе вызывало незначительные апоптотические изменения селективно в спленоцитах (CD4+- и CD8+ Т-лимфоцитах) [153]. Авторы считают, что глицирризин действует как селективный индуктор апоптоза зрелых Т-лимфоцитов с предшествующим гибели клеток снижением А psi m трансмембранного потенциала митохондрий.
В культурах клеток рака предстательной железы [166], молочной железы MCF-7 [123, 137, 165, 166], лейкозов HL-60 [165] и U937 [192], адено- карцином толстой кишки Со1о205 [157], Colo320DM и Со1оп26 [180] ЭКС, а также его компоненты — халконы: изоликвиритигенин и ликохалкон А; [3- дикетоны (минорные компоненты ЭКС); ликокумарон запускали митохон- дриальный путь апоптоза через снижение экспрессии генов антиапоптоти- ческого фактора Вс1-2 и/или ингибирование последнего фосфорилирова- нием, down-регуляцию Bcl-XL и ир-регуляцию активностей апоптоз- опосредующего белка Вах и р21. Последний является ингибитором комплексов Cdk (циклин-зависимая киназа)-циклин, ДНК-полимеразы и останавливает клеточный цикл [64].
С одной стороны, выделенные из ЭКС активные соединения, описаны в литературных источниках как обладающие достоверной антиканцерогенной активностью, но с другой стороны, 18-а- и 18-3-глицирретовые кислоты идентифицированы как ингибиторы межклеточных коммуникационных контактов [107, 109] и используются с этой целью во многих исследованиях [97, 162]. В зоне межклеточных контактов существуют специфические каналы (коннексоны), через которые могут проникать молекулы до 1 KDa. Коннексоны образованы белками коннексинами. Нарушение межклеточных коммуникаций вызывает «глухоту» клеток к регулирующим сигналам. Предполагается, что нарушение межклеточных коммуникационных контактов при действии промоторов связано с тем, что они вызывают фосфорилирование коннексинов и выход их из мембраны клетки в цитоплазму [37]. Интересно отметить, что 18-(3-глицирретовая кислота в концентрации 5-40 мкМ при обработке клеток в течение 1-4 часов вызывает разборку межклеточных каналов в эпителии печени крыс, которые образованы коннексином Сх-43. В противоположность механизму дезинтегрирующего действия промоторов опухолей, активность 18-Р-глицирретовой кислоты коррелирует со снижением фосфорилированной формы Сх-43-Р2 и увеличением нефосфорилированной Сх-43-ИР формы коннексина. Дефосфо- рилирование коннексинов 18-Р-глицирретовой кислотой связано с повышением активности фосфатаз типа 1 и 2А и сопутствует разобщению межклеточных контактов [107]. Гены коннексинов относят к опухоль-супрессорным генам, а сам Сх-43 оказывает подавляющий эффект на опухолевый рост, ин- гибируя протеин-2, ассоциированный с киназой Б-фазы. В ингибировании участвует только С-концевой домен Сх-43, не формирующий межклеточные контакты, а 18-Р-глицирретовая кислота не подавляет этот эффект [205].
Анализируя данные литературы, логично было бы предположить, что применение ЭКС может преследовать, по крайней мере, такие цели: 1) повышение противоопухолевой резистентности и стимулирование противоопухолевого потенциала организма; 2) активное вмешательство в процессы биотрансформации токсичных соединений с целью направленного изменения их метаболизма при патогенетической или профилактической терапии токсикозов, в том числе, для уменьшения токсичности цитостатиков.
Влияние экстракта корня солодки на противоопухолевый эффект циклофосфамида
Оценку ПОЛ проводили при помощи цветной реакции с 2- тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Sigma Aldrich, США), индуцируя ли- попероксидацию in vitro, инкубированием гомогената печени в термостате в условиях доступа воздуха при 37С [20]. При проведении ТБК- теста использовали гомогенат печени (освобожденный от крупных частиц центрифугированием и фильтрованием через двойной слой марли), разведенный 0,04 М Na-фосфатным буфером, приготовленном на 0,9% NaCl (рН=7,4) до конечной концентрации порядка 1% (вес : объем). 2 мл этого разведения депротеинировали добавлением 1 мл 28% трихлорук- сусной кислоты, содержащей ЭДТА в концентрации 0,1%. Далее безбелковый экстракт отделяли 10-минутным центрифугированием (ОПН-3) при 3000 об/мин. 2 мл депротеината смешивали с 1 мл 1% раствора ТБК (в 50% водном растворе уксусной кислоты) в высоких стеклянных пробирках, которые затем помещали в кипящую водяную баню на 15 минут. На этом этапе пробирки оставляли открытыми. Оптическую плотность регистрировали на спектрофотометре СФ-26 (ЛОМО, Россия) при длине волны 532 нм в односантиметровом оптическом слое против оптического контроля, который проводился через все вышеописанные этапы, но вместо гомогената печени содержал изотонический Na-фосфатный буфер. ТБК-тестирование проводили параллельно в двух пробах для каждой навески печени, таким образом, определяя содержание продуктов ПОЛ в «нулевой» момент времени и через 60 мин. инкубации при 37С. Рассчитывали стандартизованный показатель окисляемости липидов (СПОЛ) как прирост экстинкции за время инкубации в процентах по отношению к экстинкции до инкубации: СПОЛ=([Еб0 - Е0]/ Е0)хЮО%, где Ебо - значение оптической плотности в единицах экстинкции в пробе, подвергнутой инкубации в течение 60 мин.; Е0 - значение оптической плотности в единицах экстинкции в «нулевой» момент времени (без инкубации).
Также рассчитывали скорость образования ТБК-РП (продуктов ли- попероксидации, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой) в мкмоль на 1 грамм печени за 1 час инкубации, учитывая молярный коэффициент экстинкции комплекса 8=1,56х105см"1моль"1 [56].
Уровень общей (свободной и связанной) глюкуроновой кислоты определяли карбазоловым методом по Thompson М.Е. в модификации Чилин- гарян Л.А. (1984) [68]. Метод основан на гидролизе глюкуронидов при кипячении с концентрированной серной кислотой и реакции продуктов гидролиза с карбазолом. Для анализа 1 мл 10% гомогената печени смешивали с 4 мл холодной смеси (100 мл 95% этанола и 1 мл ледяной уксусной кислоты) и отстаивали при 4С в течение 60 мин. Образовавшийся осадок растворяли добавлением 10 мл 0,01 н гидроксида натрия в течение часа. В 1 мл полученного раствора добавляли 6 мл концентрированной серной кислоты и подвергали 30-минутному гидролизу (кипячение на водяной бане). Окраску получали добавлением 0,2 мл карбазолового реактива (50 мг карбазола («СОФЭКС», Москва) в 50 мл абсолютного спирта) с последующей двухчасовой инкубацией при комнатной температуре. Оптическую плотность регистрировали на спектрофотометре при длине волны 530 нм в односантиметровом оптическом слое против оптического контроля, который проводился через все вышеописанные этапы, но вместо карбазолового реактива содержал этанол. Для построения калибровочного графика была использована глюкуроновая кислота (Sigma Aldrich, США). Содержание глюкуроно- вой кислоты в исследуемом образце выражали в ммоль/г печени.
Характер вариабельности результатов экспериментов подчинялся законам нормального распределения. Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с помощью пакета анализа данных программного комплекса «Microsoft Excel 2000» путем расчета средней арифметической (М) и средней ошибки средней арифметической (ш). Для оценки достоверности выявленных различий средних арифметических в группах использовали t-критерий Стьюдента, разницу считали достоверной при Р 0,05.
Для сравнения динамики гибели животных в разных группах использовали статистический комплекс программ GraphPad Prism for Windows (4 версия). Для оценки достоверности различий кривых выживаемости использовали logrank тест.
Тестирование ЭКС на противоопухолевую активность проводили на модели лимфолейкоза мышей Р388. Каждой мыши перевивали внутри- брюшинно по 0,3 мл разведенной асцитной жидкости, содержащей 106 опухолевых клеток. Противоопухолевая активность ЭКС in vivo была протестирована в двух дозировках. Эксперименты проводили в прямом параллельном сравнении следующих групп мышей: 1-я группа служила контролем; 2-я группа получала ЭКС в дозе 0,1 г/кг; 3-й подопытной группе вводили ЭКС в дозе 1,0 г/кг. ЭКС начинали вводить энтерально за 7 дней до перевивки и продолжали после перевивки опухолевых клеток еще в течение 7 дней по схеме: ЭКС (в течение 7 суток) — перевивка Р388 — ЭКС (в течение 7 суток) В дальнейшем такая схема введения препаратов будет обозначаться в тексте как «стандартная». При качественной визуальной оценке на разных сроках роста опухоли не отмечалось явных различий в поведенческих реакциях животных в контрольной группе и группе, получавшей различные дозы ЭКС. На поздних сроках опухоли (7-11 дни — в зависимости от группы) признаки опухолевого токсикоза были выражены у всех экспериментальных животных, что проявлялось в снижении двигательной активности, пилоэрекции, выраженном накоплении асцита в брюшной полости и одышке.
![Повышение эффективности фармакотерапии больных артериальной гипертензией с использованием фармакокинетических параметров \Nb-адреноблокаторов [Электронный ресурс]](/i/i/4481/209426.png "Повышение эффективности фармакотерапии больных артериальной гипертензией с использованием фармакокинетических параметров \Nb-адреноблокаторов [Электронный ресурс] Жамбалов Даши Баирович")