Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные подходы к коррекции осложнений противоопухолевой химиотерапии (обзор литературы) 11
1.1 Токсическое действие химиотерапии 12
1.2 Характеристика препаратов, применяемых для коррекции осложнений, вызываемых цитостатиками 23
1.3 Фармакологические эффекты лекарственных растений корректоров цитотоксического действия противоопухолевых препаратов- 30
ГЛАВА 2. Материалы и методы собственных исследований 41
2.1 Фармакологическая характеристика изучаемых средств 41
2.2 Модели исследования 45
2.3 Методы исследования 48
2.4 Метод статистической обработки результатов 56
ГЛАВА 3. Результаты исследования 57
3.1 Оценка токсикомодифицирующего действия настоя сбора растений 5 7
3.2 Определение психофизиологического статуса животных 74
3.3 Скрининговые исследования фармакологических эффектов настоев растений 76
3.4 Фармакологические эффекты настоя сбора растений 85
3.4.1 Изучение адаптогенных свойств 85
3.4.2 Оценка иммунотропной активности 91
3.4.3 Оценка гематологических показателей 99
3.4.4 Биохимические исследования крови 112
Заключение 125
Выводы 136
Список использованной литературы 138
Приложение 162
- Характеристика препаратов, применяемых для коррекции осложнений, вызываемых цитостатиками
- Определение психофизиологического статуса животных
- Фармакологические эффекты настоя сбора растений
- Биохимические исследования крови
Введение к работе
Актуальность проблемы. Значительное место среди методов лечения злокачественных новообразований занимает химиотерапия [70, 92, 102], которая часто сопровождается развитием побочных реакций в отношении нормальных активно пролиферирующих тканей [43, 95]. Наиболее часто встречается гематологическая (85-90 %) и гастроинтестинальная (до 90 %) токсичность [102]. Известно, что состояние органов кроветворения, состав и свойства крови отражают нарушения во всех тканях в условиях цитостатического воздействия [30]. Среди средств, предупреждающих повреждение нормальных тканей, дексразоксан влияет на сердце, месна - на -почки, ленограстим, филграстим, молграмостим, пегфилграстим, эритропоэтин - на систему кроветворения, апрепитант, ондансетрон, гранисетрон, трописетрон, триэтилперазин - на диспепсические расстройства [70, 129], амифостин обладает нейро-, нефро-, ото-, гематопротекторным действием [128, 214]. Узкая направленность корректоров цитотоксичности, наличие побочных эффектов или высокая стоимость ограничивают их применение - [70, 95, 187]. В качестве сопровождения химиотерапии иногда применяют растения, такие как алтей, береза, бессмертник, девясил, женьшень, зверобой, календула, крапива, одуванчик, подорожник, сушеница, шалфей, элеутерококк и др. [2, 55, 59, 111]. Показано, что растительные гистопротекторы обладают детоксикационными свойствами, включающими в себя противоопухолевый, противовоспалительный, иммуномодулирующий, мочегонный, желчегонный, гепатопротекторный, репаративный и др. эффекты [10, 55, 121], а также могут предупреждать повреждение молекул ДНК, корректировать нарушение ферментного гомеостаза клеток и ингибировать стимуляцию перекисного окисления липидов, вызванного цитостатиками [8, 31, 50, 155, 180]. Однако совместное применение химиотерапии с фитотерапией в настоящий момент ограничено. Это может быть связано с медленным развитием выраженного лечебного эффекта при применении одного растения или стимуляции опухолевого процесса при
использовании их большого числа (20 — 25 наименований). Не исключается возможность взаимодействия ряда растительных препаратов между собой, а также их взаимодействия с цитостатиками, приводя таким образом к изменению фармакокинетики последних и снижению их противоопухолевой активности [96, 212].
Среди большого числа растений, обладающих детоксикационными свойствами, можно выделить календулу лекарственную, подорожник большой и крапиву двудомную. Кроме перечисленных выше свойств, приводящих к детоксикационному эффекту, они нормализуют гемопоэз, оказывают защитное действие на пролиферирующие ткани (костный мозг, слизистую оболочку желудка и др.) [97], обладают антигипоксическим, антиоксидантным (крапива двудомная, календула лекарственная, подорожник большой) [65, 86] и адаптогенным эффектами (крапива двудомная, подорожник большой) [99]. Данных о применении сбора, содержащего только эти растения, не обнаружено. Однако известны сборы, в которых они присутствуют совместно с другими растениями. Если в состав сбора включены кроме этих растений зверобой, шалфей и ромашка, то такой настой сбора применяется при различных заболеваниях кожи [67], если девясил, шиповник, полынь обыкновенная, фасоль, эхинацея пурпурная («Гепапанкреафит — Р») — при хроническом панкреатите и гепатите в стадии ремиссии [96], а совместно со смородиной черной и душицей — для профилактики опухолевых заболеваний [79]. Вместе с тем, также не обнаружено сборов, включающих крапиву двудомную, календулу лекарственную, подорожник большой, применяемых в качестве корректоров цитотоксического действия противоопухолевых препаратов.
Известно, что циклофосфан и доксорубицин применяются при раке молочной железы, множественной миеломе, ходжкинских и неходжкинских лимфомах [195], циклофосфан - при ювенильном артрите, системной красной волчанке и других заболеваниях [151]. Вместе с тем, эти противоопухолевые препараты используют в эксперименте для
7 моделирования побочных эффектов [77, 97, 229]. Модельные комбинации цитостатиков со сбором растений позволят разрабатывать эффективные схемы включения последнего в противоопухолевую химиотерапию.
Цель исследования. Фармакологическое исследование настоя сбора растений, включающего подорожник большой {Plantago major L.), календулу лекарственную {Calendula officinalis L.) и крапиву двудомную {JJrtica dioica L.), в качестве детоксикационного средства, предупреждающего нарушения гематологических, регенерационных, иммунных, метаболических процессов, вызываемых противоопухолевыми препаратами.
Задачи исследования.
Проведение скрининга настоев листьев березы, крапивы двудомной, подорожника большого, цветков календулы, цветков и листьев липы, травы чабреца, отвара корней алтея лекарственного, а также экстрактов цетрарии исландской и овса посевного, их комбинаций между собой и с цитостатиками (модели гипоксии, реакция гемагглютинации) для подбора фармакологически активного настоя сбора растений.
Оценка адаптогенных свойств и иммунотропной активности циклофосфана или доксорубицина, примененных с настоем сбора, содержащего листья подорожника большого, цветки календулы лекарственной и листья крапивы двудомной в соотношении 2:2:1, и влияния этого комплекса на психофизиологический статус животных по сравнению с эффектами цитостатика.
Оценка токсикомодифицированного действия циклофосфана или доксорубицина при применении их с настоем сбора растений на морфофункциональные показатели (масса тела, тимуса и селезенки) и гистологическую картину органов (печень, легкие, сердце, почки, тимус, селезенка, желудок, надпочечники).
Оценка количественного и качественного состава элементов крови, вызванного противоопухолевыми препаратами при введении их с настоем сбора растений по сравнению с действием самих противоопухолевых препаратов.
8 5. Оценка влияния цитостатиков в комбинации с настоем сбора растений на биохимические показатели крови - содержание общего белка, активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), лактатдегидрогеназы (ДДГ), уровень антиоксидантной защиты (активность супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, количество тиоловых групп белков) и количество продукта перекисного окисления липидов (малоновый диальдегид (МДА)). Положения, выносимые на защиту.
Применение цитостатиков, усиливающих гипоксию, совместно с настоем сбора из листьев подорожника большого, цветков календулы лекарственной и листьев крапивы двудомной эффективно лимитирует её проявления. Наиболее выраженный антигипоксический эффект в этих условиях оказывает настой сбора из данных растений в соотношении 2:2:1 соответственно.
Настой сбора растений в соотношении 2:2:1 обладает адаптогенной активностью (усиливает работоспособность при первичных, повторных физических нагрузках, в условиях психоэмоционального стресса) и иммуномодулирующей активностью (лимитирует развитие реакции Артюса, усиливает функции В-лимфоцитов), нормализует морфофункциональные показатели (масса тела, тимуса, селезенки) и предупреждает повреждение клеток печени, вызванное циклофосфаном или доксорубицином.
Применение цитостатиков с настоем сбора растений уменьшает лейкопению, тромбоцитопению, анемию, количество незрелых форм нейтрофилов, нормализуя показатели лейкоцитарной формулы, гипопротеинемию, активность АЛТ, ACT и ЛДГ в плазме крови, повышает активность ферментов антиоксидантной защиты, что подтверждается снижением количества продуктов перекисного окисления липидов и повреждающего действия цитостатиков на мембраны эритроцитов.
Научная новизна. Впервые подобран сбор растений, включающий
листья подорожника большого, цветки календулы лекарственной и листья
крапивы двудомной в соотношении 2:2:1, настой которого, обладая
антигипоксической, антиоксидантной, иммуномодулирующей,
9 противовоспалительной, актопротекторной активностью, оказывает, таким образом, детоксикационное действие.
Применение модельных комбинаций циклофосфана или доксорубицина с настоем сбора растений с целью коррекции осложнений на органы (улучшал регенерационные процессы в печени, почках и селезенке) является эффективным приемом снижения токсического действия противоопухолевых препаратов.
Впервые показано, что настой сбора растений существенно снижал лейкопению, анемию и тромбоцитопению, препятствовал сдвигу лейкоцитарной формулы влево (увеличивал количество зрелых нейтрофилов и снижал количество миелоцитов и юных форм нейтрофилов), предупреждал нарушения проницаемости эритроцитарных мембран, нормализовал антителогенез, ограничивал развитие реакции Артюса и воспаления, а также препятствовал снижению массы лимфоидных органов и тела животных.
Впервые показано, что настой сбора растений уменьшал выраженность катаболического синдрома (увеличивалось количество общего белка в плазме), нарушения метаболических процессов (снижал активность АЛТ, ACT, ЛДГ), и повышал антиоксидантную защиту крови (СОД, каталаза, количество сульфгидрильных групп белков), снижая накопление МДА и проницаемость мембран клеток.
Практическая значимость работы. Разработан сбор растений, применение которого может являться эффективной детоксикационной мерой, предупреждающей гематологические нарушения (количественный и качественный состав крови, биохимические нарушения), вызванные применением циклофосфана или доксорубицина, и, вероятно, других противоопухолевых препаратов. Результаты работы по изучению возможности применения в комплексной терапии злокачественных новообразований настоев лекарственных растений могут служить основой для разработки новых высокоэффективных препаратов-корректоров побочных эффектов химиотерапии.
Материалы диссертации используются в учебном и лекционном материале Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии на дисциплинах фармакология и клиническая фармакология.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 4-ой Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005); на юбилейной конференции, посвященной 60-летию факультета промышленной технологии лекарств Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (Санкт-Петербург, 2005); на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006); на Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006, 2008); на конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2007); на III съезде фармакологов России: «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на региональной конференции студентов и аспирантов «Молодые ученые - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007); на научно-практической конференции «Фармация из века в век» (Санкт-Петербург, 2008); на V Конференции молодых ученых России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), на заседании общества фармакологов (Санкт-Петербург, 2008). На совместном межкафедральном заседании кафедры фармакологии, патологии и физиологии и лаборатории фармакологических исследований 30 декабря 2008 года.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 статьи в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, заключения и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 39 таблицами и 14 рисунками, библиографический указатель включает 230 источников, из них 122 отечественных и 108 иностранных.
Характеристика препаратов, применяемых для коррекции осложнений, вызываемых цитостатиками
Модификаторы биологических реакций. Названная группа препаратов объединяет разнообразные по свойствам, строению и происхождению средства, действие которых направлено как на опухолевые клетки, так и на различные регуляторные системы организма. Они влияют на восстановление или стимуляцию противоопухолевой резистентности, на усиление противоопухолевой эффективности терапии и ослабление ее токсического действия на организм [4, 116]. К модификаторам биологических реакций относятся большей частью иммуномодуляторы, которые способствуют уменьшению токсичности химиопрепаратов, сокращению сроков восстановления лейкоцитов, снижению заболеваемости от вирусных инфекций, а в ряде случаев - увеличению продолжительности ремиссии [47]. Иммуномодуляторы при онкологических заболеваниях применяют по нескольким основным показаниям: 1) В качестве средств для коррекции иммунологических и гематологических нарушений, возникающих после химиотерапии и облучения: имунофан [62], ликопид [117], полиоксидоний [91], глутоксим [37, 109], галавит [38], ронколейкин, лейкинферон, неовир, циклоферон, левамизол, миелопид, тактивин, тамерит, тимоген, тималин [70, 73]. Все они в той или иной степени могут оказывать корригирующее влияние на иммунитет у онкологических больных. Среди препаратов этой группы можно особо выделить иммуномодуляторы, которые, обладая антиоксидантными, дезинтоксикационными и мембраностабилизирующими свойствами, способны уменьшать токсические эффекты химиорадиотерпии: полиоксидоний, глутоксим, имунофан.
Некоторые препараты были специально разработаны как стимуляторы гемопоэза у онкологических больных и, несмотря на имеющиеся у них иммуномодулирующие свойства, в онкологии они используются как стимуляторы кроветворения. Это КСФ (ленограстим, филграстим, молграмостим, пегфилграстим) и препараты деринат, дезоксинат, беталейкин [24]. 2) В качестве иммунокорректоров после тяжелых оперативных вмешательств по удалению опухоли. В эту группу относятся препараты, действующие преимущественно на макрофаги: полиоксидоний, лейкинферон, галавит, миелопид, ликопид, а также имунофан и ронколейкин. 3) Для коррекции иммунологических нарушений, возникающих вследствие иммунодепрессивного действия самой опухоли (полиоксидоний, глутоксим, лейкинферон, имунофан, галавит). 4) С целью прямого воздействия на опухоль в качестве компонента собственно противоопухолевой терапии назначают, в частности, ИЛ-2 (ронколейкин) - при раке почки, неходжкинских лимфомах; ИФ-альфа (роферон, реаферон, интрон-а, лейкоцитарный интерферон для инъекций) - при гемобластозах, раке почки и меланоме; вакцина БЦЖ или имурон - при поверхностном раке мочевого пузыря. 5) Предположительное профилактическое применение иммуномодуляторов (лейкинферон, ронколейкин, галавит, неовир), которое оказывает антиметастатический эффект (окончательно не доказано). Анализ данных литературы показывает, что в целом иммуномодуляторы (за исключением препаратов ИФ-альфа и ронколейкина) предназначены не для специфической противоопухолевой терапии — они служат вспомогательными компонентами лечения. Показано, что они улучшают качество жизни онкологических больных, устраняют побочные эффекты химио- и радиотерапии и проявления иммунодефицита [73]. Одновременно создан и внедрен в медицинскую практику новый класс тиопоэтинов и тионуклеинов, которые обладают эффектами системных цитопротекторов (веществ, защищающих клетки от вредных воздействий противоопухолевой химиотерапии, токсических веществ, алкоголя и других повреждающих агентов) и имеющими иммунотропные свойства (регуляторы активности иммунной системы). К ним относится глутоксим, который является 6nc(g-L-глутамил)-Ь-цистеинил-бис-глицин динатриевой солью - аналогом окисленного глутатиона, дисульфидная связь которого особым образом стабилизирована. Под его воздействием происходит стимуляция пролиферации и дифференцировки нормальных клеток и активиция процессов апоптоза трансформированных клеток. Он модулирует внутриклеточные процессы тиолового обмена, которые играют важную роль в регуляции генетических и метаболических процессов в организме и нарушены при применении цитостатиков. Препарат оказывает стимулирующее действие на каскадные механизмы фосфатной модификации ключевых белков сигнал-передающих систем, инициацию системы цитокинов (в т.ч. эндогенной продукции ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО, ИФ), определяя, таким образом, иммуномодулирующии и системный цитопротекторный эффект препарата [37]. Глутоксим предупреждает токсическое влияние химиотерапии на печень, почки, сердце и нервную систему, восстанавливает систему иммунитета и кроветворения. Он в качестве метаболической терапии может использоваться при всех состояниях и заболеваниях, когда организму необходима защита от побочного действия химиотерапии. Показано, что препарат (применение в составе комбинированной терапии в течение 14 дней) способен обеспечить позитивную динамику показателей клинического состояния и гемопоэза у большинства (82%) онкологических больных. При этом выживаемость больных немелкоклеточным раком легких в течение 1 года составляет 53%; а в контрольной группе - 15% [26]. Кроме перечисленного, для снижения токсичности химиотерапии и улучшения клинического состояния онкологических больных используют иммунизацию растворимыми аутогенными антигенами опухоли (белки р55 и рбб), выделенными из собственной сыворотки больных [130]. Использование опухолевых антигенов с циклофосфаном увеличивает число лимфатических клеток и апоптотического индекса в опухолях, восстанавливает до нормы количество В-лимфоцитов в селезенке и лимфатических узлах и Т-лимфоцитов в тимусе, таким образом, уменьшая побочные эффекты цитостатика [230]. Кроме того, опухолевые антигены могут оказывать самостоятельно противоопухолевое действие.
Применение фермента О-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (МГМТ), который защищает клетку от токсических эффектов алкилирующих агентов, переводя для этого метальную группу из О-6-метилгуанин-ДНК в цистеиновый остаток в МГМТ, способно восстанавливать поврежденные цепи ДНК. Помимо этого МГМТ снижает миелосупрессию, увеличивает активность алкилирующих агентов и супрессирует устойчивость опухоли к химиотерапии [220]. Однако большинство из перечисленных методов представляют больше познавательный, чем прикладной интерес, и для большинства больных они недоступны [73]. Антиоксиданты и антигипоксанты. Активация свободно-радикального окисления липидов и угнетение системы антиоксидантной защиты, инициируемые как самим опухолевым процессом, так и методами противоопухолевого лечения, является универсальным механизмом реализации токсических эффектов противоопухолевых препаратов [3, 8, 155, 180]. Для фармакологической коррекции побочных эффектов цитостатиков включают препараты с антиоксидантным и антигипоксическим действием для того, чтобы уменьшить побочные эффекты и увеличить терапевтическую эффективность химиотерапии, обеспечивая работу энергосистемы клеток в условиях дефицита кислорода и утилизацию метаболитов. В этом качестве для коррекции побочных эффектов химиотерапии исследовали глутатион, мелатонин, витамин А, витамин Е, N-ацетилцистеин, селен, L-карнитин, Co-Qio и эллаговую кислоту [133]. Большинство из них уменьшает токсичность химиотерапии: эллаговая кислота снижает гепато- и кардиотоксичность цисплатина [228], N-ацетилцистеин и L-карнитин эффективны при невропатии, вызванной препаратами платины [144, 177], и при ифосфамид-индуцированной нефротоксичности [138], Co-Q10 и мелатонин снижают повреждение нормальных тканей, в том числе кардиальной [186, 188]. Установлено, что введение препаратов мексидола и 3-оксипиридинацетилцистеината снижает цитопеническое действие цисплатина и доксорубицина, приводя к уменьшению глубины лейкопении и тромбоцитопении. Мексидол и 3-оксипиридинацетилцистеинат оказывают модулирующее влияние на уровень малонового диальдегида и каталазы, предотвращают нарушения биоэлектрической активности миокарда. В отличие от альфа-токоферола они способствуют восстановлению содержания триглицеридов в миокарде, предупреждают накопление лактата и снижают активность креатинфосфокиназы в сыворотке крови. Препараты также обладают нефропротекторным и гепатопротекторным действием [107]. Таким образом, анализ данных литературы согласуется с известными выводами, свидетельствующими о том, что включение препаратов с
Определение психофизиологического статуса животных
В пределах одной популяции животных обнаруживаются определённые межиндивидуальные различия, в частности ориентировочной активности (ОА), поисковой активности (ПА), эмоциональной лабильности (ЭЛ) и агрессивности (АГ) в условиях экспериментальных исследований, поэтому в качестве моделей изучения эффектов препаратов подбирались животные с одинаковым психофизиологическим статусом, обусловленным средней эмоциональной устойчивостью к внешним воздействиям (рис. 3.2.1). В тестах «открытое поле» и «норковый рефлекс» введение циклофосфана приводило к уменьшению ориентировочной активности крыс на 36% и поисковой активности крыс на 21%, а введение доксорубицина - на 18% и 36% соответственно по сравнению с показателями контрольной группы (табл. 3.2.1). Одновременно при введении циклофосфана и доксорубицина повышалась эмоциональная лабильность на 20% и 40% и агрессивность - на 98%, что, возможно, свидетельствует о повышении тревожности животных под действием цитостатиков. При введении настоя сбора растений с циклофосфаном или доксорубицином наблюдалось увеличение ориентировочной и поисковой активности опытных крыс на 50% и 41% и на 72% и 61% соответственно по сравнению с введением цитостатиков (позитивный контроль). При этом введение настоя сбора растений с доксорубицином приводило к снижению эмоциональной лабильности и агрессивности крыс на 31% и 22% соответственно, а при введении настоя сбора растений с циклофосфаном эти показатели не изменялись. В отличие от настоя сбора растений глутоксим с циклофосфаном снижали этологические показатели (за исключением ориентировочной активности) по сравнению с действием самого циклофосфана. Применение глутоксима с доксорубицином приводило к повышению ориентировочной и поисковой активности на 44% и 78%.
В этих условиях снижалась эмоциональная лабильность и агрессивность на 20% и 30% соответственно (табл. 3.2.1). Таким образом, проведенные исследования этологических показателей у крыс показали возможность подбора животных со средней эмоциональной устойчивостью к внешним воздействиям. Возможно, сами цитостатики и в комплексе с настоем сбора растений или глутоксимом влияют на психофизиологический статус крыс. Эти данные имеют важное значение для подбора животных, на которых будут изучаться адаптогенные, цитотоксические свойства настоя сбора растений вместе с цитостатиками, исследоваться морфологические изменения органов, гематологичесие и биохимические показатели крови после введения этих комплексов препаратов. Антигипоксические свойства. Кислородная недостаточность развивается в организме под действием экстремальных факторов, например, при введении цитостатиков, а также при различных патологических состояниях, в том числе опухолевых заболеваниях [85]. Использование моделей гипоксии в качестве скрининга для изучения антигипоксических свойств настоев растений, отобранных в качестве корректоров цитостатиков, снижающих токсические эффекты последних, позволяло показать их фармакологическую активность среди других препаратов. При выборе материала для исследования опирались на следующие параметры: растения должны иметь стабильную сырьевую базу в России и быть официнальными. Известно, что настои содержат сумму биологически активных веществ из лекарственных растений, придающий им полезные свойства, которые могут отсутствовать у отдельных компонентов этого комплекса [97]. В скрининг были взяты 9 видов растительных объектов: настои алтея лекарственного, березы повислой, календулы лекарственной, крапивы двудомной, липы сердцевидной, подорожника большого, тимьяна ползучего и экстракты цетрарии исландской (ислацет) и овса посевного, полученные в качестве субстанций для лекарственных препаратов на кафедре фармакологии Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии.
Было известно, что данные объекты обладают антигипоксической активностью [86], что позволяло использовать их в качестве корректоров цитотоксического действия противоопухолевых препаратов. Известно, что наличие гипоксии существенно осложняет течение основного патологического процесса и усиливает отрицательное действие цитостатиков [85]. В качестве препаратов сравнения для изучения антигипоксических эффектов комбинаций растительный препарат+цитостатик были использованы гутимин (50 мг/кг) и триметазидин (12 мг/кг). Показано, что гутимин применяется в качестве препарата сравнения при изучении антигипоксических свойств новых соединений [84], а триметазидин используется в практике как антигипоксант [42]. Задачами данного исследования являлось подтверждение антигипоксических свойств самих растительных объектов и изучение этих эффектов в комплексе с цитостатиками. Антигипоксические эффекты изучали на моделях острой гипобарической гипоксии (ОГБГ) и острой гистотоксической гипоксии (ОГТГ). Результаты выживаемости мышей, подвергавшихся ОГБГ и получавших за 1 час (перорально) до неё настои или экстракты растений, представлены в таблице 3.3.1. Полученные результаты соответствуют известным данным о наличии у них антигипоксических свойств [86]. Как видно из таблицы продолжительность жизни мышей, находящихся в течение 20 мин на «предельной высоте» - в 11000-12000 м при атмосферном давлении в 760±Л0 мм, влажности - 50±20%, температуре - 20±5С и получавших настои растений (кроме настоя березы повислой, липы сердцевидной), но не экстракты цетрарии исландской и овса посевного, повышалась по сравнению с контролем (мыши, получавшие воду очищенную). Среди настоев наиболее активными были настои (1:10) календулы
Фармакологические эффекты настоя сбора растений
Известно, что цитостатики могут нарушать гомеостаз, вызывая порой необратимые изменения, а наличие гипоксии существенно осложняет течение основного патологического процесса и усиливает отрицательное действие последних [85]. Показано, что фактор гипоксии связан с избыточным накоплением лактата и рядом взаимосвязанных биохимических и патофизиологических изменений, что ограничивает работоспособность организма в целом [99]. Также известно, что растения, обладающие адаптогенными и антигипоксическими свойствами, способны активизировать защитные силы организма, повышая, таким образом, его резистентность к экстремальным агентам [86]. Мы предположили, что сочетанное применение противоопухолевого препарата с подобного типа растительным препаратом может предупреждать подавление функций нормальных клеток, что может иметь важное значение в химиотерапии опухолей: снижение токсического действия цитостатиков и усиление защитных сил организма. Белые крысы-самцы служили моделью для изучения влияния исследуемых настоев растений в условиях различных физических нагрузок. Для опытов отбирались крысы со средней эмоциональной активностью (тестирование по методу «открытое поле»+«норковый рефлекс»). Использование «плавательного теста» [143] в качестве физической нагрузки позволяло показать влияние самой по себе истощающей нагрузки (плавание крыс с грузом, составляющим 7% от массы тела). В этих условиях крыс адаптировали к такой нагрузке (плавание по 5 мин в загрязненной подогретой до 28+0,5С воде в течение двух дней без груза и один день с грузом). Кроме того, оценивали уровень выносливости крыс при повторных физических нагрузках. Плавание крыс с грузом без предварительной адаптации к этой физической нагрузке позволяло учитывать степень влияния психоэмоционального стресса на эффективность растительных препаратов [90]. Результаты исследования адаптогенных свойств самих настоев крапивы двудомной, календулы лекарственной и подорожника большого и фолигина (препарат сравнения) представлены в таблице 3.4.1.1. На модели плавательного теста показано, что однократное введение настоев крапивы двудомной или календулы лекарственной или подорожника большого самих по себе приводило к незначительному увеличению длительности плавания.
Настой подорожника большого удлинял время плавания крыс в 1,25 раз, настой цветков календулы лекарственной и настой листьев крапивы двудомной - в 1,4 и 1,5 раза по сравнению с контролем (крысы, получавшие воду очищенную). Наиболее выраженные адаптогенные свойства обнаружены у настоя сбора из подорожника большого, календулы лекарственной и крапивы двудомной (2:2:1), которые были сопоставимы с таковыми у фолигина. Настой сбора растений и фолигин увеличивали время плавания крыс примерно в 2 раза по сравнению с контролем. Однократное введение растительных настоев (за 1 час, перорально) вместе с противопухолевыми препаратами (за 30 мин внутрибрюшинно) позволяло показать уровень влияния цитостатиков на адаптогенные свойства растительных препаратов. Было показано, что при однократном введении сам по себе циклофосфан незначительно снижал, а доксорубицин практически не влиял на длительность плавания крыс по сравнению с контролем (табл. 3.4.1.2). Применение цитостатиков с настоями растений приближало уровень выносливости крыс к значениям близким или превышающим таковые в контроле. Введение настоя сбора растений с циклофосфаном или доксорубицином наиболее существенно увеличивало выносливость крыс к физической нагрузке по сравнению с введением только цитостатиков и введением их в комбинации с фолигином. Таким образом, полученные данные показали, что сами по себе настои обладают разными адаптогенными свойствами, но наиболее существенный эффект дает настой сбора растений, увеличивая, таким образом, выносливость животных при введении им цитостатика (циклофосфана или доксорубицина). Применение настоев растений в течение 7 дней перед введением цитостатиков (введение циклофосфана или доксорубицина за 30 мин до плавания с истощающей нагрузкой) подтвердило увеличение работоспособности у крыс, получавших настои растений (табл. 3.4.1.3). Таким образом, введение в течение 7 дней настоя сбора из листьев крапивы двудомной, подорожника большого и цветков календулы лекарственной перед введением циклофосфана или доксорубицина приводило к существенному увеличению выносливости крыс. Значимые результаты в «плавательном тесте» были получены при применении настоя листьев подорожника большого с цитостатиками, что подтверждало целесообразность включения его в композицию растительного сбора, который эффективно увеличивал время плавания крыс по сравнению с фолигином. Уровень выносливости крыс, подвергавшихся повторному воздействию истощающих нагрузок, также подтвердил наличие адаптогенных свойств у настоя листьев подорожника большого и настоя сбора растений при совместном применении с циклофосфаном (табл. 3.4.1.4).
Биохимические исследования крови
Определение антаоксидантной активности ферментов крови. Как известно [48], интенсификация свободнорадикальных процессов перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот наблюдается при развитии общего неспецифического адаптационного синдрома (стресса), т. е. практически при большинстве острых заболеваний и состояний, в том числе при интоксикациях, связанных с опухолевым процессом. В основе этих изменений лежит усиление синтеза эйкозаноидов, обновления мембран, детоксикационных (обезвреживающих) процессов. Накопление активных форм кислорода (АФК), перекисей в значительных количествах (как это наблюдается при действии радиации, ультрафиолетового излучения, гипербарической оксигенации, интоксикациях) может сопровождаться целым рядом негативных изменений. Нарушается жидкокристаллическая структура липопротеидов мембран; снижается прочность биологических мембран (разрушение мембран), набухают и разрушаются митохондрии; наблюдаются структурно-функциональные нарушения ферментных систем дыхания; окисления сульфгидрильных групп глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и др.; ослабление биосинтеза макроэргических соединений (АТФ); дезорганизация транспортных механизмов переноса ионов (Na+, К+, Са2+ и др.), различных метаболитов между цитозолем, митохондриями и рибосомами; торможение процессов биосинтеза белков, нуклеиновых кислот, других соединений; повреждение (разрыв) лизосом с выходом гидролитических ферментов; разрушение мембран эритроцитов, ослабление процессов дыхания, развитие гемолиза; накопление (в результате нарушения окислительно-восстановительных процессов) продуктов промежуточного обмена, в том числе молочной кислоты, окси-, кетокислот, и развитием ацидоза; инактивация глутатиона, липоевой кислоты и других аминокислот. Возникновение нарушений в этой системе может привести к разбалансировке процессов оксидации - антиоксидации, увеличению продукции АФК и проявлению их токсического эффекта на структурные элементы тканей. Наибольшее значение в процессах энзимной инактивации АФК придается реакциям, катализируемым супероксиддисмутазой (СОД) и каталазой. Защита от повреждающего действия АФК в организме осуществляется совместным действием факторов, ограничивающих их действие - антиоксидантной системой, включающей, в том числе, ферментативные реакции утилизации реактивных метаболитов кислорода. Определение активности супероксиддисмутазы. При введении крысам циклофосфана в дозе 100 мг/кг (однократно, внутрибрюшинно) активность СОД оставалась в пределах негативного контроля (интактные крысы, получавшие воду очищенную). При введении комбинации циклофосфан+настой сбора растений активность СОД повышалась в 1,4 раза через 24 часа после введения цитостатика по сравнению с данными позитивного контроля (крысы, получавшие один цитостатик) (табл. 3.4.4.1).
При введении крысам циклофосфана в дозе 200 мг/кг активность СОД снижалась в 1,6 и 1,9 раз через 1 час и 24 часа, и в 4,4 и 3,9 раза на 14-е и 28-е сутки соответственно по сравнению с негативным контролем. При введении комбинации циклофосфан+настой сбора растений активность СОД увеличивалась в 1,7 (через 24 часа), в 2,8 (на 14 сутки) и в 4,2 раза (на 28 сутки), а при введении комбинации циклофосфан+глутоксим - в 1,6-2 раза (через 1 час, 24 часа, на 28 сутки) по сравнению с позитивным контролем. Активность СОД при введении доксорубицина максимально уменьшалась в 3,2 и 4,3 раза (через 24 часа), а в среднем в 2,3 и 2,9 раза (с 1 часа по 28 сутки) в дозах 10,5 мг/кг и 12 мг/кг соответственно. Введение корректоров с доксорубицином в дозе 10,5 мг/кг позволяло сохранять активность фермента в пределах нормы, а в дозе 12 мг/кг — выше в 2 раза через 24 часа и в 1,6 раза на 28 сутки по сравнению с позитивным контролем (животные, которым вводили только доксорубицин). Полученные данные сравнимы с данными при применении глутоксима. Определение активности каталазы. Проведенное исследование показало, что через 1 час после введения цитостатиков активность каталазы в эритроцитах оставалась на уровне негативного контроля, а через 24 часа она снижалась в 1,8-2 раза (табл. 3.4.4.2). При введении цитостатиков в высоких дозах восстановление активности фермента не происходило и к 28 дню эксперимента, что говорит о глубоком срыве антиоксидантной системы крови. Введение настоя сбора растений приводило к увеличению активности каталазы при совместном введении с цитостатиками. Так, при введении настоя сбора растений и циклофосфана в дозе 200 мг/кг активность каталазы возрастала в 2,4 раза (на 14 и 28 сутки), а в дозе 100 мг/кг в 1,8 раза (на 14 сутки). При введении доксорубицина в дозах 10,5 и 12 мг/кг активность каталазы возрастала в среднем в 1,2—1,6 раза по сравнению с позитивным контролем (крысами, получившими только цитостатик). Корригирующие эффекты настоя сбора растений с циклофосфаном в дозах 100 и 200 мг/кг были сопоставимы с эффектами его
