Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературны ! 11
Часть 1. Характеристика вирусов гриппа
1.1. История этиологии и эпидемиологии гриппа 11
1.2. Классификация І 16
1.3. Организация генома и функции вирусных белков 1 16і
1.3 Л. Белки полимеразного комплекса (РВ2, РВ1 и РА) , 18
1.3.2. Гем агглютинин ' 18і
1.3.3. Нуклеопротеин 1 20і
1.3.4. Нейраминидаза 1 20I
1.3.5. Матриксный (Ml) и трансмембранный белок (М2) 21
1.3.6. Неструктурные белки (NS1 и NS2) 24
1.4. Клинические признаки и патогенез 24
1.5. Мировая система мониторинга гриппа | 29
Часть 2. Противовирусные лекарственные средства 31
1.6. Амантидин и римантадин как блокаторы белка М2 31
1.7. Занамивир и озельтамивир как ингибиторы нейраминидазы | 34
1.8. Арбидол j 37
1.9. Контроль качества противовирусных лекарственных средств и стандартизация метода ГЩР 40
1.10. Резистентность к лекарственным средствам - основная проблема ,современной химиотерапии гриппа
II Материалы и методы 59
2.1. Материалы 1 59і
2.1.1. Штаммы вирусов гриппа А і 5 9
2.1.2. Химические реагенты 61
2.1.3. Реагенты и наборы для молекулярной биологии | 61!
2.1.4. Оборудование J 62і
2.1.5. Расходные материалы и лабораторная посуда 63
2.2. Методы 64
2.2.1. Выделение РНК вирусов гриппа ! 64
2.2.2. Реакция обратной транскрипции ! 64
2.2.3. Полимеразная цепная реакция і 64
2.2.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле ] 65
2.2.5. Выделение фрагментов ДНК из геля2.2.6. Секвенирование ДНК. I 66
2.2.7. Выравнивание последовательностей и филогенетический анализ
III Результаты | 67
3.1.Анализ первичной структуры генов М, НА и NA вируса гриппа A(HlNl)nA(H3N2).
3.2. Разработка и стандартизация диагностической системы на основе ОТ- ПЦР и сиквенса для амплификации и определения первичной структуры генов М2, НА и NA
3.3.Секвенирование генов М2, НА и NA и идентификация мутаций, ответственных за устойчивость к лекарственным средствам.
3.3.1. Анализ эпидемических штаммов вируса гриппа A(H1N1) и A(H3N2).
3.3.2. Анализ клинических образцов вирусов гриппа A(H1N1) и A(H3N2) ; 82
3.4.Анализ аминокислотной последовательности белков М2, NA и НА и і
выявление потенциальных маркеров устойчивости к противовирусным средствам.
3.5.Филогенетический анализ эпидемических штаммов. | 93
IV Обсуждение полученных результатов і 100
V Выводы
VI приложения
VII Библиографический список
- Организация генома и функции вирусных белков
- Занамивир и озельтамивир как ингибиторы нейраминидазы
- Реагенты и наборы для молекулярной биологии
- Разработка и стандартизация диагностической системы на основе ОТ- ПЦР и сиквенса для амплификации и определения первичной структуры генов М2, НА и NA
Введение к работе
Грипп, в течение долгих лет продолжает оставаться одной из наиболее актуальных медицинских и социальных проблем, вследствие способности распространяться по всему миру и поражать широкий круг хозяев [WHO, 2003].
Значение химиопрофилактики и химиотерапии в надзоре за распространением гриппозной инфекции, трудно переоценить, особенно в целях своевременной защиты населения в экстренных эпидемических ситуациях > [Бектимиров Т., 2003; Ленева И.А., 2004, 2006].
Исследование и разработка методов анализа лекарственных средств (ЛС) в биологических объектах, а также совершенствование методов оценки качества Л С для обеспечения их максимальной терапевтической эффективности и безопасности является одной из главных задач фармацевтической химии [Арзамасцев А.П., 2004, 2008].
На сегодняшний день, помимо вакцинации, для лечения и профилактики гриппа Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) рекомендованы 2 группы ЛС: блокаторы белка М2 (амантадин и римантадин) и ингибиторы нейраминидазы (занамивир и озельтамивир) (WHO, 2004). В нашей стране широкое распространение получил отечественный лекарственный препарат арбидол. Долгий период применения лекарственных средств адамантанового ряда, привел к резкому падению чувствительности вируса к данной группе средств [Deyde V.M., 2007; Xu X., 2007]. Исследования, проведенные среди эпидемических штаммов вирусов гриппа А в Российской Федерации, также свидетельствуют о прогрессирующем увеличении в популяции числа римантадин-устойчивых штаммов [Burtseva E.I., 2007]. В начале 2008 года, по данным ВОЗ, впервые зарегистрировано значительное снижение чувствительности и к озельтамивиру среди штаммов вируса гриппа A(H1N1) [WHO, 2008].
Изучение молекулярных и генетических характеристик штаммов вируса гриппа, циркулирующих во всем мире, является основным звеном системы мониторинга как эволюционных изменений в геноме вируса, так и чувствительности к противовирусным лекарственным средствам. Мутации, являющиеся маркерами устойчивости к противовирусным ЛС, представляют
интерес не только с точки зрения генетического признака позволяющего идентифицировать резистентный штамм, но и новой генетической особенности штамма, способной влиять на вирулентные и репродуктивные свойства вируса. Среди эпидемических штаммов, циркулирующих в Российской Федерации, молекулярно-генетический анализ до сих пор не используется как метод регулярного контроля чувствительности к противовирусным лекарственным средствам. Статистические показатели, анализ научной литературы, собственные наблюдения показывают, что такая информация необходима для системного контроля биологической активности противовирусных лекарственных средств и является важнейшимі этапом разработки эффективной тактики борьбы, как с известными, так и новыми штаммами вируса гриппа. При этом попытка создания эффективной молекулярной тест-системы для амплификации генов, кодирующих мишени основных противогриппозных лекарственных средств, с целью идентификации маркеров резистентности, представляется своевременной и чрезвычайно актуальной.
Цель и задачи: исследования.
Целью данной работы являлась разработка и стандартизация диагностических тестов для контроля чувствительности штаммов вируса гриппа А подтипов HI и НЗ, выделенных на территории Российской Федерации (1995-2008г.) к основным противовирусным лекарственным средствам.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
Провести анализ первичной структуры генов М2, гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) вируса гриппа А, подтипов HI и НЗ на основе генетической базы данных NCBI (National Centre for Biology Information) и осуществить подбор универсальных праймеров для амплификации и секвенирования генов, кодирующих белки М2, НА и NA.
Разработать и стандартизировать состав диагностической системы на основе ОТ-ПЦР и сиквенса для определения первичной структуры генов М2, НА и NA вирусов гриппа A(H1N1) и A(H3N2) в целях контроля чувствительности штаммов вируса гриппа А подтипов HI и НЗ к основным противовирусным лекарственным средствам.
Секвенировать гены М2, НА и NA эпидемических штаммов гриппа А, подтипов HI и НЗ разных лет, а также ген NA из клинических образцов, полученных от пациентов, принимавших озельтамивир.
На основе анализа полученных нуклеотидных последовательностей эпидемических штаммов гриппа А, идентифицировать в белках М2, НА и NA мутации, ответственные за устойчивость к лекарственным средствам.
Выявить новые - потенциальные маркеры устойчивости к противовирусным лекарственным средствам.
Охарактеризовать исследуемые эпидемические штаммы вируса гриппа А с помощью филогенетического анализа.
Научная новизна.
Впервые представлена подробная молекулярно-генетическая характеристика эпидемических штаммов вируса гриппа А подтипов H3N2 и H1N1, изолированных в Российской Федерации (1995-2008 г.г.). На примере 42-х эпидемических штаммов проведен анализ известных и новых мутаций, связанных с резистентностью к лекарственным средствам, которые применяются в терапии гриппозной инфекции: блокаторы белка М2 (амантадин и римантадин), ингибиторы неираминидазы (занамивир и озельтамивир) и арбидол.
Разработаны, и апробированы эффективные ОТ-ПЦР системы для амплификации и определения нуклеотидной последовательности гена М2 белка и участков генов неираминидазы и гемагглютинина в которых локализованы маркерные мутации устойчивости к противовирусным ЛС.
В результате проведенных исследований установлено, что во всех римантадин - устойчивых штаммах, вместе с основным маркером резистентности -мутацией S3 IN в М2 белке, данную группу штаммов, характеризуют уникальные аминокислотные замены, присутствующие совместно с заменой S3 IN во всех поверхностных белках: М2, нейраминидазе и гемагглютинине. Структурные особенности поверхностных белков исследуемых штаммов продемонстрированы путем филогенетического анализа, где главными критерием организации отдельных филогенетических групп являлись время изоляции штамма и чувствительности к римантадину.
Впервые показано, что исследуемые штаммы не содержат изменений в гемагглютинине, которые указывают на снижение чувствительности к отечественному лекарственному препарату - арбидолу. Также, впервые, на отечественных эпидемических штаммах, а и клинических образцах вируса гриппа А, полученных от пациентов 1-й Инфекционной больницы г. Москвы принимавших озельтамивир, проведена идентификация маркеров устойчивости к ингибиторам нейраминидазы. Основной маркер устойчивости к озельтамивиру -мутация H274Y выявлена в двух эпидемических штаммах A(H1N1) 2008 года.
Впервые подготовлен проект отечественной фармакопейной статьи па диагностическую тест-систему на основе ОТ-ПЦР и сиквенса, являющейся основой для стандартизации и оценки эффективности противовирусных лекарственных средств.
Практическая значимость.
Созданные ОТ-ПЦР системы для амплификации и определения нуклеотидной последовательности генов, кодирующих синтез белков: М2, нейраминидазы и гемагглютинина, используются в работе Национального центра по гриппу, (г. Москва, ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, РАМН) для проведения мониторинга чувствительности отечественных эпидемических штаммов гриппа А подтипов H3N2 и H1N1 к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу.
Разработан проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на диагностическую тест-систему на основе ОТ-ПЦР и сиквенса для выявления маркеров устойчивости к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу в геноме вирусов гриппа А.
Созданные молекулярные тест-системы используются для выяснения характеристик отечественных эпидемических штаммов 2008 года в связи с подъемом резистентности к ингибиторам NA в рамках международного сотрудничества ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, РАМН с Всемирной Организацией Здравоохранения.
Положения, выносимые на защиту. 1. Возможность разработки и стандартизации диагностической системы на основе ОТ-ПЦР и сиквенса для амплификации и определения нуклеотидной
последовательности генов, кодирующих белки М2, нейраминидазу и гемагглютинин вируса гриппа А подтипов H3N2 и H1N1 и последующей идентификации маркерных мутаций резистентности к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу в целях контроля их биологической активности.
2. Возможность выявления- и характеристики- мутаций эпидемических штаммов
гриппа А подтипов H3N2 и H1N1, изолированных в Российской- Федерации за
период с 1995 по 2008 год и идентификация маркеров резистентности к блокаторам
белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу.
3. Возможность идентификации маркеров резистентности к ингибиторам
нейраминидазы в клинических пробах 2007 года, полученных от больных в
процессе применения озельтамивира.
Сравнительный филогенетический анализ эпидемических штаммов гриппа А подтипа H3N2 и H1N1, на основании аминокислотной последовательности гемагглютинина и нейраминидазы.
Проект ФСП на диагностическую-тест-систему на основе ОТ-ПЦР и сиквенса для выявления маркеров устойчивости к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу в геноме вирусов гриппа A(H3N2) и А(НШ1).
Апробация работы.
Основные положения работы были представлены на Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Минск, Белоруссия, 2007 г.), на Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов молекулярной биологии и генетики (Киев, Украина, 2007 г.). В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседании кафедры Фармацевтической и токсикологической химии РУДЫ 21. февраля 2008 г.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов.
Объем'и структура диссертации.
Материалы изложены на 152 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной
литературы, включающего 222 источника, из них 43 отечественных и 179 зарубежных авторов. Работа содержит 17 таблиц и 17 рисунков.
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ ГРИППА 1.1. История этиологии и эпидемиологии гриппа
Первые упоминания о гриппе были отмечены много веков назад - еще в 412 году до новой эры, а описание гриппоподобного заболевания было сделано Гиппократом [Paul M.V. 2006]. Многократные описания эпидемий гриппа встречаются в средние века. Гриппоподобные вспышки были отмечены в 1173 [Hirsch А. 1883] и 1510 году. Первая документированная пандемия гриппа, унесшая много жизней, случилась в 1580'году. В течение'всего последующего времени-грипп оставался серьезной проблемой для большинства стран мира [Pyle G.F. 1986; Колобухина Л.В., Львов Д.К. 2008]. По поводу происхождения слова "инфлюэнца" (устаревшее название гриппа) существует несколько версий. По одной из них, оно / родилось в Италии в. середине 15-го века, после серьезной эпидемии, которую приписывали влиянию (лат. infliientid) астрологических параметров [Каверин Н.В., Львов Д.К. 2008]. По другим гипотезам - это слово произошло от латинского "influere" (вторгаться) или от итальянского "influenza di freddo" (последствие охлаждения). Голландское слово "griep", которое применяют в разговорном языке подобно- английскому "flu", происходит от французского "gripper" и является собирательным понятием, обозначающим большое число респираторных заболеваний, вызываемых более чем 100 вирусами, являющимися возбудителями инфекций верхних дыхательных путей [Harper, D. Etymonlin, иит.ресурс].
В начале 20-го века возбудителем гриппа считалась палочка Афанасьева-Пфейфера. Впервые вирус гриппа А был изолирован в 1931 г. от свиней Richard Shope в США в 1931 г. [Shimizu К. 1997]. В 1933 г. английские вирусологи С.Н. Andrews, P.P. Laidlaw и W. Smith- (National Institute for Medical Research, Лондон) впервые выделили вирус гриппа из легких белых мышей, зараженных материалом от больных гриппом. В честь W.Smith - А штамм, назвали - WS [Smith W. 1933; Колобухина Л.В., Львов Д.К. 2008]. Наличие в вирусологических лабораториях штамма WS, а затем и других вирусов, которые начали довольно регулярно выделять, дало толчок первым попыткам изучения этиологии гриппа и ряда спорадических заболеваний. Ситуация резко изменилась после выделения первых штаммов вируса гриппа В (Francis, 1940г.), поскольку одновременное
использование двух возбудителей гриппа увеличило частоту выявления^ заболевания, особенно в период эпидемий, однако возможности серологической диагностики гриппа были весьма ограниченными, поскольку проводились путем заражения мышей - были длительными, дорогостоящими и трудоемкими.
В- СССР в 1930-1940-х годах были широко развернуты исследования по гриппу и другим вирусным респираторным заболеваниям. Исследования были направлены на выделение штаммов, изучение их свойств, разработку методов диагностики и профилактики (В.М. Жданов, А.А. ,Смородинцев, В.Д.Соловьев, А.С.Горбунова, Л.Я. Закстельская и др.) [Львов Д.К. 2008].
Новая эра в диагностике вируса гриппа, была заложена в начале 40-х годов, когда была выявлена способность вируса гриппа размножаться в амниотической и хорион - аллантоисной полости куриных эмбрионов и доказана его гемагглютииирующая способность. Возможность быстрого накопления на куриных эмбрионах вирусологического материала с последующим количественным определением- вируса в РГА открыла новые перспективы изучения этиологии и диагностики гриппа. На основе РГА была разработана РТГА для выявления специфических антител в парных сыворотках, что обеспечило возможность их быстрого количественного определения с помощью доступного, легко выполняемого метода. В 1947 г. Тейлором был выделен вирус гриппа С [Карпухин Г.И. 2001]. Благодаря открытию метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) американским биохимиком Кэри Мюллисом в 1984 г., лабораторная диагностика гриппа поднялась на принципиально новый уровень - уровень прямого обнаружения инфекционного агента в пробирке (in vitro).
В истории человечества описаны внезапные вспышки гриппа с высоким уровнем смертности. Предполагается, что они возникали в городах, где люди жили в условиях тесного контакта с домашними животными. Пандемии всегда являлись событиями мирового значения. Они возникали в результате появления высококонтагиозного вируса, к которому большая часть населения не имела иммунитета, и, как следствие, практически глобальной восприимчивости населения к инфекции [WHO-avian influenza 2006, rus]. Это позволяет определить некоторые общие свойства пандемий. Характерными особенностями пандемий являются: быстрота распространения по всем частям света, .как правило, в течение года и
заболевание 20-40% всего населения. При этом число летальных исходов может достигать от нескольких до десятков миллионов человек [WHO-Fact sheet №211 2003; WHO-Antivirals-their use and availability 2004; WHO-Geneva, March 2004]. Помимо высокой смертности пандемии отличаются внезапностью вспышки заболевания, не позволяющей адекватно подготовиться к борьбе с инфекцией.
В 20-ом столетии шифтовые варианты вируса гриппа А были причиной трех пандемий и одной глобальной эпидемии, близкой к пандемии (таблица 1.) [Карпухин Г.И. 2001, Колобухина Л.В., Львов Д.К. 2008].
Первая из них - пандемия 1918-1920 гг. была самой тяжелой: число умерших по разным оценкам составило от 20 до 50 млн. человек. В течение года, «испанка» распространилась по всему миру [Barry J.M. 2004]. Возбудителем пандемии явился тип вируса гриппа A(H1N1) [Taubenberger J.K. 1997]. По одним данным пандемия началась в США в марте 1918г., по другим - во Франции уже в 1916г. [Influenza А pandemic, Oxford 2000]. Первая пандемическая волна отличалась высокой контагиозностью вируса, но не вызвала большого числа смертей; значение этих вспышек как сигнала тревоги не было оценено. Когда в конце августа пришла вторая волна, ни одна страна не была к ней готова. От «испанки» умирали люди в расцвете сил, в возрасте от 15 до 35 лет; 99% умерших были моложе 65 лет. Многие больные во время пандемии 1918г. умирали от пневмонии, вызванной вторичной бактериальной инфекцией. Однако «испанский» грипп также вызывал особую форму первичной вирусной пневмонии с обширным легочным кровотечением. Болезнь была такой тяжелой и ее клиническое течение столь необычным, что поначалу версия гриппа даже не рассматривалась. Врачи подозревали цереброспинальный менингит или даже новое явление чумы.
Таблица 1. Пандемические циклы вируса гриппа А
Службы здравоохранения не были подготовлены, к борьбе с пандемией. Антибиотики, которые могли спасти многих от смерти в результате последующей бактериальной инфекции, еще не были изобретены. Об эффективной вакцине не могло быть и речи: вирус гриппа был впервые выделен из организма человека только в 1933г. В период пандемии по подсчетам специалистов заболело 25-30% населения" земного шара. В-мировом масштабе потери оказались огромными: во многих регионах ожидаемая продолжительность жизни снизилась на 10 лет и более [WHO,avian influenza 2006, rus].
Серьезные последствия испанского гриппа, затронули и население России во время второй пандемической волны. Отношение заболевших к числу населения выражалось в следующих цифрах: от 50 и выше случаев на 1000 человек во Владимирской области; от 35 до 50 - в Псковской и Смоленской; и от 25 до 35 в Новгородской, Калужской; Орловской и Казанской областях [Перуанский А. 1919г].
В конце 20-го века, определение нуклеотидной последовательности генома вирусов, изолированных из замороженного трупного материала,, не позволило-дать однозначный ответ на вопрос о природе пандемического вируса 1918 года. На основании' результатов определения нуклеотидной последовательности и филогенетического анализа генов пандемического вируса, было высказано1 предположение, что штамм 1918 г. является реассортантом, сформированным человеческим вирусом гриппа и предком современных вирусов гриппа птиц [Taubenberger J.K. 2005]. Сторонники другой теории утверждают, что данный вирус не является реассортантным. По их мнению, вирус «испанки» имеет характеристики птичьего вируса, который незадолго до пандемии адаптировался к человеку в результате изменений не связанных с процессом реассортации [Gibbs M.J. 2006]. Исследования генетических характеристик пандемического вируса «испанки» и причин столь высокой вирулентности, проводятся до сих пор.
В 1957-1958 гг. произошла пандемия, вызванная вирусом H2N2, которая получила название "Азиатский грипп". Пандемия началась в феврале 1957 г. на дальнем востоке и быстро распространилась по всему миру, однако все были лучше подготовлены к ней, чем в 1918 г. Вакцинация приводила к снижению сезонной заболеваемости на 75% и более. Уже были открыты антибиотики,
которые помогали в лечении осложнений, в частности бактериальной пневмонии. Десять лет работала Глобальная сеть наблюдения за гриппом ВОЗ — инструмент вирусологического мониторинга и раннего оповещения [WHO,avian influenza 2006, rus]. Общие человеческие потери во время пандемии Азиатского гриппа достигли одного миллиона человек [Potter C.W. 2001] .
Пандемия, начавшаяся в 1968г., была еще слабее пандемии 1957г. Первая вспышка острого респираторного заболевания была отмечена в июле на юго-востоке Китая. Установлено, что возбудителем инфекции является новый подтип вируса гриппа A(H3N2) и вскоре ВОЗ выпустила предупреждение о возможности новой, пандемии, по модели распространения сходной с пандемией 1957г. Наибольшее число заболевших было моложе 65 лет, поскольку более пожилые люди, пережившие пандемию 1957г. (вирус A(H2N2)), имели частичный-иммунитет к новому штамму. Несмотря на то, что точных данных о смертности не имеется, мировой прирост числа смертельных случаев можно оценить примерно в 1 миллион [Dowdle W.R. 1999].
В 1977-1978 гг. произошла глобальная эпидемия, названная «русским гриппом» [Колобухина Л.В., Львов Д.К. 2008]. Вирус гриппа A(H1N1), вызвавший эту эпидемия являлся причиной эпидемии в 50-х г. Поэтому в первую очередь пострадали лица, родившиеся после 1950 г. [Kilbourne E.D. 2006]. По поражаемому контингенту и серотипу вируса, вовлеченного в эпидемическое распространение, эпидемия «Русского гриппа» напоминал пандемию «испанки» 1918-—1920 гг., однако последствия были уже иными. Так, В'57,8% случаев течение болезни было легким и в 42,2% — средней тяжести. Первая вспышка заболевания, произошла в мае 1977 г. в Китае. В течение 5 мес. вирусы гриппа распространились в другие части Азии, достигли России, а затем охватили Европу, Америку и Южное полушарие [Карпухин Г.И. 2000]. Подводя итоги глобальной эпидемии 1977 года, ученые пришли к заключению, что ее наиболее важной особенностью явился сдвиг возрастного распределения больных в сторону преобладания молодых людей, что объясняется только влиянием иммунологических факторов-[Карпухин Г.И. 1979].
1.2. Классификация
Вирусы гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae и делятся на три рода Influenzavirus A, Influenzavirus В и Influenzavirus С [Fauquet С. М. 2005]. Семейство Orthomyxoviridae (от греческого orthos - прямой, стандартный, и глуха -слизь) названо так из-за их способности связываться с клетками слизистых оболочек [Nicholson К. G. 2003; Webster R. G., 1978]. Вирусы гриппа Л, помимо людей, поражают некоторые виды животных, и широкий круг домашних и диких птиц. Водоплавающие птицы являются главным природным резервуаром вирусов гриппа А, их главной эволюционной нишей [Каверин Н.В., Львов Д.К. 2008]. Вирусы гриппа В циркулируют только среди людей, вызывая спорадические вспышки респираторных болезней (1 раз в 3-4 года). Вирусы гриппа С выделены от человека и от свиньи, распространены повсеместно, однако обычно не вызывают симптомов или только симптомы мягкой респираторной болезни [Карпухин Г.И. 2001].
Классификация подтипов внутри рода основана на антигенных различиях двух типов поверхностных гликопротеинов: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). У вирусов гриппа А различают 16 подтипов НА и 9 подтипов NA. Для вирусов гриппа В характерно наличие только одного типа гемагглютинина и нейраминидазы. Вирусы гриппа С также имеют один тип гемагглютинина тогда как нейраминидаза у вирусов этого рода отсутствует [Fauquet С. М, 2005].
Согласно Международной номенклатуре, штаммы вируса гриппа рода А обозначается по следующей схеме: род / источник изоляции / место изоляции / собственный номер изолята / год изоляции / формула вида - серотипы гемагглютинина и нейраминидазы. Для штаммов, изолированных от человека, источник изоляции не указывается [Жданов В. М. 1990].
1.3. Организация генома и функции вирусных белков
Вирусы гриппа А - оболочечные, сферической, реже нитевидной формы, около 80-120 нм в диаметре. Длина вируса может достигать и нескольких микрометров [Mosley V.M. 1946].
В состав генома вирусов гриппа А входит 8 сегментов однонитевой
сегментированной РНК негативной полярности (рис.1), кодирующих синтез 10 белков. РНК сегментам присвоены номера в соответствии с их подвижностью при анализе методом электрофореза в полиакриламидном геле. Установлено, что первые три, наиболее крупные сегменты, кодируют белки полимеразного (транскриптазного) комплекса (РВ2, РВ 1, РА); гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) - сегменты 4 и 6; синтез нуклеопротеина (NP) кодирует сегмент 5. Сегменты 7 и 8, кодируют по два гена: М - матриксный (Ml) и мембранный белок (M2);NS-NS1 и NS2 [Webster R.G. 1992].
Рисі. Структура вирішна вируса гриппа.
Каждый из 8-ми сегментов генома представляет собой рибонуклеопротеин (РНП) (нуклеокапсид), который включает однонитевую РНК, нуклеопротеин и белки полимеразного комплекса (РВ2, РВ 1, РА).
Вирион вируса гриппа А окружен липидной мембраной клеточного происхождения. Два поверхностных гликопротеина НА и NA, а также трансмембранный белок М2 интегрированы в липидный слой. Внутренняя оболочка (матрикс), представлена белком Ml [Fauquet С. М., 2005].
Все фрагменты РНК вирусного генома содержат 6-8 уридиловых остатков, за которыми следуют одинаковых 12 нуклеотидных оснований (н.о.) на З'-конце и 13 н.о. на 5*-конце. Эти терминальные регионы являются некодируемыми, однако они необходимы для репликации сегментов и их интеграции в вирусные частицы [Букринская А.Г., 1986; Кингсбери Д.У.1989; Lamb R.A. 2001].
1.3.1. Белки полимеразного комплекса (РВ2, РВ1 и РА)
Белки полимеразного комплекса, совместно с нуклеопротеином образуют РНП комплекс на каждом фрагменте РНК. Комплекс из трех белков называют «транскриптазным комплексом», поскольку каждый из них выполняет полимеразную функцию на стадии транскрипции и репликации вирусной РНК. Они составляют всего 1,2 - 2,2% от всех вирионных белков: Сегменты 1 и 2 имеют длину 2341 и.о., а сегмент 3 - 2233 н.о. [Lamb R.A.1983]. С недавнего времени стало известно, что второй сегмент помимо белка РВ1 кодирует и белок - PB1-F2. Существуют данные, что этот полипептид, интегрируя в митохондриальные мембраны, способствует выбросу в цитоплазму цитохрома С, который в последствии, является сигналом к апоптозу инфицированных моноцитов* и макрофагов. Накопление данного белка в митохондриях, совместно с индукцией апоптоза клинически проявляется прогрессирующей лейкопенией, что приводит к появлению вторичнойїбактериальной инфекции [Steinhauer D. А., 2002].
1.3.2. Гемагглютинин
Круг хозяев, восприимчивых к определенному штамму гриппа А определяется сочетанием его поверхностных гликопротеинов. Высокая изменчивость гемагглютинина (16 подтипов), определяет широкий круг хозяев гриппа А. Вирусы гриппа В и С не имеют антигенных подтипов [Fauquet С. М., 2005].
Длина сегмента 4, кодирующего НА, варьирует у разных вирусов гриппа А и составляет 1742 - 1778 н.о. в зависимости от штамма. Ген гемагглютинина кодирует 562-566 аминокислот (ак) белка, составляющих 30-34% всех вирусных белков [Webster R.G. 1992; Каверин Н.В., Львов Д.К.2008].
Молекула НА синтезируется как единая полипептидная цепь, которая в дальнейшем подвергается процессингу. Последний- включает гликозилирование, сульфатирование, ацетилирование (присоединение остатка жирной кислоты), отщепление сигнального пептида и, наконец протеолитическое расщепление на две субъединицы: большую (НА1, 319-326 ак) и малую (НА2, 221-222 ак) [Каверин Н.В., Львов Д.К. 2008]. На поверхности клетки, НА представлен в виде тримеров -комплексов из трех идентичных полипептидов, каждый из которых состоит из двух цепей НА (НА1+НА2). НА синтезируется в виде единого предшественника -
полипептида НАО [Lamb RA. 2001]. Протеолитическое расщепление ЫАО производится клеточными трипсиноподобными ферментами при рН5 и частично контролируется гликозилированием, поскольку углеводные цепи экранируют потенциальные участки расщепления и ограничивают доступ протеаз хозяина к области расщепления. Углеводный компонент НА синтезируется аппаратом клетки хозяина [Lazarowitz S.G. 1973]. Цепи НА1 и НА2 связаны между собой дисульфидной связью в позициях аминокислот 14 (НА1) и 137 (НА2) [Cross K.J. 2001].
Структурными единицами гемагглютинина являются стебель, интегрированный гидрофобным участком молекулы (основанием) в* липидный слой оболочки вируса, и глобула, которая обращена наружу и содержит рецептор -связывающий, карман, который расположен на каждой из молекул НА, входящих в тример и содержит консервативные аминокислоты: Tyr-98, Trp-153, His-183, Туг-195 [Wilson LA. 1981]. Эти аминокислоты выполняют двоякую роль: сохраняют форму рецепторного кармана и осуществляют связь с сиаловой кислоты. Замена аминокислот в данных позициях на фенилаланин, а также формирование мутантов в положениях 136 и 194 приводит к существенному ослаблению взаимодействия-с рецепторами-сиаловой кислоты. НА с аминокислотными заменами Тгр/153/А1а< и His/183/Ala не экспрессируется на поверхность вириона [Martin J. 1988]. В глобулярной части НА находятся все основные антигенные сайты гемагглютинина. В формировании глобулы принимает участие только HAL Стебель гемагглютинина сформирован обеими субъединицами белка - НА1 и НА2 [Lamb R.A.2001].
Проникновение вируса в клетку зависит от скорости протеолиза гемагглютинина и активации пептида слияния. Данные факторы являются основными параметрами патогенности. Ген НА вирусов гриппа А является наиболее вариабельным, а мутации в гене НА приводят к изменениям его антигенных свойств и способности к эффективной адсорбции на клетках - мишенях и рецептор - зависимому эндоцитозу. Известно, что молекулы НА, отличающиеся структурными особенностями у разных подтипов вируса, имеют различные способности к распознаванию и связыванию с рецептором - сиаловой кислотой, которая через связь с галактозой включена в олигосахариды клеточных мембран
хозяина. Гемагглютинин вирусов гриппа человека связывается с остатками сиаловой кислоты, связанной с галактозой а-(2,6) связью, тогда как гемагглютинин вирусов птиц имеет тропизм к а-(2,3) сиаловым рецепторам. Считается, что именно тип связи сиаловой кислоты и конформационная подвижность олигосахаридов поверхностных лектинов эпителиальных клеток трахеи человека, являются основой межвидового барьера для вирусов гриппа птиц и человека. Лектины эпителиальных клеток человека содержат только олигосахариды с а-(2,6) типом связи, тогда как олигосахариды с типом связи а-(2,3) характерны для эпителиальных клеток кишечного тракта и дыхательных путей птиц. Наличие у свиней лектинов с обоими типами сиаловых рецепторов, по мнению специалистов, определяет их положение в экологической цепи циркуляции вирусов гриппа. Именно свиньи выступают в роли промежуточного хозяина между птицами и человеком, поскольку в их организме возможно одновременное присутствие обоих типов вируса. Одновременная репликация этих вирусов в организме свиньи с высокой вероятностью может привести к появлению нового межвидового реассортанта, отличающегося по ашигенным свойствам от своих предшественников [Cross K.J. 2001; Scholtissek С. 1985]
1.3.3. Нуклеопротеин
NP белок или нуклеопротеин кодируется пятым сегментом вирусного генома. В зрелом вирионе он вместе с белками РВ1, РВ2 и РА составляет часть составе рибонуклеопротеина. Его роль заключается в связывании с вирусной РНК в зараженной клетке, что необходимо для узнавания РНК в качестве матрицы вирусной полимеразой в процессе транскрипции и репликации. Кроме того, предполагается, что он, за счет ферментативных функций, может принимать участие в сплайсинге новых вирусных транскриптов [Klumpp К. 1997].
1.3.4. Нейраминидаза
Нейраминидаза является вторым поверхностным гликопротеином вируса гриппа, величины около 1400 н.о. поскольку может варьировать в зависимости от штамма. Помимо антигенной, NA обладает и ферментативной активностью (номенклатурное название - мукополисахарид N-ацетил нейраминил гидролаза).
Этот гликопротеин разрушает связь между клеткой и вирусом в конце вирусного цикла, позволяя зрелым вирионам отделиться. В отсутствии
функциональной активности нейраминидазы, взаимодействие между рецептор -связывающими сайтами НА и сиаловой кислотой препятствует вирусному освобождению [Hughes М. Т. 2001; Yang Р. 1997]. Именно эта роль фермента дала толчок созданию самых современных препаратов эффективных протии всех подтипов вируса гриппа - ингибиторов нейраминидазы. Использование кристаллографического анализа, помогло подробно изучить структуру активного сайта фермента NA и создать химические вещества - аналоги сиаловой кислоты, которые, более прочно, чем сама кислота связываются с ферментом, ингибируя его ферментативную активность [Ленева И.А. 2004] .
NA гидролизует гликозидную связь, соединяющую кегогруппу сиаловой < кислоты с галактозой. Специфичность фермента различна у разных вирусов гриппа A: NA может гидролизовать а-(2,3) или а-(2,6) связи, либо с одинаковой эффективностью расщеплять оба типа связей. Она также играет определенную роль, в процессе инфицирования на начальных стадиях проникновения вирусов гриппа в клетки хозяина, поскольку способна отщепляет сиаловые кислоты от ингибиторов гемагглютинации - мукоидных секретов дыхательных путей,
облегчая, таким образом, прохождение вируса через респираторный тракт [Малый, В.П. 2007].
NA является одним из важных антигенов вириона, хотя и не столь значимым, как гемагглютинин. NA - один из «мажорных» белков вируса: из 550 -600 «шипов» на поверхности вириона, на долю нейраминидазы приходится порядка 100.
В структуре NA выделяют ряд доменов. Домен А представлен консервативным для всех вирусов гриппа А участком, который фиксируется в мембране: N-Met-Asn-Pro-Asn-Gly-Lys. Закрепляет молекулу NA в липидной оболочке вируса - домен В обогащенный гидрофобными аминокислотами (7 - 35 аминокислота). Далее следует участок, отличающийся большой вариабельностью -«ножка» («стебель») из 50 - 60 аминокислот. Углеводы, входящие в состав молекулы выполняют различные функции: обеспечивая защиту от протеаз, служат для стабилизации и формировании конформации молекулы NA [Lamb R.A. 2001]. 1.3.5. Матриксный (Ml) и трансмембранный белок (М2) Сегмент 7 (1027 н.о.) кодирует два белка, матриксный (Ml) и
трансмембранный (М2). Белки Ml и М2 имеют общие 9 аминокислотных остатков на N-конце, но различные рамки считывания в результате сплайсинга [Fauquet С.Мі 2005].
Белок Ml выстилает всю внутреннюю поверхность вириона, на долю которого приходит 30 - 40% вирусного белка: Он лежит под двойным липидным слоем оболочки вируса и связывает структуры РНП с оболочкой вириона-[Schmitt A.P. 2005]. Белок Ml, играет важную роль на многих этапах репликации вируса гриппа: при проникновении РНП в цитоплазму клетки хозяина необходима диссоциация комплекса РНП и белка. МІ; в процессе репликации, вновь синтезированные молекулы белка Ml' мигрируют в ядро зараженной клетки, где взаимодействуют с синтезированными комплексами РНП [Patterson, S. 1988]; процесс связывания белка Ml с РНП стимулирует транспорт этого комплекса из ядра в цитоплазму клетки [Martin К. 1991]. Белок Ml также играет значительную роль при сборке вириона- молекулы-Ml связываются с РНП и плазматической мембраной. Предполагается, что это происходит через цитоплазматические "концы!' гемагглютинина и нейраминидазы»- двух поверхностных гликопротеинов [АН А. 2000; Enami М. 1996].
Белок М2 является третьим, интегрированным в оболочку вируса гриппа А белком, который присутствует в ограниченном количестве - несколько копий- на вирион. Белок М2 образует тетраметр в котором центральная, часть формирует ионный канал; обеспечивающий транспорт ионов водорода внутрь вириона при слиянии оболочки вириона с клеточной мембраной, что необходимо для диссоциации комплекса М1-РНП [Bukrinskaya A.G., 1982; Pinto L. 1992, Каверин Н.В., Львов Д.К. 2008], и проникновения РНП в ядро [Zhirnov О.Р. 1992]. Кроме того, белок М2 участвует в повышении рН в везикулах аппарата Гольджи, что необходимо для предотвращения конформационных изменений рН-чувствительных молекул НА при* их прохождении через аппарат Гольджи [Hay 1985;SakaguchiT.1996].
Белок М2 состоит из 97 аминокислот разделенных на три домена: N -терминальный или экто домен (1-24 ак), трансмембранный (25-44 ак) и С -терминальный (цитоплазматический; 45 - 97 ак) [Lamb R.A. 1985]. Активность канала главным образом зависит от аминокислот в трансмембранной области
белка: Val27, АІаЗО, Gly34, His37 и Trp41. Эти аминокислоты находятся в порах М2 канала, и обеспечивают ионный транспорт. Механизм селективности ионного канала по отношению к ионам водорода до конца не ясен. Известно, что селективность в наибольшей степени зависит от гистидина в положении 37, замена которого на глицин, аланин, глютаминовую кислоту, серии или треонин, приводит к образованию мутантов способных помимо Н+ пропускать ионы Na* и К+ [Wang С. 1995]. Кроме того, она представляет своего рода барьер для более крупных молекул (рис.2). Аминокислота триптофан (41) выполняет функцию «прохода» в канал, который открывается или закрывается в зависимости от изменений рН снаружи вириона. Роль N - и С - доменов менее изучена, однако, известно, что они также необходимы для функции ионного транспорта [Pinto L. 2007].
closed, high рН
open, low рН
Рис.2. Модель ионного канала трансмембранного белка М2 (зеленый цвет); His37 - красный, Тгр41 - синий [Pinto, 2006|.
Действие первого поколения лекарственных препаратов, эффективных против вируса гриппа А - адамантанов, направлено именно на блокировку М2 каналов. Ранее предполагалось, что механизм действия адамантанов направлен на механическую блокировку канала, поскольку размеры канала близки с размером молекулы препарата. С недавнего времени известно, что адамантаны блокируют канал с N - терминального конца, путем взаимодействия гидрофобных групп препарата с гидрофобными аминокислотами в порах канала АІаЗО и Gly34. Второй уровень взаимодействия осуществляет аммонийная группа амантадина, образуя водородную связь с непротонированной имидазольной группой гистидина (37)
[Mould J.A. 2000]. Изучение аминокислотной последовательности M2 каналов вируса гриппа В, показало, что в порах канала - местах связывания римантадина, находятся полярные аминокислоты, не способные взаимодействовать с гидрофобными группами препарата, следовательно, блокировка канала исключена [Pinto L, Lamb R.А. 2006].
1.3.6. Неструктурные белки (NS1 и NS2)
Белки NS1 и NS2 кодируются восьмым сегментом генома (890 и.о.). NS1 и NS2 имеют общими первые 10 аминокислотных остатков, но различные рамки считывания (в результате сплайсинга) [Fauquet С. М., 2005]. До недавнего времени считалось, что данные белки являются неструктурными, однако в дальнейшем показано, что NS2 присутствует в вирионе [Каверин Н.В., Львов Д.К. 2008]. Белок NS1 является регулятором сплайсинга и трансляции мРНК, а таюке играег важную роль в формировании иммунного (интерферонового) ответа организма на вирусную инфекцию. Функция NS2 заключается в транспорте из ядра вновь синтезированных РНП комплексов [Steinhauer D.A. 2002].
1.4. Клинические признаки и патогенез
Резервуаром вируса и источником инфекции, как правило, является больной человек, возможно, вирусоноситель. Вирус гриппа передается от человека к человеку в основном воздушно - капельным путем [Wright P.F. 2001]. Эпидемиологическую опасность человека, который инфицирован вирусом гриппа, определяют два фактора: количество вируса в слизи верхних дыхательных путей и выраженность катарального синдрома (уровень поражения дыхательных путей). Типичный инкубационный период для гриппа составляет 1-4 дня, в среднем 2 дня [Сох N.J. 1999]. Для определения сроков изоляции больных необходимо знать о сроках выделения возбудителя после начала заболевания: 21-26 дней для вируса A(H1N1), 25 дней - A(H2N2), 22 дня - A(H3N2), до 30 дней - для вируса гриппа В [Малый В.П. 2007.]. Описаны случаи выявления вируса через 20-40 и даже 150-180 дней после начала заболевания. Люди с ослабленным иммунитетом могут распространять вирус неделями или месяцами [Englund J.A. 1998; Boivin G. 2002].
Входными воротами- для вирусов гриппа является эпителий дыхательных путей. В организме человека существуют механизмы неспецифической защиты, препятствующие проникновению вируса в организм. К ним относятся вязкие свойства слизи, постоянное движение ресничек цилиндрического эпителия, неспецифические ингибиторы репликации вируса, которые содержатся в секрете дыхательных путей, макрофаги, захватывающие вирус, секреторный IgA. Факторами защиты являются также лектины С-типа (конаглютинин, манозосвязывающий белок, белки А и D сурфактанта), которые связываются с углеводами вируса, вызывают его агрегацию, приводя к опсонизирующему действию. Главной, мишенью вируса являются клетки цилиндрического реснитчатого эпителия, к рецепторам которых поверхностные гликопротеины характеризуются выраженным тропизмом.
В клинической картине выделяют два основных синдрома: интоксикационный и катаральный.
В первом случае, на первый план выступают симптомы интоксикации: озноб или зябкость, резкая головная боль, ломота в мышцах и суставах, боль при* движении глазными яблоками, светобоязнь, слезотечение, резкая слабость и утомляемость, вялость; эти* симптомы в первый день заболевания доминируют. Уже в первые часы заболевания температура тела достигает максимальных показателей 39-40С [Малый В.П. 2007]. Воспаление среднего уха, тошнота и рвота часто сопровождают основные признаки заболевания у детей [Ryan-Poirier К. 1995; Peltola V. 2003; Neuzil К.М. 2002]. Лихорадка продолжается при гриппе А от 2 до 5 дней, при гриппе В - немного дольше, затем температура снижается. У 10-15% больных лихорадка имеет двухволновой характер, что связано с осложнениями, вызванными бактериальной флорой или обострением хронических заболеваний.
Наиболее типичным признаком катарального синдрома является трахеобронхит. Проявляется чувством першения или боли за грудиной, что обусловлено воспалительным процессом слизистой оболочки трахеи и бронхов, грубым надсадным кашлем, иногда приступообразным с незначительным количеством мокроты. Это может приводить к повышению давления в системе верхней полой вены и способствовать проявлениям геморрагического синдрома (носовые кровотечения, мелкие кровоизлияния в слизистую оболочку ротоглотки,
иногда на коже). Во время неудержимого сухого кашля, который присоединяется к рвоте, возникают очень сильные боли в верхних отделах прямых мышц живота и межреберных мышц по линии присоединения диафрагмы к грудной клетке [Малый В.П. 2007; Nicholson K.G. 1992].
Грипп без осложнений в большинстве случаев проходит в течение 3-7 дней, однако, кашель и недомогание могут продолжаться более двух недель. У некоторых больных грипп может обострять основные заболевания (легочной или сердечной этиологии), либо привести к развитию вторичной бактериальной или вирусной пневмонии, а также проявляется как коинфекция совместно с другим вирусным или бактериальным возбудителем. Маленькие дети, заболевшие гриппом, могут иметь симптомы, напоминающие бактериальный сепсис с высокой температурой [Douglas R. Jr 1975; Dagan R. 1984], а развитие 'лихорадочного приступа наблюдается у 20% госпитализированных детей [Chiu S.S. 2001]. В редких случаях, гриппозная инфекция сопровождается энцефалопатией, миелитом, миозитом, миокардитом, перикардитом и синдромом Рэя [Peltola V. 2003; Douglas R.Jr.1975; McCullers J.A. 1999; Morishima Т. 2002].
Заболевания респираторных органов, которые вызывает вирус гриппа, трудно отличить от большого числа других респираторных инфекций, если судить только по их симптомам и признакам. В клинических исследованиях взрослых, где диагноз гриппозной инфекции был поставлен на основании симптомов высокой температуры и кашля, вирусологическим методом диагноз гриппа был подтвержден в 63% из 78% (высокая температура) и в 55% из 71% (кашель) [Boivin G. 2000; Monto A.S. 2000]. Исследование пожилых, негоспитализированных пациентов, показывает, что лихорадка, кашель и острое начало болезни было вызвано вирусом гриппа только в 30% случаев [Govaert Т.М. 1998]. Аналогичное исследование среди пожилых госпитализированных пациентов с хроническими сердечно-легочными заболеваниями, показало, что перечисленные симптомы встречались в 78% больных, из которых 73% были заражены вирусом гриппа [Walsh Е.Е. 2002]. Полученные результаты указывают на сложности подтверждения диагноза гриппа без современных и надежных методов лабораторной диагностики.
Мониторинг этиологической структуры ОРВИ в Российской федерации на разных стадиях эпидемического процесса показал, что в целом по стране за сезон 2006-2007 гг. по данным Минздравсоцразвития России заболевания гриппозной этиологии составили 8,1% от общего числа обследованных больных. В период эпидемий, частота заболеваний гриппозной этиологии достигала 12-16% [Письмо МЗ, 2007].
Госпитализация и смерть, в результате гриппозной инфекции
Риск развития серьезных осложнений при гриппе наиболее высок среди пожилых людей, детей и людей, с какой-либо сопутствующей патологией. Смерть в результате гриппозной инфекции обычно происходит в результате пневмонии, обострения сердечной и легочной недостаточностей. и других хронических заболеваний [Barker W.H. 1980; Thompson W.W. 2004; Grijalva C.G. 2006].
В США частота госпитализации среди детей до пяти лет колеблется от 100 на ЮОтыс. (среди детей без сопутствующих заболеваний) до 500 на ЮОтыс. (среди-детей с сопутствующей патологией) [Izurieta H.S. 2000; Neuzil К.М. 2000]. В среднем, в США за сезон наблюдается около 226тыс. госпитализаций связанных с гриппом, причем доля пациентов возраста 65 и больше лет, составляет 63% [Thompson W.W., 2004]. Следует подчеркнуть, что у большинства госпитализированных пациентов изолируют вирус A(H3N2) [Simonsen L. 2000].
Уровень смертности от гриппозной пневмонии и сердечно - сосудистых осложнений на ЮОтыс. человек, составил 0,4-0,6 среди людей от 0 до 49 лет; 7,5 среди людей 50 - 64 лет и 98,3 среди людей старше 65 лет [National Center for Health Statistics 1998].
У детей болезнь редко приводит к смерти, однако такие случаи наблюдались [CDC 2004, CDC 2003]. Исследованиями в 1990 г., среди детей до 5 - ти лет, зарегистрировано 92 смерти (0,4 на 1 ООтыс), тогда как этот показатель для людей старше 65-ти лет составил 98,3 на ЮОтыс. человек [Thompson W.W. 2003]. В сезон 2003-2004г., общее число смертельных случаев, вызванных гриппом среди детей, где диагноз гриппа подтвержден лабораторной диагностикой, составило 153 человек. Среди 92 детей, умерших от гриппа в возрасте от 2 до 17 лет, в 70% случаев не отмечались какие-либо сопутствующие заболевания или состояния
высокого риска для развития осложнений, вызванных гриппом (CDC-National center for Infectious Diseases) [Bhat N. 2004].
В связи с увеличением доли пожилого населения в странах Евросоюза и в связи с этим повышения риска осложнений и летальных исходов при гриппозной инфекции, с 2003г. года при содействии ВОЗ, проводится интенсивная вакцинопрофилактика. Предполагается, что данная программа должна уменьшить число госпитализаций за 797тыс. случаев, и вместе с этим количество летальных исходов за 68537 случаев, среди 25 Европейских стран [Rayan J.2006].
Статистика госпитализаций и летальных исходов среди населения! Российской федерации наданный момент не доступна. Предполагается, что это, в первую очередь, вызвано трудностью своевременной диагностики вируса гриппа.
Вирусы гриппа А подтипа II5N1 намного чаще вызывают серозные осложнения и служат причиной летального исхода, чем вирусы A(H1N1) и A(H3N2).
Инкубационный период гриппа A(H5N1), может быть длиннее, чем при заражении вирусами гриппа человека. В 1997 году в Гонг - Конге во время вспышки, вызванной вирусом A(II5N1), инкубационный период составляли - 4 дня [Yuen K.Y. 1998], однако наблюдения последних лет [Chotpitayasunondh Т. 2005; Hien Т.Т. 2004] показывают, что этот период может увеличится до 8 дней. У большинства пациентов первые симптомы проявляются в виде высокой
температуры (обычно более 38 С) и гриппоподобных симптомов поражения нижнего респираторного тракта [WHO, February 20, 2004]. У некоторых пациентов в начале болезни регистрируют диарею, рвоту, абдоминальные боли, плевральные боли и кровотечения из носа и кишок. Почти у всех пациентов развивается пневмония. Микробиологические данные показывают, что это первичная вирусная пневмония без бактериальной инфекции. При ухудшении состояния (на 4-13 день) возникает синдром острой респираторной недостаточности. Часто возникает мультиорганная недостаточность с признаками ренальной и иногда кардиальной дисфункции [Chan Р.К. 2002; Tam J.S. 2002]. Иногда возникают такие осложнения как: пневмония, связанная с легочной недостаточностью, геморрагии в легких, пневмоторакс, панцитопения, синдром Рэя и сепсис без бактериемии [Beigel J.H. 2005]. При заражении вирусом гриппа подтипа H5N1 в случае летального исхода
смерть происходит в среднем на 9-10-й день после появления симптомов болезни [Chotpitayasunondh Т. 2005; Hien Т.Т. 2004]. При этом большинство больных умирает в результате прогрессирующей легочной недостаточности.
По данным ВОЗ на 1 февраля 2008 года, с 2003 года всего в мире зарегистрировано 357 случаев заражения людей гриппом птиц, вызванных вирусом гриппа A(H5N1), из которых 225 человек умерли. При этом, почти половина смертельных исходов (102) зарегистрирована в Индонезии [WHO-1 February 2008]. Не исключено, что этот уровень летальности занижен, поскольку заболевания со слабо выраженной симптоматикой могли не регистрироваться.
Большинство описанных случаев заражения вирусом гриппа A(H5N1) происходило при контакте с больными птицами. Заражение человека происходило в эпизоотических очагах без последующей передачи вируса от человека к человеку. В настоящее время человек является биологическим барьером для вируса A(H5N1), однако, эта ситуация крайне нестабильна поскольку в любое время может произойти трансформация зоонозной инфекции в антропозоонозную [Грипп птиц, 2006].
1.5. Мировая система мониторинга гриппа
Система наблюдения за гриппом является самой старой программой контроля заболеваний ВОЗ. Решение о создании этой системы было принято в 1947г. по двум причинам: неизбежное повторение через неизвестный интервал времени пандемий и серьезные социально-экономические последствия сезонных эпидемий. Эта система была создана в целях непрерывного наблюдения в глобальном масштабе за изменением вируса и определения значения этих изменений для здоровья человека. Система включает сеть лабораторий, задачей которых является изучение вирусов гриппа, циркулирующих в разных частях мира, и регистрация генетических характеристик этих вирусов [WHO,avian influenza 2006, rus].
Сегодня Глобальная сеть наблюдения за гриппом ВОЗ содержит 110 национальных центров изучения гриппа в 82-х странах мира, а также четыре центра по изучению гриппа ВОЗ, расположенных в Лондоне (Англия), Атланте (США), Мельбурне (Австралия) и Токио (Япония) [Kitler М.Е. 2002].. Пятый центр,
расположенный в Мемфисе (США) ведет исследования вирусов гриппа у животных. Национальные центры ведут работу по сбору вирусов гриппа, циркулирующих в разных регионах мира. Затем образцы направляются в четыре лаборатории для углубленного изучения. В задачи ВОЗ также входит выпуск два раза в год рекомендации по составу противогриппозных вакцин, для защиты населения во время сезонных эпидемий, как в южном, так и северном полушариях. Каждый год Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) США выпускают наборы реактивов для определения типа циркулирующих вирусов в лабораториях глобальной сети. Результаты исследований направляются непосредственно в ВОЗ. В четырех центрах также осуществляется хранение образцов вирусов для исторического сравнения и диагностической поддержки в тех странах, в которых наблюдаются необычные случаи гриппа. Определение структуры вирусов и их сравнение с историческими образцами, полученными во время предыдущих вспышек, дают информацию об эволюции вируса [Сох N.J. 1994;МалыйВ.П. 2007].
В нашей стране также систематически1 проводятся этиологические и эпидемиологические наблюдении за гриппом и ОРЗ, при этом регистрация заболеваний сочетается! с выполнением лабораторных исследований по диагностике гриппа и гриппоподобных инфекций. Эта работа осуществляется в вирусологических лабораториях опорных баз Федерального центра по гриппу и ОРЗ в С- Петербурге, в НИИ гриппа РАМН и национального центра по гриппу в Москве, в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского.
Научно-исследовательские институты и центры Госсанэпиднадзора, обеспечивают систему эпидемиологического наблюдения за гриппом и изучение вирусов, циркулирующих на территории страны. Это позволяет своевременно выявлять возбудителей, отличающихся от остальных выделенных штаммов и представляющих интерес в связи с возможностью их доминирования в предстоящий эпидемический сезон. В задачу вирусологических лабораторий опорных баз входит выделение вирусов гриппа в эпидемический и межэпидемический периоды, их идентификация и направление в Федеральный и Национальный центры [Карпухин Г.И. 2001].
Организация генома и функции вирусных белков
Вирусы гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae и делятся на три рода Influenzavirus A, Influenzavirus В и Influenzavirus С [Fauquet С. М. 2005]. Семейство Orthomyxoviridae (от греческого orthos - прямой, стандартный, и глуха -слизь) названо так из-за их способности связываться с клетками слизистых оболочек [Nicholson К. G. 2003; Webster R. G., 1978]. Вирусы гриппа Л, помимо людей, поражают некоторые виды животных, и широкий круг домашних и диких птиц. Водоплавающие птицы являются главным природным резервуаром вирусов гриппа А, их главной эволюционной нишей [Каверин Н.В., Львов Д.К. 2008]. Вирусы гриппа В циркулируют только среди людей, вызывая спорадические вспышки респираторных болезней (1 раз в 3-4 года). Вирусы гриппа С выделены от человека и от свиньи, распространены повсеместно, однако обычно не вызывают симптомов или только симптомы мягкой респираторной болезни [Карпухин Г.И. 2001].
Классификация подтипов внутри рода основана на антигенных различиях двух типов поверхностных гликопротеинов: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). У вирусов гриппа А различают 16 подтипов НА и 9 подтипов NA. Для вирусов гриппа В характерно наличие только одного типа гемагглютинина и нейраминидазы. Вирусы гриппа С также имеют один тип гемагглютинина тогда как нейраминидаза у вирусов этого рода отсутствует [Fauquet С. М, 2005].
Согласно Международной номенклатуре, штаммы вируса гриппа рода А обозначается по следующей схеме: род / источник изоляции / место изоляции / собственный номер изолята / год изоляции / формула вида - серотипы гемагглютинина и нейраминидазы. Для штаммов, изолированных от человека, источник изоляции не указывается [Жданов В. М. 1990].
Вирусы гриппа А - оболочечные, сферической, реже нитевидной формы, около 80-120 нм в диаметре. Длина вируса может достигать и нескольких микрометров [Mosley V.M. 1946].
В состав генома вирусов гриппа А входит 8 сегментов однонитевой сегментированной РНК негативной полярности (рис.1), кодирующих синтез 10 белков. РНК сегментам присвоены номера в соответствии с их подвижностью при анализе методом электрофореза в полиакриламидном геле. Установлено, что первые три, наиболее крупные сегменты, кодируют белки полимеразного (транскриптазного) комплекса (РВ2, РВ 1, РА); гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) - сегменты 4 и 6; синтез нуклеопротеина (NP) кодирует сегмент 5. Сегменты 7 и 8, кодируют по два гена: М - матриксный (Ml) и мембранный белок (M2);NS-NS1 и NS2 [Webster R.G. 1992].
Каждый из 8-ми сегментов генома представляет собой рибонуклеопротеин (РНП) (нуклеокапсид), который включает однонитевую РНК, нуклеопротеин и белки полимеразного комплекса (РВ2, РВ 1, РА).
Вирион вируса гриппа А окружен липидной мембраной клеточного происхождения. Два поверхностных гликопротеина НА и NA, а также трансмембранный белок М2 интегрированы в липидный слой. Внутренняя оболочка (матрикс), представлена белком Ml [Fauquet С. М., 2005].
Все фрагменты РНК вирусного генома содержат 6-8 уридиловых остатков, за которыми следуют одинаковых 12 нуклеотидных оснований (н.о.) на З -конце и 13 н.о. на 5 -конце. Эти терминальные регионы являются некодируемыми, однако они необходимы для репликации сегментов и их интеграции в вирусные частицы [Букринская А.Г., 1986; Кингсбери Д.У.1989; Lamb R.A. 2001].
Белки полимеразного комплекса, совместно с нуклеопротеином образуют РНП комплекс на каждом фрагменте РНК. Комплекс из трех белков называют «транскриптазным комплексом», поскольку каждый из них выполняет полимеразную функцию на стадии транскрипции и репликации вирусной РНК. Они составляют всего 1,2 - 2,2% от всех вирионных белков: Сегменты 1 и 2 имеют длину 2341 и.о., а сегмент 3 - 2233 н.о. [Lamb R.A.1983]. С недавнего времени стало известно, что второй сегмент помимо белка РВ1 кодирует и белок - PB1-F2. Существуют данные, что этот полипептид, интегрируя в митохондриальные мембраны, способствует выбросу в цитоплазму цитохрома С, который в последствии, является сигналом к апоптозу инфицированных моноцитов и макрофагов. Накопление данного белка в митохондриях, совместно с индукцией апоптоза клинически проявляется прогрессирующей лейкопенией, что приводит к появлению вторичнойїбактериальной инфекции [Steinhauer D. А., 2002].
Круг хозяев, восприимчивых к определенному штамму гриппа А определяется сочетанием его поверхностных гликопротеинов. Высокая изменчивость гемагглютинина (16 подтипов), определяет широкий круг хозяев гриппа А. Вирусы гриппа В и С не имеют антигенных подтипов [Fauquet С. М., 2005].
Длина сегмента 4, кодирующего НА, варьирует у разных вирусов гриппа А и составляет 1742 - 1778 н.о. в зависимости от штамма. Ген гемагглютинина кодирует 562-566 аминокислот (ак) белка, составляющих 30-34% всех вирусных белков [Webster R.G. 1992; Каверин Н.В., Львов Д.К.2008].
Молекула НА синтезируется как единая полипептидная цепь, которая в дальнейшем подвергается процессингу. Последний- включает гликозилирование, сульфатирование, ацетилирование (присоединение остатка жирной кислоты), отщепление сигнального пептида и, наконец протеолитическое расщепление на две субъединицы: большую (НА1, 319-326 ак) и малую (НА2, 221-222 ак) [Каверин Н.В., Львов Д.К. 2008].
Занамивир и озельтамивир как ингибиторы нейраминидазы
Занамивир открыт в 1989 году Марком Итзстеином (Mark von Itzstein) в исследованиях под руководством организации GSIRO (Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization). Еще в 1974 году было известно, что соединение 2-дезокси-2,3-дидегидро-М-ацетилен неураминовая кислота, являясь аналогом сиаловой кислоты, способна ингибировать нейраминидазную активность поверхностного гликопротеида вируса гриппа [Meindl Р. 1974]. На основание кристаллографического анализа активного сайта фермента нейраминидазы, формула ингибитора усовершенствована - создано средство которое, более прочно, чем сиаловая кислота связываются с ферментом, ингибируя его активность [Von Itzstein М. 1993; Ленева И.А. 2004]. С 1990 года лицензию на производство занамивира получила Английская компания GlaxoSmithKline. В 1999 г. препарат появился на фармацевтическом рынке США под названием «Реленза», а затем был регистрирован в 70 странах мира, где разрешен как средство для лечения и профилактики всех подтипов гриппа у взрослых и детей старше 5 лет.
Основным ограничением в применении занамивира является его исключительно слабая биодоступность в пероральной лекарственной форме. На сегодняшний день, занамивир применяется только в виде порошка для ингаляции, и его употребление не разрешено среди людей страдающих хроническими заболеваниями легких [FDA, 2000].
Озельтамивир - первый препарат группы ингибиторов нейраминидазы, с высокой, биодоступностью в пероральной форме. Препарат совместно разработан компаниями Gilead Science (США) F.Hoffman-La Roche (Швейцария), производится под торговым названиемЛамифлю [Hayden F.G. 2001]. В 1999-2000 г.г препарат поступил на рынок США и Канады, а в 2002-2003 на Европейский фармацевтический рынок. На сегодняшний1 день, озельтамивир является1 единственным препаратом, рекомендованным для профилактики и лечения всех подтипов гриппа А и В у взрослых и детей старше 1 года [Roche - инт.2005].
Единственным сырьем для производства озельтамивира является экстракт шикимовой кислоты из семян звездчатого аниса, произрастающего в четырех горных провинциях на юго-западе Китая. Производство препарата, при наличии сырья, занимает 6-8- месяцев. На сегодняшний день, в 65 странах сформированы запасы быстрого реагирования, в случае возможной пандемии, включающие более 5 млн. курсов лечения препаратом озельтамивир [Тамифлю-общие сведения 2006].
Занамивир и озельтамивир, показали схожие результаты при оценке эффективности их применения в целях профилактики гриппа. Анализ результатов 18 клинических испытаний, показал, что профилактика с использованием одного из препаратов этого класса снижает риск лабораторно подтвержденного заражения вирусом гриппа на 70-90% в сравнении с плацебо (занамивир -70%, озельтамивир-90%) [Hayden F.G. 2001; Cooper N.J. 2003]. Озельтамивир в настоящее время показан для профилактики гриппа у лиц в возрасте 13 лет и старше, однако данные последних исследований показали эффективность профилактики озельтамивиром у детей в возрасте 1 год и старше [Hayden F.G. 2004]. В ряде исследований оценивали эффективность «сезонной» профилактики у взрослых [Hayden F.G. 1999], пожилых людей [Peters Р.Н. 2001] и профилактики людей «после контакта с вирусом» в семьях [Welliver R. 2001]. Профилактический эффект среди пациентов с иммунодефицитом не установлен, однако недавно опубликованы данные, указывающие на эффективность озельтамивира в профилактике осложнений гриппа у больных с ослабленным иммунитетом в результате пересадки костного мозга [Nichols W.G. 2004]. Ингибиторы нейраминидазы могут предотвратить инфекцию A(H5N1) если принять препарат до контакта с вирусом, однако прямых доказательств подобного эффекта нет [Goodman С. 2006].
Систематический обзор 62-х клинических испытаний эффективности ингибиторов NA при лечении сезонного гриппа, проведен исследователями Leister University (Англия). Было показано, что занамивир уменьшает длительность проявления симптомов на 0,8-1,26 дня среди практически- здорового взрослого населения, нш 0,9-2,0 дня - в группах высокого риска и на 1,0-1,3 дня у детей. Озельтамивир снижает длительность проявления симптомов на 0,9-1,4 дня у практически здорового населения, на 0,4-0,5 дня - в группах высокого риска и на 0,9-1,5 дня у детей. Лечение в целом здорового населения и детей препаратами ингибиторов NA, на 29-43% приводит к снижению риска развития осложнений, требующих терапии антибиотиками (бронхит, пневмония), при условии приема препарата в течение 48 часов после появления первых симптомов [Cooper N.J. 2003]. Клиническое испытание среди 2413 пациенюв показало, что необходимость в госпитализации присутствовала у 1,7% пациентов группы плацебо, тогда как этот показатель составил 0,7% для больных принимавших озельтамивир [Kaiser L. 2003].
Эффективность терапии озельтамивиром также показана для детей в возрасте 1 год и старше. В группе, получавшей озельтамивир, выздоровление наступало на 36 ч раньше, чем в контрольной группе, получавшей плацебо. В указанном исследовании применение озельтамивира на 44% приводило к снижению частоты новых случаев отита у детей всех возрастов [Whitley R.J. 2001].
Реагенты и наборы для молекулярной биологии
Набор для выделения ДНК из геля (Fermentas, DNA Extraction Kit, Литва). Синтетические олигонуклетониды.
Подбор универсальных праймеров для ПЦР и секвенирования генов М2, NA и НА являлся задачей данной диссертационной работы. Набор специфических олигоиуклеотидов был разработан на основании известных последовательностей генов М2, NA и НА , полученных из банков данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) и ISD (www.flu.lanl.gov), при помощи программ Amplify 1.0 (Accelrys Inc., США), BioEdit 7.0.1, Primerselect (Lasergene, США). Синтез всех использованных олигонуклеотидов был проведен в ЗАО "Синтол" (г.Москва). Последовательности использованных праймеров суммированы в таблице 6.
Автоматический 4-х капиллярный (4 капилляра - 80 см) ДНК-секвенатор ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США), включающий компотенты системы детектора (аргоновый лазер, четырехпозиционный фильтр и CCD камера), монитор и компьютер (DELL). Вортекс "Fisons" (UK), твердотельный термостат
"Гном" (ДНК-Технология, Россия), источник питания "Эльф" (ДНК-Технология, Россия), настольные микроцентрифуги "Eppendorf (США), прибор для проведения горизонтального электрофореза в агарозном геле (Хеликон, Россия), вакуумный насос (Gast), снегоделательная машина AF100 (Scotsman), низкотемпературный холодильник (Nuare), амплификаторы «Тсрцик» (ДНК-Технология, Россия), Hybaid и Mastercycler classic "Eppendorf (Германия), трансиллюминатор, фотокамера для съемки гелей Polaroid, холодный шкаф "Bromma" (LKB), механические пипетки переменного объема Gilson, Eppendorf, автоклав настольный Sanyo, дистиллятор (СПУ), холодильник - Stinol, система для очистки воды Milli Q (Millipore, США), электронные настольные весы 1219МР (Sartorius), дозатор со сменными насадками и переменным объемом Multipipette plus (Eppendorf, Германия), магнитная мешалка ММ-5 (СССР), рН-метр 420А+ (Thermo Orion США), спектрофотометр Biophotometr (Eppendorf, Германия), фотокамера для фотографирования гелей (Olympus С5060 Wide Zoom).
Пробирки для ПЦР тонкостенные объемом 0,2 мл (Costar, США), и 0,6 мл (QSP, США), 1,6 мл и 2 мл микроцентрифужные пробирки с градуировкой (Eppendorf, Германия), микронаконечники на 0,5-10 мкл, микронаконечники на 0,1-2,5 мкл, микронаконечники на 1-200 мкл желтые (Greiner, Австрия), желтые с фаской (Treff, Швейцария), наконечники на 100-1000 мкл голубые (Greiner, Австрия), микронаконечники с фильтром на 1-20, 1-200 и 100-1000 мкл (QSP, США), насадки к дозатору Eppendorf на объемы 1 мл, 2,5 мл и 5 мл, пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой на 15 и 50 мл, стеклянная лабораторная посуда с градуировкой и пластиковыми завинчивающимися крышками (Scott Duran), конические колбы на 100, 250 и 500 мл, мерные цилиндры на 50, 250, 500 и 1000 мл, фотопленка листовая PalopanProlOO (Polaroid), пробирки оптические на 200 мкл "MicroAmp", 96-луночные плашки "96-Well Optical Reaction Plate", пленка "96-Well Plate Septa" (Applied Biosystems, США), кюветы для спектрофотометра 50-2000 мкл, свободные от ДНКаз, РНКаз, протеиназ (Eppendorf, Германия).
РНК вирусов гриппа из культуры эпидемических штаммов и клинических образцов, -выделяли с использованием Тризола - лизирующего раствора с фенолом и гуаиидинтиоционатом ("TRI REAGENT", Sigma). Для этого к 400 мкл смеси тризола и культуры клеток (1:1) добавляли 40 мкл хлороформа, встряхивали в течение 15 секунд и инкубировали 5-15 минут при комнатной температуре. Затем центрифугировали при 12000 об/мин 15 минут на 4С. Водную фазу переносили в новую пробирку и добавляли 100 мкл 100% изопропанола. Перемешивали и инкубировали 5-Ю мин при комнатной температуре. Центрифугировали при 12000 об/мин 10 минут на 4С. Удаляли надосадок, а осадок РНК затем промывали, добавляя 500 мкл 75% этанола. Пробу перемешивали на вортексе и затем центрифугировали при 7500 об/мин 5 минут на 4С. Удаляли надосадок, осадок РНК подсушивали на воздухе (5-Ю минут) а затем растворяли в 30 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом. Для улучшения растворения осадка, пробирки прогревали 10-15 мин на 56С.
Реакцию обратной транскрипции для синтеза кДНК на матрице РНК проводили в 0,6 мл пробирках для ПЦР, объём реакционной смеси составлял 20 мкл. В пробирку вносили 10 мкл РНК и 2 мкл 10 пм праймера для ОТ (Unil2). Смесь денатурировали при 70С в течение 5 мин и сразу же переносили в лед. В пробирку с денатурированной РНК добавляли 8 мкл смеси, содержащей 50мМ Трис-HCl, рН=8.3, 7 мМ MgCl2, 40 мМ КС1, 10 мМ DTT, по 0.25 мМ каждого дНТФ, 6 ед. ингибитора РНКаз и 50 ед. обратной транскриптазы M-MLV. Смесь инкубировали в течение 60 мин. при 42С. Для инактивации обратной транскриптазы реакционную смесь прогревали 10 мин. при 70С.
Полученная кДНК использовалась в полимеразной цепной реакции для амплификации фрагментов генома вируса гриппа. Полимеразную цепную реакцию проводили как в тонкостенных пробирках объемом 0,2 мл, так и в среднестенных объемом 0,6 мл на амплификаторах Mastercycler classic (Eppendorf, Германия) и Терцик (ДНК-технология, Россия). Реакционная смесь конечным объемом 25 мкл содержала: ПЦР - буфер (10 мМ Tris-HCl) (рН 9,0 при 25С), 50 мМ КС1, 0,1% Triton Х-100, 1,5 мМ MgCl2), по 0,25 мМ каждого дНТФ, по 10 пМ прямого и обратного праймера, 5 мкл раствора кДНК и 2,5 ед. Taq-ДНК полимеразы. В случае если реакция проходила в приборе «Терцик», для предотвращения испарения реакционной смеси наносили 25 мкл минерального масла.
Разработка и стандартизация диагностической системы на основе ОТ- ПЦР и сиквенса для амплификации и определения первичной структуры генов М2, НА и NA
В последнее время ведутся попытки создания универсальных систем праймеров для амплификации полного генома вируса гриппа, основанные на использовании в качестве мест посадки праймера консервативных участков 3 и 5" концов каждого из сегментов [Hoffman Е. 2001]. Однако данная система имеет ряд недостатков, основным из которых является известный постулат о том, что «универсальная» система никогда не будет работать так эффективно как «специфичная», подобранная с учетом характеристик конкретных штаммов: времени изоляции, географии распределения, концентрации исходного материала. Кроме того, система универсальных праймеров подобрана для одностадийной ПЦР и в случае амплификации полного сегмента большой длины (пр. НА 1742 - 1778 и.о.) не была бы достаточно эффективной при невысокой концентрации исходного материала, о чем мы не имели точных сведений в начале исследований.
Подобраны системы праймеров оказались эффективными и при секвенировании нуклеотидных последовательностей исследуемых генов, на основании которых в дальнейшем проводили молекулярно- генетический анализ.
Ингибиторы белка М2 относятся к первому поколению препаратов, эффективных против вируса гриппа А. Их действие заключается в блокировке ионных каналов, формируемых белком М2, который играет ключевую роль на ранних этапах вирусной транскрипции, нарушает отдельные процессы самосборки вирусных частиц, тем самым ингибирует репликацию вируса гриппа А [Kinchington D. 1999]. Первые сообщений о свободной циркуляции среди людей римантадин - резистентных штаммов гриппа A [Heider Н. 1981], которые были подтверждены при исследовании отечественных штаммов в лаборатории этиологии НИИ гриппа в период с 1982 по 1992 г. [Карпухин Г.И. 2001], определили необходимость регулярного контроля уровня резистентности к препаратам адамантанового ряда во всем мире. Если уровень резистентности к адамантам по итогам совместных исследований ВОЗ и CDC среди 43 стран в период 1992-1995 г. (п=2017) находился на уровне 0,8% [Ziegler Т. 1999], то последующее 10-ти летнее наблюдение (1995-2005г) среди 7000 образцов показало, что на конец исследования в странах Юго-восточной Азии - Южной Кореи, Тайване, Гонг Конге и Китае, уровень резистентности достиг 15%, 23%, 70% и 74% соответственно. Не смотря на это, на мировом уровне этот показатель к концу 2005г. составил 6% [Bright R.A. 2005].
Резкое падение чувствительности вируса гриппа к адамантанам, заставило многие страны отказаться от их применения в медицинской практике. Это в первую очередь касается США и стран Юго-восточной Азии, где уровень резистентности к данному средству на сегодняшний день превышает 95% [Deyde V.M. 2007]. Тенденция роста резистентности к римантадину наблюдается и среди штаммов, циркулируемых в Российской федерации, однако темпы роста не столь интенсивны как в других странах: 9,5% в сезоне 2002-2003г.г. 38% - 2004-2005г.г. [Шевченко Е.С. 2005], 44% - 2005-2006г.г. [Burtseva E.I. 2007]. На сегодняшний день римантадин является средством, рекомендованным Министерством здравоохранения и социального развития, для использования в лечении гриппа у детей и взрослых [Мин. здрав, письмо 2007].
Изучение молекулярных основ резистентности к адамантанам, показало, что все римантадин-устойчивые штаммы имеют мутации в трансмембранной области белка М2 (позиции 22-46), а именно в позициях 26, 27, 30, 31, 34 [Bclshe R. 1988; Crumpacker С. 2001], при чем замена S3 IN в ходе различных независимых исследованиях являлась доминантным маркером снижения чувствительности к адамантанам [Ziegler Т. 1999; Saito R. 2003; Bright R.A. 2005].
Исследование мутаций в белке М2 изучаемых нами штаммов позволило идентифицировать как известные, так и новые маркеры к устойчивости к препаратам адамантанового ряда. Как было показано в таблице 11, для штаммов обоих подтипов, которые по результатам клеточного ИФА до начала исследований были охарактеризованы как резистентные к римантадину, выявлен основной маркер устойчивости к адамантанам: замена в 31 положении: аспарагин - серии. Для каждого подтипа вируса выявлены замены, которые встречаются совместно с мутацией в положении 31. Для штаммов A(H3N2) замена S3 IN, совместно встречается с заменой в положении 51 (изолейцин - валин), что показано на примере 10 резистентных штаммов. Для штаммов A(IIINI) замены N20S и S3 IN, встречаются совместно в 3 из 4 случаев. Помимо этих замен, были найдены и другие, во всех сегментах белка, большинство из которых не было описано в литературных данных. Выявленные нами мутации, находятся во всех сегментах белка М2, поэтому для нас большой интерес представлял анализ имеющихся литературных данных о возможном вкладе данных замен в функциональные свойства белка, а также их влиянии на вирулентные и репродуктивные свойства вируса.
О роли и функции С и N терминальных концов белка М2 (места локализации мутаций, совместно встречающихся с S3 IN) известно мало, однако ученые Pinto Н. и Lamb R., занимающиеся изучением структуры и функций М2 ионных каналов более 15-ти лет, в своих работах указывают па незаменимую роль самого длинного участка белка М2 - С терминального конца в функционировании канала [Lamb 2007]. Ими показано, что ионные каналы, с отщепленной Ги и более аминокислотой со стороны С терминального конца, после короткого периода не способны выполнять функции ионного транспорта. Kollerova Е. и Betakova Т. показали недавно в своих исследованиях, что мутация C50S в С терминальной области белка, не задерживает транспорт протонов через канал [Kollerova Е. 2007]. Замена G16E встречалась в 72,7% A(H1N1) штаммов 1995-1998 года, чувствительных к римантадину. В исследованиях немецких ученых данная замена, совместно с мутациями S3 IN и R77Q, встречалась во всех римантадин-устойчивых штаммах (H1N1, H1N2, H3N2, п=9) изолированных от свиней в Германии в период с 1981 по 2001 год [Schmidtke М. 2006].
![Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс]](/i/i/4375/184827.png "Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс] Коновалов Андрей Александрович")
