Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор 11
1.1. Цитохромы Р450 11
1.2. Фармакокинетика кофеина 14
1.3. Хроматографические методы анализа 18
1.4. Варианты и методы применения фенотипирования по активности изоферментаСУР'гЧг 21
1.5. Побочные эффекты антипсихотических лекарственных средств 28
1.6. Дозировние антипсихотических лекарственных средств 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Использованное аналитическое оборудование 38
2.2.Использованные реагенты 38
2.3. Условия проведения отбора образцов 38
2.4. Характеристика обследованных добровольцев 39
2.5. Характеристика обследованных пациентов 39
2.6. Анализ дозирования лекарственных средств, применяемых в терапии психически больных пациентов 40
2.7. Методы статистической обработки результатов 41
ГЛАВА 3. Результаты исследования и обсуждение 42
3.1. Экспериментальная часть работы 42
3.1.1. Определение кофеина и его первичных метаболитов в слюне плазме методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 42
3.1.2. Обсуждение экспериметальных результатов 54
3.2. Теоретическая часть работы 57
3.2.1. Математическая модель процесса метаболизма кофеина и его первичных метаболитов и новый способ расчета специфической активности изофермента цитохрома Р450 1А2 57
3.2.2. Программный комплекс расчета фармакокинетических параметров 59
3.2.3. Анализ использованных в исследовании фармакокинетических параметров, описывающих метаболизм кофеина 65
3.2.4. Обсуждение теоретических результатов 66
3.3. Клиническая часть работы 68
3.3.1. Анализ параметров фармакокинетики кофеина у здоровых добровольцев 68
3.3.2. Анализ параметров фармакокинетики кофеина у здоровых добровольцев в зависимости от пола 71
3.3.3. Анализ параметров фармакокинетики кофеина у здоровых добровольцев в зависимости от курения 72
3.3.4. Анализ параметров фармакокинетики кофеина у здоровых добровольцев в зависимости от приема оральных контрацептивов 75
3.3.5. Анализ параметров фармакокинетики кофеина у здоровых добровольцев в зависимости от возраста и массы тела 78
3.3.6. Анализ параметров фармакокинетики кофеина у здоровых добровольцев в зависимости от наличия заболеваний печени и желчевыводящих путей 81
3.3.7. Анализ параметров фармакокинетики кофеина у психически больных пациентов 81
3.3.8. Анализ параметров фармакокинетики кофеина у психически больных пациентов в зависимости от пола 84
3.3.9. Анализ параметров фармакокинетики кофеина у психически больных пациентов в зависимости от курения, алкоголизма 86
3.3.10. Анализ параметров фармакокинетики кофеина у психически больных пациентов в зависимости от возраста и массы тела 90
3.3.11. Анализ параметров фармакокинетики кофеина у психически больных пациентов в зависимости от наличия заболеваний печени 94
3.3.12. Анализ параметров фармакокинетики кофеина у психически больных пациентов в зависимости от наличия других заболеваний 98
3.3.13. Анализ параметров фармакокинетики кофеина у психически больных пациентов в сравнении со здоровыми добровольцами 98
3.3.14. Анализ параметров фармакокинетики кофеина у психически больных пациентов в сравнении со здоровыми добровольцами в зависимости от пола 102
3.3.15. Анализ фармакокинетики кофеина в зависимости от активности ферментов 106
3.3.16. Анализ дозирования лекарственных средств, применяемых в терапии психически больных пациентов 117
3.3.17. Обсуждение клинических результатов 129
Выводы 135
Практические рекомендации 137
Список литературы 138
Приложение 162
- Варианты и методы применения фенотипирования по активности изоферментаСУР'гЧг
- Анализ дозирования лекарственных средств, применяемых в терапии психически больных пациентов
- Математическая модель процесса метаболизма кофеина и его первичных метаболитов и новый способ расчета специфической активности изофермента цитохрома Р450 1А2
- Анализ параметров фармакокинетики кофеина у здоровых добровольцев в зависимости от курения
Введение к работе
Одним из основных фармакокинетических процессов, определяющих индивидуальный фармакологический ответ, является метаболизм лекарственных средств. Изучение различных факторов, влияющих на метаболизм лекарственных средств, помогает повысить клиническую эффективность и безопасность проводимой терапии. Цитохромы Р450 (CYP 450) - суперсемейство ферментов, которые катализируют окислительный метаболизм различных химических веществ, включая большинство лекарств. Фенотипирование и генотипирование позволяют прогнозировать ответ на введение лекарственного средства, а, значит, повысить эффективность лечения и устранить нежелательные лекарственные реакции [6, 20].
Стандартные методы фенотипирования по активности изофермента CYP 1А2 включают определение концентрации кофеина, являющегося тест-субстратом изофермента цитохрома Р450 1А2, и его метаболитов в слюне, плазме и моче [74, 75, 76, 194]. Фенотипирование пациентов по активности CYP 1А2 используется для правильного дозирования лекарств, метаболизирующихся преимущественно в изоферменте 1А2.
В литературе для фенотипирования предлагают использовать различные отношения концентраций метаболитов к кофеину в разные промежутки времени [75], процентные отношения метаболитов [188], клиренс и константу элиминации кофеина [62, 194] а также расчет площадей под фармакокинетическими кривыми кофеина и его метаболитов [59]. Каждый из способов имеет свои недостатки и преимущества. Однако, в настоящее время не существует референтных параметров определения активности CYP 1А2, которые можно было бы использовать в качестве унифицированного стандарта при фенотипировании пациентов по активности изофермента CYP 1А2.
Решающую роль в успехе лечения пациентов с шизофренией играет правильно подобранная доза нейролептика. Лекарственные средства этой группы необходимо принимать длительно, часто пожизненно. Нейролептики
могут вызывать разнообразные нежелательные лекарственные реакции, снижающие приверженность больных к лечению, требующие замены лекарственного средства или назначения корригирующих средств, что повышает стоимость лечения, и в целом затрудняет продолжение антипсихотической терапии. Побочные эффекты нейролептиков, в свою очередь, носят дозозависимый характер [83, 158, 165].
Вариации дозирования оланзапина и клозапина напрямую зависят от активности изофермента CYP 1А2, что необходимо учитывать для определения оптимальной дозы, в особенности при совместном назначении с другими средствами, которые могут ингибировать или индуцировать этот изофермент [59І 97, 164, 176, 197], а также дифференцировать дозирование с учетом возраста, пола и индивидуальной чувствительности пациентов.
Цель исследования
Разработать методы фенотипирования и прогнозирования риска развития побочных эффектов антипсихотической терапии у больных шизофренией.
Задачи исследования
Разработать новую, специфичную и чувствительную методику высокоэффективно-жидкостного хроматографического анализа (ВЭЖХ) для количественного определения кофеина и четырех его метаболитов по I фазе в плазме крови и в слюне.
Разработать новый метод расчета активности изофермента цитохрома Р450 1А2.
Изучить активность изоферментов цитохрома Р450, участвующих в метаболизме кофеина, у здоровых добровольцев в зависимости от индивидуальных характеристик.
Изучить активность изоферментов цитохрома Р450, участвующих в метаболизме кофеина, у больных шизофрении в зависимости от
индивидуальных характеристик и переносимости нейролептической терапии.
Объект и методы исследования
Фенотипическое исследование активности изоферментов цитохрома
Р450, метаболизирующих кофеин, проведено у 96 здоровых добровольцев и у
103 психически больных пациентов. В работе были использованы методы
высокоэффективно-жидкостного хроматографического анализа,
математического моделирования, компьютерного программирования, статистической обработки результатов.
Личный вклад автора
Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора. Разработка теоретических основ изучения активности изоферментов цитохрома1 Р450, метаболизирующих кофеин выполнена лично под руководством профессора Л.Е. Зиганшиной. Автором лично выполнены разработка и усовершенствование метода определения кофеина и его первичных метаболитов в слюне и плазме с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, проведено изучение фенотипической вариабельности активности изоферментов цитохрома Р450, метаболизирующих кофеин, у 96 здоровых добровольцев и у 103 психически больных пациентов, проведено исследование результатов кофеинового теста в оценке переносимости нейролептической терапии у больных шизофренией, в т.ч. расчет лекарственной нагрузки психотропных средств.
Научная новизна полученных результатов
Разработана новая методика высокоэффективной жидкостной хроматографии для одновременного количественного определения кофеина и четырех его первичных метаболитов в плазме крови и в слюне.
Разработана математическая модель метаболизма кофеина и его первичных метаболитов, позволяющая рассчитать константу скорости образования первичных метаболитов кофеина. Предложен специфический маркер активности изофермента CYP 1А2 - константа скорости I порядка образования параксантина.
Проведено обследование здоровых добровольцев и психически больных пациентов по активности изофермента цитохрома Р450' 1А2 с использованием нового метода фенотипирования.
Разработан новый метод прогнозирования риска развития нежелательных лекарственных реакций, вызванных приемом нейролептиков, по результатам фенотипирования больных шизофренией по активности изоферментов цитохрома Р450, метаболизирующих кофеин. Среди больных шизофренией по результатам кофеинового теста выделены группы чувствительных и устойчивых пациентов по отношению к побочным эффектам нейролептической терапии.
Научно-практическая значимость и реализация результатов работы
Разработанная методология позволяет повысить безопасность
антипсихотической терапии, обосновывая необходимость
дифференцированного подхода к назначению и правильному дозированию субстратов изофермента цитохрома Р450 1А2 на основе оценки окислительной способности печени по отдельным изоферментам. Результаты исследования внедрены в практику Республиканской клинической психиатрической больницы им. В.М. Бехтерева Минздрава Республики Татарстан. Основные положения работы используются в> учебном процессе на кафедре клинической фармакологии и фармакотерапии Казанской государственной медицинской академии.
Основные положения, выносимые на защиту
Новая улучшенная методика ВЭЖХ анализа позволяет одновременное определение кофеина и четырех его метаболитов по I фазе в плазме крови и в слюне.
Константа скорости образования параксантина является специфичным маркером активности изофермента цитохрома Р450 1А2.
Кофеиновый тест позволяет выделить группы больных шизофренией, различающихся по переносимости нейролептической терапии: медленные метаболизаторы - с высоким риском развития побочных эффектов, быстрые метаболизаторы - с низким риском развития побочных эффектов.
Апробация результатов работы
Материалы работы представлены и обсуждались на I конференции "Качественное использование лекарств и фармаконадзор" с международным участием, приуроченной к 20-летию основания кафедры клинической фармакологии и фармакотерапии КГМА (Казань, 2005 г.), на III съезде фармакологов России "Фармакология - практическому здравоохранению" (Санкт-Петербург, 2007 г.), на научно-практических конференциях молодых ученых КГМА (Казань, 2007-2008 гг.), всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые в медицине" КГМУ (Казань, 2007 г.) и на заседаниях общества фармакологов и клинических фармакологов г. Казани и Республики Татарстан.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 2 статьи опубликованы в ведущих научных рецензируемых журналах, определенных ВАК.
Варианты и методы применения фенотипирования по активности изоферментаСУР'гЧг
Наиболее важные изоферменты цитохрома Р450, участвующие в метаболизме атипичных нейролептиков - это CYP ЗА, CYP 2D6 и CYP 1А2. Изофермент цитохрома Р450 1А2 метаболизирует 70% клозапина [59, 97, 80, 164, 172, 176, 197]. Другие изоферменты (CYP 2D6, CYP 2С9, CYP 2С19 и CYP ЗА) в меньшей степени участвуют в метаболизме клозапина [157]. Метаболизм оланзапина также осуществляется, в основном, изорментом CYP 1А2 [69]. Клинические исследования предлагают [74, 197] корреляции 0,7 - 0,8 между уровнями оланзапина и индексами активности CYP 1А2. В меньшей степени в метаболизме оланзапина участвуют CYP 2D6 и флавин-содержащая монооксигеназа. Фенотипирование пациентов по активности CYP 1А2 также используется для правильного дозирования других лекарств, метаболизирующпхся преимущественно в изоферменте 1А2, например, антиаритмик 1В класса - мексилетин [144], трициклические антидепрессанты - амитриптилин и имипрамин [146, 191, 209, 229], флувоксамин [136, 144], рилузол - препарат, для лечения бокового амиотрофического латерального склероза [219], центральный миорелаксант - тизанидин [116], антигипертензивные средства - пропранолол [209], верапамил [214], местные анестетики - лидокаин [174], ропивакаин [116, 136] и др. В литературе показано, что активность изофермента 1А2 повышена у курящих по сравнению с некурящими [76, 100, 135, 202]. У женщин, принимающих оральные контрацептивы, активность изофермента 1А2, наоборот, снижена относительно не принимающих эти препараты [39, 74, 173]. У детей активность CYP 1А2 повышена [7, 22], а у пожилых находится на нижней границе нормы или снижена1 [4, 22, 159, 194]. Фенотипирование полных и худых добровольцев не выявляет существенных различий) [71]. Большое количество исследований проведено у лиц с заболеваниями печени различного генеза [13, 93, 133, 134, 181, 193, 194, 198, 226]. Все они показывают значительное ингибирование изоферментов системы цитохромов Р450. Также фенотипирование по активности изофермента системы цитохрома Р450 1А2 применяется у лиц с различными группами заболеваний, такими как сахарный диабет 1 и 2 типов [163], болезнь Альцгеймера [103], болезнь Паркинсона [104], алкоголизм [135] и т.д. Измерение активности изофермента 1А2 также применяется для выявления снижения или увеличения активности изофермента, вызванных генетическим полиморфизмом [27, 127].
Множественный аллелизм или повышенная экспрессия генов могут приводить к повышению скорости элиминации лекарственного средства, а наличие дефектных аллелей, в свою очередь, может вызывать замедление метаболизма [1, 34, 52, 190]. Стандартные методы фенотипирования по активности изофермента CYP 1А2 включают определение концентрации кофеина и его метаболитов в слюне, плазме и моче [74, 81, 99, 194]. Другим вариантом является кофеиновый дыхательный тест с использованием нерадиактивного стабильного изотопа углерода С13 на метильной группе кофеина в положении, который подвергается З-Ы-деметилированию исключительно изоферментом цитохрома Р450 1А2. Для идентификации изотопа С 3 в выдыхаемом пациентом воздухе применяется метод газовой хроматографии-масс-спектрометрии [177]. Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью, однако доступность метода ограничена высокой стоимостью оборудования и меченого кофеина и дефицитностью изотопного сырья. Кроме того, некоторые1 группы» обследуемых, например, маленькие дети (до 5 лет), психически больные или ослабленные пожилые пациенты не могут правильно выполнять инструкции по выдыханию воздуха, вследствие чего, из-за малого объема выдыхаемого воздуха точность метода существенно снижается. В настоящей работе нам бы хотелось уделить внимание методам фенотипирования по активности изофермента 1А2, предполагающим определение кофеина и параксантина в биологических жидкостях. Обследуемым предлагаются либо низкие дозы кофеина (80-250 мг), либо средние дозы кофеина (300-400 мг) [203] в растворе, ВіТаблетках, в чашках черного кофе. Для расчета фармакокинетических параметров кофеина чаще используется однокамерная модель с всасыванием при внесосудистом введении субстрата [74, 93, 181, 193, 194, 198]. Определяют основные фармакокинетические параметры кофеина: константу абсорбции [59, 124], константу элиминации [124, 133], общий клиренс [124, 181, 194, 210], период полувыведения [181, 194, 229], биодоступность [16, 124], объем распределения [74, 124, 210, 232], максимальную концентрацию и время достижения максимальной концентраци [74], площадь под фармакокинетической кривой кофеина [159, 208] и его метаболитов [232]. Известно, что кофеин на 78±11% метаболизируется по пути параксантина [87, 107]. Именно поэтому очень часто в литературе предлагается использовать такие параметры как константа элиминации [133], клиренс [93, 99, 133, 134], период полувыведения кофеина [74, 104, 133] и площадь под фармакокинетической кривой кофеина [74, 159] в качестве маркеров активности изофермента 1А2.
Однако это не совсем верно, т.к. эти параметры отражают все процессы выведения кофеина, включая метаболизм кофеина, межкамерный обмен, экскрецию в неизменном виде. Для точного фенотипирования именно по активности CYP 1А2 необходимо вычленение реакции образования параксантина из кофеина из всей совокупности реакций его биотрансформации. Поэтому, очевидно, что простое описание параметров фармакокинетики кофеина не позволяет относить результаты только к активности изофермента 1А2. Часто применяемым, хорошо описанным в литературе методом, является расчет площади под фармакокинетической кривой (AUC) параксантина и других метаболитов кофеина и вычисление процентного соотношения всех первичных метаболитов кофеина [59, 188, 193]. С помощью этого метода можно охарактеризовать процентное содержание метаболитов по отношению к их общему количеству, не оценивая при этом активность изофермента CYP 1А2. Наиболее правильным при этом считается использование метода расчета отношения площадей под фармакокинетическими кривыми параксантина к кофеину. Другим известным способом фенотипирования по активности изофермента 1А2 является расчет отношения концентраций метаболитов (ОМ) по пути параксантина:
Анализ дозирования лекарственных средств, применяемых в терапии психически больных пациентов
Для оценки влияния проводимой психотропной терапии на частоту развития побочных эффектов анализировали лекарственную нагрузку. Для стандартизации антипсихотической терапии использовали показатель суточной нейролептической нагрузки, выраженный в условных единицах хлорпромазинового эквивалента. Для каждого пациента за две недели до и две недели после исследования (1 месяц лечения) по истории болезни рассчитывали среднюю суточную нейролептическую нагрузку; за период наблюдения по истории болезни рассчитывали максимальную суточную нейролептическую нагрузку; максимальную суточную нейролептическую нагрузку, не вызвавшую побочных эффектов; минимальную суточную нейролептическую нагрузку, вызвавшую побочные эффекы. Пересчет дозы нейролептиков в условные единицы хлорпромазина проводили с использованием таблицы эквивалентных доз (приложение 17) [55, 63]. Анализировали также среднюю суточную дозу всех психотропных средств (в единицах DDD-УСД), определенных АТХ классификацией [50]. Для статистической обработки результатов использовали программу Statistica 7. Рассчитывали основные параметры статистического ряда. Установление статистической достоверности различий между результатами групп проводили по критерию Стьюдента. Сравнение эмпирического распределения с теоретическим проводили критерием Колмогорова-Смирнова и хи-квадрат тестом [33].
Условия хроматографирования Были воспроизведены условия хроматографирования, описанные в литературе, а также оригинальные методики. Условия хроматографирования муравьиная кислота. В конце каждого дня работы колонка промывалась смесью метанола с ацетонитрилом (1/1) при скорости потока 0,2 мл/мин в течение 12 часов. Для каждой из методик (табл. 3.1.) были построены калибровочные графики в координатах высота пика-концентрация для стандартных растворов шести определяемых веществ в пределах концентраций от 1 до 20 мкмоль/л (п=7). Во всех случаях получены прямые с коэффициентом корреляции ґ 0,99. Другие параметры в таблицах 3.1.2. и 3.1.3. К 300 мкл плазмы или слюны добавляли 100 мкл 10 мкмоль/л раствора внутреннего стандарта (7-р-гидроксиэтилтеофиллина). Далее образцы обрабатывали по одной из следующих методик. 1. Белки плазмы или слюны осаждали путем добавления 300 мкл ацетонитрила с метанолом (1/1) к 300 мкл образца [собственная методика]. 2. Белки плазмы или слюны осаждали путем добавления 300 мкл ацетонитрила к 300 мкл образца [60]. 3. Белки плазмы или слюны осаждали путем добавления 2% раствора цинка сульфата к 300 мкл образца [46]. 4. Белки плазмы или слюны осаждали путем добавления 100 мкл 1 mol/1 хлороводородной кислоты и 3 мл дихлорметана к 300 мкл образца [210]. 5. Белки плазмы или слюны осаждали путем добавления 12 мл 20% 2-пропанола в хлороформе к 300 мкл образца [124]. 6. Белки плазмы или слюны осаждали путем добавления 4 мл хлороформа/изопропанола и 120 мг аммония сульфата к 300 мкл образца [74, 81]. 7. Белки плазмы или слюны осаждали путем добавления 6 мл хлороформа/изопропанола(75/25) к 300 мкл образца. Полученную смесь перемешивали 10 сек в бленд ере [62]. Центрифугировали при 3500 об/мин в течение 15 мин. Супернатант выпарили досуха и сухой остаток растворяли в мобильной фазе. 15 мкл полученного образца ввели в ВЭЖХ колонку. Полученные хроматограммы имели следующий вид: значительного увеличения разрешения, т.е. лучшего определения веществ и увеличения высоты пиков.
Нами проведен сравнительный анализ различных экспериментальных условий хроматографирования кофеина, его метаболитов и внутреннего стандарта. В опытах варьировался состав, рН мобильной фазы, длина волны УФ-детектора, параметры элюции. Основные характеристики методик приведены в таблице 3.1.1. Результаты хроматографического определения кофеина, его первичных метаболитов и стандарта приведены в таблице 3.1.2. иЗ.1.3. Для наших требований (необходимость разделения шести веществ, параметры ВЭЖХ колонки, длина волны, параметры элюции) подобрана сложная трехкомпонентная мобильная фаза [методика 11], состоящая из 1% уксусной кислоты, метанола, ацетонитрила в объемном соотношении 84,3/8,8/6,9. Удовлетворительное разделение, скорость выхода и точность определения имели решающее значение. При длине волны 273 нм у кофеина наблюдается максимум поглощения. Абсорбция для кофеина и метаболитов в 2,5 раза выше при длине волны 273 нм, чем при длине волны 254 нм. Предел детектирования составлял 0,2 мкмоль/л для всех определяемых веществ. Данная методика подходит для рутинного определения кофеина и его первичных метаболитов. Исследование слюны (рис. 3.1.15.) может заменить исследование плазмы (рис. 3.1.16.), так как показана хорошая линейная корреляция между уровнем кофеина в крови и слюне при одновременном заборе образцов через определенные промежутки перорального приема кофеина (рис. 3.1.17.). О 2 4 б 8 10 12 14 16 18 20 концентрация кофеина в плазме, мкмоль/л Рисунок 3.1.17. Корреляционная связь между концентрациями кофеина в плазме и слюне. В литературе предлагаются различные варианты проведения первичной обработки биологического материала [46, 60, 62, 125, 210, 232] и экспериментальные условия хроматографирования кофеина, его метаболитов и внутреннего стандарта [43, 46, 60, 210, 225, 232]. Как следует из таблицы З.1.1., на скорость выхода веществ и степень разделения решающее влияние оказывает количество и состав органической фазы. Мобильные фазы №6, 7, описанные [60] и [194], состоят из ацетатного буфера и ацетонитрила (85/15). При данных условиях 1,3,7-триметилмочевая кислота, параксантин, теофиллин сливаются в один пик. В случае использования ацетонитрила вместо метанола [81], можно получить все шесть пиков, но время выхода веществ значительно удлиняется, например, кофеин определяется только на 36-ой минуте, при скорости потока мобильной фазы 2,0 мл/мин (рис. З.1.1., 3.1.6., 3.1.7.).
При использовании только метанола, без добавления ацетонитрила, пики уширяются и снижаются (табл. 3.1.2.). Ацетонитрил ускоряет выход кофеина и его метаболитов, а метанол, в свою очередь, способствует лучшему разделению этих веществ. Следовательно, для лучшего результата нужно использовать в органическом компоненте как метанол, так и ацетонитрил, т.е. мобильная фаза должна быть трехкомпонентной. Здесь необходимо отметить то обстоятельств, что чем больше количество органического компонента, тем выше скорость выхода веществ из колонки. Например, мобильная фаза №10 близка по количественному и качественному содержанию к мобильной фазе №11. Эта незначительная разница в составах хотя и предполагает укорочение времени выхода веществ в мобильной фазе №10, но сказывается на разделении пиков 1,3,7-триметилмочевой кислоты и внутреннего стандарта (рис. 3.1.10., 3.1.11.). Точно такую же картину можно наблюдать при сравнении мобильных фаз №12 и 14 (рис. 3.1.12., 3.1.14.). При количественном и качественном варьировании органического состава мобильных фаз времена удерживания и порядок выхода исследуемых веществ изменяются. Если трехкомпонентная фаза содержит больше метанола, чем ацетонитрила, или равное с ним количество (методики №10,11,12,13,14), то вещества выходят в следующем порядке: теобромин, параксантин, теофиллин, 1,3,7-триметилмочевая кислота, 7-(3-гидроксиэтилтеофиллин, кофеин. В мобильной фазе №9 содержание ацетонитрила превышает содержание метанола, и порядок выхода веществ изменяется: первым также выходит теобромин с теофиллином, за ними идут параксантин с 1,3,7-триметилмочевой кислотой, затем внутренний стандарт и кофеин. Похожие изменения можно наблюдать в двухкомпонентных мобильных фазах, например, мобильная фаза №3 содержит метанол, а №4 -ацетонитрил, и это оказывает решающее влияние на местоположение метаболитов кофеина и внутреннего стандарта (рис. З.1.З., 3.1.4.). Водная фаза должна иметь слабокислую реакцию. Для этого используют ацетат аммония, ацетат натрия, фосфатный буфер, уксусную кислоту. Для сравнения, мобильные фазы №2 и 3 имеют одинаковое соотношение компонентов органической фазы, но разный состав водной фазы. Это различие не оказывает существенного влияния на общее время
Математическая модель процесса метаболизма кофеина и его первичных метаболитов и новый способ расчета специфической активности изофермента цитохрома Р450 1А2
Для описания динамики концентрации тест-субстрата в биологических жидкостях применяют математические модели. Нами предложена схема метаболизма кофеина в виде набора последовательных и параллельных реакций первого порядка в рамках двухкамерной модели с всасыванием (рисунок 3.2.1.). Рисунок 3.2.1. Схема двухчастевой модели фармакокинетики кофеина при внесосудистом введении препарата. 1,3,7Х(0) - текущие концентрации кофеина в месте введения кофеина, 1,3,7Х(1) - концентрации кофеина в крови и быстро обменивающихся с плазмой тканях, 1,3,7Х(2) - в других тканях; k0i - константа скорости абсорбции (всасывания) кофеина, к_і,з,7х -сумма констант скорости параллельных реакций элиминации кофеина, кроме образования параксантина (ki 7Х) и межкамерного обмена (ki2 и k2i); k_i;7x -сумма констант скорости всех параллельных реакций элиминации параксантина.
Из рисунка 3.2.1. очевидно, что константа образования параксантина (k,jx) характеризует именно реакцию образования параксантина из кофеина, т.е. является специфическим маркером активности изофермента 1А2. Для вычисления константы скорости I порядка образования параксантина из кофеина мы предлагаем использовать метод решения системы дифференциальных уравнений, описывающих кинетику последовательных реакции образования параксантина. В общем виде кинетика метаболизма кофеина описывается системой обыкновенных дифференциальных уравнений первого порядка: Кинетика фрагмента метаболизма кофеина по пути параксантина описывается уравнением (3): Решение системы уравнений (1)-(3) приводит к трансцендентным уравнениям сложного вида, аналитическое решение которых не представляется возможным. Поэтому было решено ограничиться расчетом кинетических параметров реакций образования-элиминации параксантина. В случае если k])7x7 k-i,7x интегрирование уравнения (3) при начальных условиях, /=0: [1,3,7Х(1)]=0, [1,7Х]=0, дает Численное решение по уравнению (4) для экспериментальных значений концентраций [1,7Х] и [1,3,7Х(1)] позволяет непосредственно определить kl,7X Из уравнения (4) также видно, что отношение концентраций параксантина к кофеину - величина переменная, экспоненциально зависящая от времени и от индивидуальных особенностей метаболизма (kj;7x и k.i)7X ) Нами [А.А. Филимонова, JI.E. Зиганшина, А.А Чичиров] разработан пакет прикладных программ для автоматизации фармакокинетических расчетов с использованием ЭВМ, включающая в себя: 1. Программу первичной обработки данных с получением фармакокинетических кривых; 2. Программу численного определения константы образования параксантина (k)i7x); 3. Программу расчета всех фармакокинетических параметров субстрата и первичных метаболитов и составления отчета.
Первый раздел программы предназначен для ввода экспериментальных данных, их коррекции и записи в память ЭВМ. Могут быть введены весовые коэффициенты концентрации и стандартные ошибки их измерения. Информация об эксперименте включает в себя также дату его проведения, фамилию обследуемого, названия препарата, его дозу, способ применения, исследуемый биологический материал. Предусмотрен специальный раздел программы для исправления замеченных ошибок после окончания процедуры ввода. Имеется возможность записи данных на диск для долговременного хранения. Однажды записанные данные могут быть затем многократно обработаны различными пользователями и с различными подходами. Следующие разделы системы предназначены непосредственно для получения кривой "концентрация-время" и выделения параметров, характеризующих отдельные фармакокинетические процессы, тогда как ход фармакокинетической кривой характеризует одновременное протекание всех фармакокинетических процессов. На данном этапе происходит вычисление фармакокинетических параметров кофеина, наилучшим образом описывающих экспериментальные данные и константы образования параксантина. Все вычисления производятся на основании математической модели метаболизма кофеина, заложенной нами в основу расчетов. В программе предусмотрено графическое изображение фармакокинетических кривых кофеина и его метаболитов в координатах концентрация-время (рисунок 3.2.2.) и в полулогарифмических координатах (рисунок 3.2.3.). Результаты математической обработки экспериментальных данных представлены в виде сплошных линий.
Анализ параметров фармакокинетики кофеина у здоровых добровольцев в зависимости от курения
Выявлено статистически достоверное различие между курящими (М=2,63) и некурящими (М=ЗД6) здоровыми, не принимающими лекарств добровольцами по рк х (р=0,003) (рисунок 3.3.6., приложение 12). Однако по константе элиминации кофеина между этими группами достоверного различия нет (р=0,144), также как и по периоду полувыведения кофеина (р=0,19), и по значениям удельного клиренса (р=0,06) (приложение 12). Интересно, что количество кофеина, подвергшегося метаболизму достоверно (р=0,001) выше у курящих (М=99 %) по сравнению с некурящими (М=85 %) (рисунок 3.3.7., приложение 12). Статистически достоверное различие между курящими и некурящими установлено для мужчин по отрицательному логарифму константы образования параксантина рких (р—0,01) (рисунок 3.3.8., приложение 12). Для женщин это различие не обнаружено, что, возможно, связано с малым количеством обследованных курящих женщин (табл. 3.3.1, приложение 12). Существует статистически достоверное различие между женщинами, принимающими оральные контрацептивы (ОК) и не принимающими по отрицательному логарифму константы образования параксантина (р 0,001) и по константе элиминации параксантина (р=0,02) (рисунок 3.3.9., приложение 12). оральные контрацептивы женщинами по константе элиминации кофеина (р=0,08), а также по периоду полувыведения кофеина и удельному клиренсу кофеина (приложение 12).
Количество кофеина, подвергшегося метаболизму достоверно (р=0,03) выше у женщин, не принимающих ОК (М=37%) по сравнению с женщинами, принимающими ОК (М=27%) (рисунок 3.3.10., приложение 12). Кажущаяся начальная концентрация кофеина и максимальная концентрация кофеина у женщин, принимающих оральные контрацептивы, превышали эти параметры для остальных женщин на 18% (р 0,001) и 13% (р=0,003), соответственно. Площадь под фармако кинетической кривой кофеина была достоверно больше (р 0,001) у женщин, принимающих ОК, (М=279,4) по сравнению с не принимающими ОК (М=174) (рисунок 3.3.11., приложение 12). Возраст добровольцев мужчин (М=35,1) и женщин (М=37,2) статистически значимо не различался (р=0,54). Масса тела мужчин (М=77,8 кг) статистически значимо (р=0,001) превышала массу тела женщин (М=62,8 кг) (приложение 2). Не выявлено достоверных различий между разными возрастными группами мужчин и женщин по отрицательному логарифму константы образования параксантина и по константе элиминации кофеина, также как и по удельному клиренсу, периоду полувыведения кофеина. Различий в разных весовых категориях по этим параметрам также не установлено (приложения 4,5). Мы провели дополнительно сравнение разных возрастных групп и разных весовых категорий мужчин и женщин по объему распределения и удельному объему распределения кофеина, площади под фармакокинетической кривой кофеина, кажущейся начальной концентрации кофеина и максимальной концентрации кофеина, проценту метаболизма кофеина (приложения 4-7). У мужчин выявлено: различие по удельному объему распределения кофеина между возрастными группами младше 40 лет и старше 40 лет вкл. и младше 60 лет (р=0,04) - 0,72 л/кг и 0,55 л/кг, соответственно (рисунок 3.3.13., приложение 5). различие по удельному объему распределения кофеина между группами с массой тела больше 60 кг вкл. и меньше 80 кг и больше 80 кг вкл. (р=0,007) - 0,76 л/кг и 0,58 л/кг, соответственно (рисунок 3.3.14., приложение 7). различие по количеству кофеина, подвергшемуся метаболизму, между группами с массой тела больше 60 кг вкл. и меньше 80 кг и больше 80 кг вкл. (р=0,02) - 96% и 91%, соответственно (рисунок 3.3.15., приложение 7).
Таким образом, полученные результаты не показывают достоверных изменений метаболизма кофеина между разными возрастными группами и группами, разделенными по массе тела, добровольцев мужчин и женщин, хотя дополнительные фармакокинетические параметры выявляют различия в процессах абсорбции, распределения и биотрансформации в целом между сравниваемыми группами. Нами не установлено достоверных различий между группами добровольцев, перенесших острый гепатит А в детстве и без заболеваний печени как по отрицательному логарифму константы образования параксантина (р=0,44), так и по константе элиминации кофеина (р=0,968). Также нет достоверного различия между добровольцами с хроническим холециститом и без заболеваний печени по отрицательному логарифму константы образования параксантина (p=0,443) и по константе элиминации кофеина (р=0,319) (приложение 12). Нами выполнено обследование психически больных пациентов с диагнозом шизофрения, принимающих атипичные нейролептики (клозапин, оланзапин). Отбор пациентов для участия в исследовании зависел от сохранности интеллекта (необходимость строго выполнять инструкции исследования) и не зависел от национального признака. Все статистические и биометрические параметры пациентов представлены в таблице 3.3.2.
