Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Современные методы терапии онкологических заболеваний: ограничения и перспективы развития 14
1.2. Роль иммунной системы в контроле за ростом опухоли. Возможность применения иммуномодулирующих воздействий в комплексной терапии рака 18
1.3. Побочные эффекты химиопрепаратов и способы их коррекции 21
1.3.1. Основные ограничения применения противоопухолевых препаратов 21
1.3.2. Свободные радикалы — основные медиаторы токсических реакций. Способы коррекции иммуно- и миелосупрессии 24
1.3.3. Основные побочные эффекты циклофосфана 27
1.3.4. Влияние цитостатических препаратов на печень.
Гепатопротскторные средства в терапии злокачественных опухолей 29
1.4. Преимущества растительных препаратов, использующихся в комплексной терапии рака 34
1.5. Лохеин и эплир - гепатопротекторные средства природного происхождения
Предпосылки их использования в комплексной терапии злокачественных опухолей 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Экспериментальные животные 41
2.2. Модели злокачественного роста и клеточные линии 42
2.3. Характеристика препаратов 43
2.4. Методы экспериментальной онкологии 45
2.5. Определение функциональной активности иммунокомпетентных клеток 46
2.5.1. Получение клеток-эффекторов 46
2.5.2. Методы оценки функциональной активности клеток 47
2.6. Статистическая обработка результатов 52
Глава 3. Результаты исследований 53
3.1. Гепатопротекторы в комплексной терапии злокачественных новообразований 53
3.1.1. Влияние лохеина и эплира на эффективность цитостатической терапии экспериментальных опухолей 53
3.1.2. Влияние гепатопротекторов в режиме монотерапии на рост и метастазирование экспериментальных опухолей 58
3.1.3. Влияние гепатопротекторов на образование метастазов в печени 61
3.1.4. Влияние гепатопротекторов на метастазирование карциномы легких Льюис при удалении первичного опухолевого узла 62
Заключение по главе 3.1 63
3.2. Влияние гепатопротекторов на показатели системы иммунитета у мышей при комплексной терапии экспериментальных злокачественных опухолей 65
3.2.1. Влияние гепатопротекторов на морфофизиологические показатели органов иммунитета при терапии опухолей 65
3.2.2. Влияние лохеина и эплира на состояние системы иммунитета у мы шей-опухоле носителей 74
3.2.3. Влияние гепатопротекторов на развитие карциномы легких Льюис в условиях введения каррагенана 76
Заключение к главе 3.2 79
3.3. Влияние гепатопротекторов на показатели системы иммунитета у мышей с иммунодепрессией, вызванной циклофосфаном 81
3.3.1. Влияние гепатопротекторов на клеточность органов иммунитета при введении циклофосфана 81
3.3.2. Влияние гепатопротекторов на пролиферативную активность спленоцитов при введении циклофосфана 86
3.3.3. Влияние гепатопротекторов на продукцию антител при введении циклофосфана в высоких дозах 89
3.3.4. Влияние гепатопротекторов на хемилгоминесценциго перитонеальных макрофагов при действии циклофосфана 93
Заключение к главе 3.3 95
3.4. Иммунотропное действие гепатопротекторов 97
3.4.1. Влияние лохеина и эплира на морфо-физиологические параметры органов иммунитета 97
3.4.2. Влияние гепатопротекторов на показатели активности эффекторов клеточного звена иммунной системы 98
3.4.3. Влияние лохеина и эплира на функциональную активность эффекторов системы естественной резистентности 101
Заключение по главе 3.4 105
Глава 4. Обсуждение результатов 107
Выводы 124
Список использованной литературы 126
- Свободные радикалы — основные медиаторы токсических реакций. Способы коррекции иммуно- и миелосупрессии
- Предпосылки их использования в комплексной терапии злокачественных опухолей
- Влияние лохеина и эплира на эффективность цитостатической терапии экспериментальных опухолей
- Влияние гепатопротекторов на продукцию антител при введении циклофосфана в высоких дозах
Введение к работе
Актуальность работы.
На современном этапе развития онкологии возможности дальнейшего повышения эффективности лечения путем монотерапии злокачественных опухолей традиционными методами (лекарственная и лучевая терапия, хирургическое вмешательство) практически исчерпаны. Для улучшения результатов лечения все чаще используются комбинации основных методов воздействия, разрабатываются принципиально новые подходы к лечению рака (фотодинамическая терапия, генотерапия, использование моноклональных антител и т.п.) (Хансон К.П. и др., 1996; Якубовская Р.И., 2000; Adam R., 2003; Cerosimo R., 2003; Барышников А.Ю., 2004). К сожалению, показатели общей онкологической смертности за последние десятилетия изменились незначительно. Даже возможность успешного лечения первичной опухоли не исключает гибели больного от метастазов, которые часто существуют уже на момент постановки диагноза (Новиков В.И. и др., 1999), и прогноз для больных местнораспространенными и метастатическими формами рака остается немногим лучше, чем 30 лет назад, несмотря на широкое использование химиотерапевтических средств (Хансон К.П. и др., 1996; Olivotto I. et а!., 2003).
В настоящее время химиотерапия стала неотъемлемым компонентом комплексного лечения многих злокачественных опухолей. Хотя существует ряд опухолей, при которых на сегодняшний день возможно полное излечение методами химиотерапии (хорионэпителиома матки, лимфогранулематоз, злокачественные опухоли яичка, острый лимфобластный лейкоз), в большинстве случаев ее резервов недостаточно для полной регрессии опухоли и эрадикации метастатических очагов, в связи с чем повышение эффективности цитостатического лечения является одной из актуальных проблем онкологии (Поддубная И.В., 1998; Переводчикова Н.И., 2001; Mamon Н. et аЦ 2005).
Принципы современной химиотерапии опухолей предполагают введение максимально переносимых доз цитостатиков с целью наиболее полного повреждения опухолевых клеток. Побочные эффекты цитостатической терапии - выраженная миелотоксичность, иммуносупрессия, гепатотоксичность - часто приводят к необходимости прекращения лечения и/или снижению доз противоопухолевых агентов (Богуш Т.А., Богуш Е.А., 1995; Mackali С. et al., 1995; Kirwan J. et al., 2003). Гепатотоксическое действие цитостатической терапии приводит, во-первых, к снижению ее эффективности в связи с ингибирующим влиянием на ферментные системы, способствующие проявлению специфической активности цитостатиков, во-вторых, к увеличению их токсичности вследствие снижения детоксицирующей функции печени (Богуш Т.А. и др., 2001; King P., Perry М., 2001; Jaeschke Н. et al., 2002). Ключевую роль в этих процессах играет монооксигеназная система печени, осуществляющая одновременно активирующую и детоксицирующую функции, при этом показано, что нарушение активности монооксигеназ часто наблюдается при онкологических заболеваниях. В исследованиях ряда авторов получены данные о том, что путем стимуляции монооксигеназ может быть достигнуто повышение эффективности противоопухолевой цитостатической терапии у больных с сопутствующими патологическими изменениями печени (Богуш Т.А. и др., 2000; Block К., Gyllenhaal С, 2002; Baldwin A. et al., 2003).
Гепатопротекторные средства широко применяются для лечения поражений печени различной этиологии. Несмотря на то, что перечень средств с гепатозащитным действием довольно внушителен (растительные полифенолы, препараты фосфолипидов, витамины, аминокислоты и т.д.), наибольшее распространение в терапии патологии печени занимают препараты, содержащие силимарин (легалон, карсил, силимар, силибор и др.) и фосфолипидные комплексы, среди которых лидером является эссенциале форте (Егоров В. А. и др., 1999).
Широкий спектр точек приложения препаратов природного происхождения предполагает возможность влияния на многие системы организма, контролирующие рост и метастазирование злокачественных опухолей (Немцова Е.Р. и др., 2002). Показано в частности, что препараты, содержащие силимарин, способны оказывать опухолепротекторное действие, ингибируя развитие новообразований, индуцированных химическими канцерогенами, при этом эффект обусловлен преимущественно антиоксидантными свойствами соединений (Zhao J., Agarwal R., 1999; Zhao J. et al., 2000; Manna S. et al., 1999; Zhu W. et al., 2001).
Иммуномодулирующее действие — обязательный компонент действия многих препаратов природного происхождения, при этом именно антиоксидантные свойства могут быть принципиально важными для восстановления нормального функционирования иммунокомпетентных клеток в условиях повреждающих воздействий, связанных с активацией процессов липопероксидации (рост опухоли, цитостатическая терапия, операционный стресс) (Олейник А.В., 1985; Пальмина Н.П., Бурлакова Е.Б., 1985; Афонина Г.Б. и др., 1998; Новоселова Е.Г. и др., 1998; Муфазалова Н.А., 2002). Существуют многочисленные сведения о том, что повышение эффективности цитостатической терапии препаратами растительного происхождения реализуется через вовлечение иммунологических механизмов (Пашинский В.Г., Яременко К.В., 1983; Иваницкая Л.П., Вядро М.М., 1989; Новиков В.И. и др., 1999; Гольдберг Е.Д., Зуева ЕЛ., 2000).
Все вышесказанное указывает на перспективность использования гепатопротекторных средств с антиоксидантной активностью для повышения эффективности цитостатической терапии злокачественных новообразований.
Учеными Сибирского медицинского университета и Института химии нефти ТНЦ СО РАН разработаны и изучены оригинальные гепатопротекторы лохеин — экстракт солянки холм о вой и эгшир - экстракт полярных липидов высокоминерализованных озерных отложений (Саратиков А.С. и др., 1990 а, б). Терапевтический эффект лохеина обусловлен комплексом биологически
активных веществ, важнейшими из которых являются глицинбетаин, флавоноиды, стерины и их гликозиды, каротиноиды, соли органических кислот, алкалоиды (Саратиков А.С. и др., 2000). Биологическая активность эплира связана с содержащимся в его составе комплексом фосфо- и сульфолипидов, каротиноидов, тиолов (Саратиков А.С. и др., 1995). Лечебно-профилактическое действие данных гепатопротекторов обусловлено собственными антирадикальными свойствами и способностью регулировать активность антиоксидантных факторов клеток, белковый, липидный и энергетический обмен. По эффективности терапевтического воздействия при повреждениях печени различной этиологии лохеин и эплир не уступают наиболее распространенным препаратам с гепатозащитньш действием (легалон, эссенциале), а по ряду показателей (например, защитное действие на нарушенную тетрахлорметаном антитоксическую функцию печени) превосходят их (Саратиков А.С. и др., 2000). На фоне интоксикации циклофосфаном лохеин и эплир снижают общую токсичность цитостатика, препятствуют развитию морфологических нарушений печени, в частности, некрозу гепатоцитов, нормализуют биохимические показатели (Саратиков А.С. и др., 2004). Оба препарата обладают способностью нормализовать либо повышать активность ферментов метаболической биотрансформации (цитохрома Р-450, глутатион-S трансферазы и др.) (Саратиков А.С, Венгеровский А.И., 1999). Получены данные о нормализующем влиянии гепатопротекторов на показатели системы иммунитета у животных с хроническим токсическим гепатитом (Венгеровский А.И. и др., 1988; ПеревозчиковаТ.В,, 2003).
Таким образом, в состав лохеина и эплира входит комплекс различных субстанций, обеспечивающий широкий спектр модулирующих и терапевтических эффектов этих препаратов. Полученные данные о прямом либо опосредованном через регуляцию ферментов биотрансформации антитоксическом действии, способности нормализовать липидно-белковьш и энергетический обмен, восстанавливать функции иммунокомпетентных
клеток являются многообещающими предпосылками для исследования перспективности применения указанных препаратов с целью повышения эффективности цитостатической терапии.
Целью работы явилась экспериментальная оценка способности лохеина и эплира повышать эффективность цитостатической терапии опухолей и изучение механизмов их биомодулирующей активности.
Задачи:
Изучить влияние гепатопротекторов лохеина и эплира на эффективность цитостатической терапии злокачественных опухолей в эксперименте.
Оценить противоопухолевое и антиметастатическое действие лохеина и эплира у мышей с перевиваемыми опухолями и их влияние на процесс послеоперационного метастазирования.
Исследовать влияние гепатопротекторов на функциональную активность иммунокомпетентных клеток у мышей с экспериментальными злокачественными опухолями.
4. Изучить способность лохеина и эплира модулировать действие
цитостатического агента циклофосфана на морфо-физиологические
показатели и функциональную активность клеток системы иммунитета.
5. Оценить влияние гепатопротекторов на формирование иммунного
ответа, функциональную активность лимфоцитов и макрофагов у здоровых
животных.
Научная новизна.
Впервые установлена способность гепатопротекторов лохеина и эплира повышать эффективность цитостатической терапии опухолей. Приоритет полученных данных подтвержден патентом РФ №2225720 от 20 марта 2004 г "Средство, повышающее противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана". На перевиваемых опухолях, метастазирующих в легкие и печень, показано умеренное антиметастатическое действие лохеина. Эплир ингибирует образование метастатических колоний в легких.
Оба изучаемых гепатопротектора ингибируют процесс послеоперационного метастазирования.
Установлено, что лохеин и эплир способны снижать токсическое действие высоких доз циклофосфана на клеточность тимуса и селезенки, модулировать пролиферативную активность лимфоцитов и развитие гуморального иммунного ответа на тимусзависимый антиген на фоне введения циклофосфана.
Показана способность лохеина и эплира нормализовать клеточность тимуса и селезенки, активность натуральных киллеров, пролиферативный ответ спленоцитов, нарушенные при росте злокачественных опухолей у мышеи. Изучаемые гепатопротекторые средства повышают цитостатическуго активность перитонеальных макрофагов мышей-опухоленосителей, что, по крайней мере частично, определяет антиметастатическую активность препаратов.
Полученные результаты о способности лохеина и эплира модулировать активность клеток системы естественной резистентности (макрофагов и натуральных киллеров) и пролиферативный ответ лимфоцитов дополняют существующие представления об иммунотропной активности данных препаратов.
Научно-практическая значимость.
В эксперименте на примере препаратов лохеин и эплир установлено, что гепато протекторные средства природного происхождения с антиоксидантной активностью могут использоваться в качестве агентов, повышающих эффективность терапии злокачественных опухолей. Полученные результаты позволяют рекомендовать проведение клинической апробации лохеина и эплира в комплексной терапии больных со злокачественными новообразованиями.
Представленные в работе данные об иммунотропной активности лохеина и эплира при их применении у интактных животных, у мышей с перевиваемыми опухолями, а также с иммунодепрессией, индуцированной
введением высоких доз цитостатика, свидетельствуют о целесообразности включения данных препаратов в комплексное лечение пациентов со сниженной иммунореактивностью и получающих препараты, обладающие иммуно- и гепатотоксичностью.
Положения, выносимые на защиту,
Гепатопротекторы лохеин и эплир способны повышать эффективность терапии злокачественных опухолей циклофосфаном.
Лохеин и эплир обладают умеренным собственным антиметастатическим действием, которое может реализоваться за счет повышения функциональной активности лимфоцитов, макрофагов, натуральных киллерных клеток опухоленосителей.
Лохеин и эплир способны снижать выраженность иммунодепрессии, вызванной введением противоопухолевого препарата циклофосфана в высоких дозах.
У здоровых животных лохеин и эплир модулируют функциональную активность лимфоцитов, макрофагов и натуральных киллеров.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на ежегодных отчетных конференциях молодых ученых НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН в 2002, 2003, 2004 гг, конференции, посвященной 70-летию биолого-почвенного факультета ТГУ (Томск, 2003), V конгрессе молодых ученых и специалистов "Науки о человеке" (Томск, 2004), V молодежной научной конференции СО РАМН "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" (Новосибирск, 2004), III съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, 2004).
Публикации, По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Получен патент на изобретение №2225720 от 20 марта 2004 г "Средство, повышающее противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана".
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов,
*
списка литературы, содержащего 235 источников, из них 119 иностранных. Работа проиллюстрирована 18 рисунками и 18 таблицами.
Свободные радикалы — основные медиаторы токсических реакций. Способы коррекции иммуно- и миелосупрессии
Иммунодепрессивное действие цитостатиков часто не сопровождаются выраженными клиническими симптомами. Угнетение иммунной системы характерно не для всех противоопухолевых агентов: значительным побочным действием обладают циклофосфан, метотрексат, меркаптопурин, незначительно иммунодепрессивное действие дакгиномицина. Следствием ослабления гуморальных и клеточных иммунных реакций является повышение восприимчивости больного к бактериальной, вирусной, грибковой инфекции и диссеминация существующей опухоли (Гершанович МЛ. и др., 1999).
Одними из универсальных агентов, обеспечивающих повреждающее действие цитостатических препаратов на опухолевые и нормальные клетки, являются свободные радикалы, способные оказывать мембранотоксическое, гепатотоксическое действие, запускать процесс апоптоза (Владимиров Ю.А., 1998; Lin Y. et al., 1999; Jaeschke H. et al., 2002). Показано, что опухолевая прогрессия и химиолучевая терапия вызывают резкое усиление свободнорадикальных процессов в организме, что является причиной развития токсикоза и иммунодефицитных состояний (Морозкина Т.С., 1986; Барабой В.А. и др., 1992; Михаевич О.Д., Горожанская Э.Г., 1994; Новоселова Е.Г. и др., 1998).
Патологические эффекты активных метаболитов кислорода обусловлены блокированием SH-групп ферментов и их инактивацией, гидроксилированием оснований ДНК и ее фрагментацией, активацией процессов перекисного окисления липидов и связанной с этим дестабилизацией клеточных мембран. Указанные процессы вызывают торможение репликации ДНК и, соответственно, угнетение пролиферативной способности в первую очередь быстроделящихся клеток, в том числе кроветворной и эпителиальной тканей (Зборовская И.А., Банникова М.В., 1995; Лебедев В.В., 2004).
Главным препятствием на пути каскадного радикалообразования является антиокислительное звено системы детоксикации. Разветвленная сеть физиологически активных антиоксидантов ферментативной и не ферментативной природы препятствует избыточной генерации свободных радикалов в мембранах клеточных элементов, в том числе и клеток иммунной системы.
При онкологических заболеваниях часто обнаруживается дефицит биоантиоксидантов и ферментов антиоксидантной защиты в организме. Это показано для больных гепатоцеллгалярным или холангиоцеллюлярным раком, а также у больных с метастазами в печень рака толстой кишки, надпочечника, почки, яичника и желчного пузыря (Mulder Т. et al., 1994; Вершинина С.Ф., Потявина Е.В., 2003; Giacomo С. et al., 2003). Например, у больных раком печени в крови отмечено снижение уровня биоантиоксидантов (витаминов А, Е, С), повышение содержания малонового диальдегида (Сагайдак И.В., 1994; Вершинина С.Ф., Потявина Е.В., 2003).
Несостоятельность антиоксидантной системы приводит к метаболическим нарушениям на уровне белоксинтезирующих процессов, сигнальных, адгезивных взаимодействий, что выражается в повреждении физиологических функций клеток. Эти токсические проявления могут способствовать прогрессированию злокачественного роста у онкологических больных на фоне цитостатической терапии (Feig D. et al., 1994; Богуш Т.А., Богуш Е.А., 1995; Seifried Н. et al., 2003). Поэтому сокращение токсических реакций и явлений недостаточности иммунной системы принципиально может быть достигнуто либо путем повышения активности компонентов естественной антиоксидантной защиты организма, либо введением лекарственных средств, содержащих антиоксиданты. Инактивация свободнорадикальных соединений экзогенными или эндогенными антиоксидантами позволяет восстановить количественные и функциональные показатели тех популяций клеток иммунной системы, которые обладают наибольшей чувствительностью к повреждающему действию активных форм кислорода (Prasad К. et al., 1999; Лебедев В.В., 2004).
Антиоксиданты часто включаются в схему противоопухолевой терапии (Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П., 1990; Немцова Е.Р. и др., 2003). В комплексном лечении злокачественных опухолей а-токоферол, аскорбиновая кислота, ретинол способны повышать эффективность противоопухолевой терапии. Так показано, что витамины А и С усиливают цитотоксическое действие 5-фторурацила и митомицина С, витамин Е повышает антибластомный эффект лучевой терапии и снижает ее побочное действие (Морозкина Т.С., 1986; Суколинский В.Н., 1990; Моисеенко B.C. и др., 1990; Prasad К. et al., 1999). Антиоксиданты способны и сами оказывать противоопухолевое действие: например, за счет ингибирования активности протеинкиназы С, фермента, задействованного в стадии промоции опухоли (Gopalakrishna R., Gundimeda U., 2002).
Антиоксидантами с антитоксическими свойствами, при использовании которых получены положительные эффекты в клинике, являются SH-содержащие соединения — тиолы. Показано, что унитиол значительно уменьшает токсичность высоких доз циклофосфана, приводя в результате к увеличению эффективности лечебного действия цитостатика. Защитное влияние соединения показано в отношении разных видов токсичности противоопухолевого агента: летального эффекта, желудочно-кишечной и гематологической токсичности (Экспериментальная онкология на рубеже веков, 2003).
Кроме синтетических соединений с антиоксидантной активностью, значительное место в комплексной терапии злокачественных опухолей занимают препараты растительного происхождения с антиоксидантной активностью (Пашинский В.Г., Яременко К.В., 1983; Пашинский В.Г., 1988; Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000). Более подробно о преимуществах использования аптирадикальных средств природного происхождения будет рассказано в разделе 1.4.
Таким образом, антиоксиданты способны повышать эффективность традиционных методов терапии рака, что связано в определенной степени со снижением токсических реакций, обусловленных усилением генерации свободных радикалов.
Предпосылки их использования в комплексной терапии злокачественных опухолей
Несмотря на эффективность использования гепатопротекторов в терапии заболеваний печени, арсенал лекарственных средств данной группы не слишком велик, поэтому представляют интерес новые оригинальные препараты — эплир и лохеин, созданные на кафедрах фармакологии и фармацевтической технологии Сибирского государственного медицинского университета совместно с НИИ химии нефти СО РАН.
Лохеин представляет собой экстракт солянки холм о вой (сухой и жидкий). Его гепатопротективный эффект обусловлен комплексом биологически активных веществ, важнейшими из которых являются глицинбетаин, флавоноиды, кетодикарбоновые кислоты, каротиноиды, стерингликозиды, высшие жирные кислоты, алкалоиды, около двух десятков микро- и макроэлементов (Саратиков А.С. и др., 2000).
Лохеин обладает выраженным гепатопротекторным влиянием при экспериментальном остром и хроническом гепатитах, вызванных введением ССЦ, парацетамола, аллилового спирта и D-галактозамина (Саратиков А.С. и др., 1990а). Лохеин тормозит образование диеновых конъюгатов, оснований Шиффа, мало нового диальдегида в микросомах и митохондриях печени, препятствует липолизу фосфатидилхолина гепатоцитов, предотвращает конверсию цитохрома Р-450 в метаболически инертный цитохром Р-420, нормализует сниженную при гепатите активность ферментов метаболизма ксенобиотиков (Саратиков А.С. и др., 1990а, 2000). Лохеин предотвращает гибель животных при токсическом гепатите, редуцирует его морфологические проявления (дискомплексацию печеночных пластинок, белковую и жировую дистрофию, некроз гепатоцитов) (Саратиков А.С. и др., 2000).
Терапевтический эффект лохеина преимущественно обусловлен антиоксидантным механизмом действия, что определяется различными составляющими компонентами препарата (стеринами, флавоноидами, каротиноидами).
Эплир представляет собой комплекс полярных липидов, выделенный из илового озерного осадка озер Западной Сибири. Биологическая активность эплира связана с наличием в нем фосфолипидов, сульфолипидов, специфических каротиноидных пигментов и тиолов (Венгеровский А.И. и др., 1988).
Эплир снижает структурно-метаболические нарушения при токсическом гепатите, улучшает антитоксическую функцию печени, повышая устойчивость цитохрома Р-450 к неблагоприятным воздействиям, стимулирует глюкуронирование билирубина (Саратиков А.С. и др., 19906; Венгеровский А.И. и др., 1999). В механизме действия эплира основное значение имеет улучшение барьерной и матриксной функций мембран гепатоцитов. Фосфолипиды, ксантофиллы и каротиноиды, входящие в состав эплира, являются сильными акцепторами алкильных и перекисных радикалов. Встраиваясь в мембраны гепатоцитов, они превращают гидроперекиси полиеновых жирных кислот в нетоксические оксикислота с обрывом цепей перекисного окисления липидов. При терапии эплиром отмечено ингибирование фосфолиполиза со снижением продукции лизофосфатидов и восстановлением нормального спектра фосфолипидов мембран. Более того, полиненасыщенный фосфатидилхолин эплира участвует в замещении молекул эндогенного фосфатидилхолина, поврежденных в результате перекисного окисления липидов и фосфолиполиза мембран клеток печени (Венгеровский А.И. и др., 1988; Саратиков А.С. и др., 19906).
Проведенные эксперименты по коррекции гепатотоксических эффектов циклофосфана, в том числе, на фоне острого гепатита, вызванного тетрахлорм етаном, показали, что лохеин и эплир снижали общую токсичность циклофосфана, повышая выживаемость экспериментальных животных. Показана способность гепатопротекторов нормализовать биохимические показатели: активность аминотрансфераз, содержание билирубина, соотношение белка, липидов и диеновых конъюгатов в крови. Отмечено также, что гспатопротекторы препятствовали развитию морфологических изменений в печени при действии циклофосфана: снижали некроз и клеточную инфильтрацию печени (Ратькин А.В., 2003; Саратиков А.С. идр.,2004). Обладая широким спектром фармакологической активности, лохеин и эплир оказывают влияние и на иммунную систему организма. Показано, что при терапии лохеином хронического токсического гепатита, вызванного воздействием тетрахлорметана, нормализуется число ядросодержащих клеток тимуса и перитонеапьного экссудата, естественная цитотоксичность клеток тимуса, количество антителообразующих клеток селезенки и число активных макрофагов, повышается количество В-лимфоцитов периферической крови. Активация фагоцитарной активности макрофагов при терапии лохеином способствует ликвидации очага воспаления. Также показано положительное влияние препарата на развитие гуморального иммунного ответа: лохеин стимулировал процесс распознавания антигена, формирование антителообразующих клеток и синтез специфических иммуноглобулинов. Эти эффекты проявлялись преимущественно в продуктивной фазе иммунного ответа (Перевозчикова Т.В., 2003).
Эплир также обладает иммунотропнои активностью: вызывает лейкоцитоз, повышает число В-лимфоцитов, стимулирует пролиферацию спленоцитов, снижает естественную цитотоксичность спленоцитов и клеток перитонеального экссудата. Под действием эплира в мононуклеарных клетках перитонеального экссудата происходит увеличение числа лизосом, повышается число антителообразующих клеток селезенки (Венгеровский А.И. и др., 1988).
В остром и хроническом эксперименте показано, что эплир и лохеин малотоксичны, лишены аллергизирующих, иммунотоксических, мутагенных, эмбриотоксических свойств (Саратиков А.С.и др., 2000, 2002).
Таким образом, эплир и лохеин являются высокоэффективными гепатопротекторами для патогенетически обоснованной фармакотерапии заболеваний печени, вызванных воздействием токсических агентов. В состав лохеина и эплира входит комплекс различных субстанций, обеспечивающий широкий спектр модулирующих и терапевтических эффектов этих препаратов. Полученные данные о прямом либоопосредованном через регуляцию ферментов биотрансформации антитоксическом действии, способности нормализовать липидно-белковый и энергетический обмен, восстанавливать функции иммунокомпетептных клеток являются многообещающими предпосылками для исследования перспективности применения указанных препаратов с целью повышения эффективности цитостатической терапии злокачественных новообразований.
Влияние лохеина и эплира на эффективность цитостатической терапии экспериментальных опухолей
После проведенного курса терапии гепатопротекторами и циклофосфаном количество лейкоцитов в периферической крови увеличилось на 60 - 80% по сравнению с группой мышей, получавших только цитостатик (рис. 7). Эплир, кроме того, вызывал увеличение содержания клеток на 4-е и 8-е сутки эксперимента (после первой и второй инъекций циклофосфана).
Таким образом, показатели клеточности тимуса и селезенки, подвергающиеся значительным изменениям при развитии опухоли и проведении противоопухолевого лечения, имеют тенденцию к нормализации при включении в курс терапии лохеина и эплира. Также отмечена способность гепатопротекторов увеличивать количество лейкоцитов в периферической крови при росте опухоли и проведении цитостатической терапии. Возможно, механизмом реализации данных эффектов является защита лимфоцитов тимуса и селезенки, а также клеток крови от повреждающего действия свободных радикалов, что может способствовать проявлению противоопухолевых реакций компонентов иммунной системы.
Результаты экспериментов, описанных в главе 3.1, свидетельствуют, что лохеин и эплир обладают умеренным антиметастатическим действием. Кроме того, нами показана способность гепатопротекторов модулировать вес и клеточность селезенки при росте опухоли и проведении противоопухолевой терапии (см. главу 3.2.1). Известно, что иммунная система играет значительную роль в регуляции метастазирования. Установленное иммунотропное действие лохеина и эплира (Венгеровский А.И. и др., 1988; Саратиков А.С. и др., 2000; Перевозчикова Т.В., 2003) позволяет предположить, что торможение процесса метастазирования может быть обусловлено влиянием гепатопротекторов на систему иммунитета.
Эксперименты по влиянию гепатопротекторов на функциональную активность иммунокомпетентных клеток были проведены на мышах с карциномой легких Льюис.
Так, у мышей с LLC отмечено снижение активности натуральных киллеров на 10% (по индексу мембранотоксичности), однако, за счет увеличения количества спленоцитов, вызванного ростом опухоли, суммарный литический потенциал селезенки увеличивался более чем в 2 раза по сравнению с группой безопухолевого контроля (табл. 12). При терапии опухоленосителей лохеином наблюдалось не только восстановление индекса мембранотоксичности до уровня животных без опухолевой патологии, но и некоторое превышение этого показателя. Курсовое введение эплира не вызывало значительных изменений активности натуральных киллеров. Суммарный литический потенциал селезенки, зависящий от мембранотоксического индекса и клеточности селезенки, при терапии гепатопротекторами повышался на 17 - 32% по сравнению с группой опухоленосителей, не получавших терапии (табл. 12).
Цитостатическую активность перитонеальных макрофагов оценивали по торможению пролиферации клеток мастоцитомы Р-815. Рост LLC значительно не изменял противоопухолевую активность макрофагов, при терапии гепатопротекторами мышей-опухоленосителей макрофагальная активность увеличивалась: лохеином - на 33%, эплиром - на 12% (табл. 12).
Рост злокачественных опухолей оказывает влияние и на функциональную активность лимфоидных клеток. В тестах in vitro для оценки пролиферативного потенциала лимфоцитов используют реакцию бласттрансформации. Стимуляторами пролиферативного ответа являются митогены, вызывающие поликлональную активацию отдельных популяций лимфоцитов. Данная реакция является моделью событий, происходящих in vivo в ответ на введение антигена (Манько В.М. и др.} 1994). При росте LLC нестимулированная пролиферация спленоцитов усиливалась почти в 3 раза, митоген-индуцированная (Л ПС и Кон А) - уменьшалась более чем в 2 раза по сравнению с показателями безопухолевого контроля (табл.13). При терапии опухоленосителей гепатопротекторами оба препарата вызвали снижение спонтанной пролиферации (лохеии - на 44%, эплир - на 39%), однако данный показатель оставался выше контрольного в 1,6 - 1,8 раза. Пролиферативный ответ В-лимфоцитов на ЛПС не изменялся при курсовом введении гепатопротекторов, а КонА-индуцированная пролиферация Т-клеток, сниженная при росте опухоли, увеличивалась в 1,4-2,1 раза и под влиянием эплира достигала уровня интактпых животных (табл.13).
Таким образом, развитие LLC на стадии сформированного опухолевого узла и метастатических очагов сопровождалось изменениями функциональной активности иммунокомпетентных клеток, причем как лимфоцитов, так и клеток системы естественной резистентности. Введение гепатопротекторов способствует нормализации спонтанной и КонА стимулированной пролиферации спленоцитов, повышению противоопухолевой активности макрофагов и натуральных киллеров, что, вероятно, вносит вклад в реализацию антиметастатического эффекта лохеина и эплира. в условиях введения каррагенана Изучение вклада макрофагов в обеспечение антиметастатического эффекта гепатопротекторов проводили на мышах-опухоленосителях с LLC. Для блокады активности макрофагов использовали каррагенан, препарат, который обратимо (на 24 ч) угнетает функционирование макрофагальных клеток (Гольдберг Е.Д. и др., 1992).
Влияние гепатопротекторов на продукцию антител при введении циклофосфана в высоких дозах
Показано, что блокада макрофагов, вызываемая каррагенаном, приводит к усилению роста первичной опухоли на 30% (рис. 8а). При включении в схему терапии гепатопротекторов выраженность данного эффекта не изменялась. Данные результаты свидетельствуют о роли макрофагов в регуляции роста первичной опухоли и отсутствии у гепатопротекторов иных механизмов влияния на развитие опухолевого узла. Стоит отметить, что сами гепатопротекторы не обладают способностью ингибировать развитие первичной опухоли (рис. 8а),
Макрофаги являются клетками, которые в разных условиях способны проявлять как антиметастатическую активность, так и усиливать рост вторичных очагов опухолевого роста (Громов С.А. и др.,1988; Суслов А.П., 1990; Duffie G., Young М., 1991). В наших экспериментах при блокаде данных клеток отмечено усиление образования метастазов в 1,8 раза. Лохеин и эплир на фоне введения каррагенана снижали интенсивность формирования метастатических колоний до уровня, характерного для опухоленосителей без терапии (рис. 86). Данный эффект предполагает наличие у гепатопротекторов механизмов действия, позволяющих препаратам на фоне усиления метастазирования, вызванного блокадой макрофагов, снижать интенсивность образования метастазов до уровня нелеченых опухоленосителей.
Стоит отметить, что при монотерапии карциномы Льюис эплир вызывает значимое торможение формирования метастатических колоний (рис. 86), что свидетельствует о необходимости наличия функционально активной популяции макрофагов для реализации его антиметастатического действия.
Площадь метастатических очагов при введении каррагенана увеличивается в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой опухоленосителей. Введение гепатопротекторов мышам с LLC, получавшим блокатор функциональной активности макрофагов, приводит к снижению суммарного размера метастазов до уровня животных, не получавших противоопухолевой терапии (рис. 8в), что свидетельствует о наличии у гепатопротекторов способности ингибировать рост вторичных опухолевых очагов за счет воздействия на эффекторы системы противоопухолевого надзора не макрофагалыюй природы.
При монотерапии карциномы легких Льюис лохеин и эплир ингибируют рост метастазов на 70% (рис. 8в). Вероятно, значительная доля данного эффекта обусловлена активностью макрофагов, поскольку при блокаде данной клеточной популяции максимально выраженный эффект при введении гепатопротекторов проявляется только в торможении развития метастазов до уровня опухоленосителей, не получавших терапии.
Таким образом, реализация антиметастатического действия лохеина и эплира, показанного на мышах-опухоленосителях с карциномой легких Льюис, частично зависит от функциональной активности макрофагальных клеток. Кроме того, способность гепатопротекторов ингибировать формирование и рост вторичных очагов опухолевого роста может быть обусловлена влиянием на другие эффекторные или регуляториые звенья системы противоопухолевого надзора (например, на клетки гранулоцитарной или лимфоидной природы).
Результаты экспериментов, представленные в данной главе, позволяют считать, что способность лохеина и эплира оказывать антиметастатическое действие при введении мышам с перевиваемыми опухолями может быть связана с их влиянием на функциональную активность иммунокомпетентных клеток.
Рост опухоли сопровождается изменениями в системе иммунитета: затронуты как морфологические показатели (вес и клеточность органов иммунной системы), так и эффекторные свойства клеток (макрофагов, натуральных киллеров, лимфоцитов).
Гепатопротскторы способны нормализовать вес и клеточность тимуса и селезенки. Однако данные эффекты не в одинаковой степени проявляются при терапии мсланомы В-16 и LLC. Возможно, усугубление опустошения тимуса лохеином и эплиром у мышей с меланомой связано с особенностями данной опухолевой модели, клетки которой обладают значительной иммуногенностью, Кроме того, установлено, что при росте меланомы В-16 наблюдается перераспределение популяций лимфоцитов из тимуса в селезенку (Shohat В. et al., 1984). Возможно, гепатопротекторы модулируют это перераспределение. Способность гепатопротекторов приводить к нормализации морфо-физиологического состояния тимуса и селезенки прослеживается и на фоне изменений в иммунной системе, вызванных хирургическим удалением опухоли. Иммуномодулирующее действие гепатопротекторов проявляется и в их влиянии на интенсивность пролиферативного ответа лимфоцитов: препараты снижают высокий уровень спонтанной пролиферации и увеличивают пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на митоген у мышей с LLC.
Активность клеток системы естественной резистентности (макрофагов и натуральных киллеров) у опухоленосителей повышается при терапии лохеином и эплиром. Следует отметить, что антиметастатическое действие гепатопротекторов однозначно связано с активностью макрофагов, поскольку гепатопротекторы теряли значительную часть своего антиметастатического потенциала при блокаде функциональной активности макрофагов каррагенаном.
Также показано, что гепатопротекторы могут влиять на показатели иммунной системы, измененные при цитостатической терапии злокачественных опухолей. В частности, предотвращать опустошение тимуса, способствовать нормализации состояния селезенки. Способность гепатопротекторов снижать выраженность токсических проявлений цитостатиков свидетельствует о целесообразности изучения влияния гепатопротекторов на функциональные показатели системы иммунитета у мышей, подвергшихся действию цитостатических агентов в высоких дозах.
