Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Контроль качества лекарственных средств — научно-практический раздел фармацевтической микробиологии
1.1 Микрофлора нестерильных лекарственных средств и различные аспекты ее изучения
1.2 Необходимость наличия специализированной лаборатории
Глава 2 Материалы и методы
2.1 Лекарственные средства
2.2 Культуры микроорганизмов
2.3. Питательные среды и реактивы
2.4. Методы исследования 72
Глава 3 Результаты микробиологического исследования качества ЛС 82
3.1 Сравнительная характеристика степени микробиологической чистоты различных лекарственных средств 82
3.2 Видовой состав микроорганизмов-контаминантов ЛС 113
Глава 4 Методические особенности проведения микробиологических исследований качества ЛС 119
4.1 Современные подходы к определению антимикробного действия ЛС и его нейтрализации 122
4.2 Особености пробоподготовки различных лек. форм 145
Глава 5 Разработка методов выделения и идентификации микроорганизмов-контаминантов ЛС . 147
5.1 Разработка методов количественного определения аэробных бактерий, дрожжевых и плесневых грибов. 147
5.2 Создание и совершенствование методов выделения и идентификации определенных микроорганизмов 158
5.3 Особенности испытания лекарственных растительных средств на микробиологическую чистоту 170
Глава 6 Состояние и перспективы развития материально-технической базы микробиологических исследований при контроле ЛС 187
Глава 7 Экспериментальное обоснование методики оценки качества отдельных групп ЛС и вспомогательных веществ 209
Глава 8 Пути совершенстования эффективности работы микробиологической лаборатории в сфере лекарственного обращения 215
8.1 Особенности функционирования лабораторий микробиологии фармацевтических производств и контрольных служб 215
8.2 Прикладное значение микробиологических показателей при оценке рисков получения ложных результатов контроля 234
Обсуждение результатов 244
Выводы- 257
Список литературы 260
Приложения 286
- Необходимость наличия специализированной лаборатории
- Сравнительная характеристика степени микробиологической чистоты различных лекарственных средств
- Особености пробоподготовки различных лек. форм
- Создание и совершенствование методов выделения и идентификации определенных микроорганизмов
Введение к работе
В связи с введением на фармацевтических предприятиях России правил
надлежащей производственной практики (GMP) изменяются подходы к
контролю качества лекарственных препаратов (ЛП) и субстанций.
Необходимость контроля качества нестерильных лекарственных средств (НЛС)
обосновывается важностью обеспечения их безопасности и эффективности, т.е.
снижения риска при применении потребителем (Акимочкин В.Е., 2003).
«Качество должно быть встроено в лекарственный препарат» (Брахт К. 2004,
Pharmaceutical* cGMP 2002). Таким образом, начиная с разработки нового
фармацевтического продукта, на всем пути от производства до потребителя,
необходимо оценивать риск возникновения некачественного продукта и
создавать систему управления рисками; добиваясь обеспечения качества НЛС.
Особое место при этом занимают биологические методы испытания
фармацевтических препаратов, относящиеся в первую очередь к области
фармакологии и микробиологии (Попов А.Ю. 2004, Хабриев Р.У.2005).
Особенностью микробиологических видов анализов является специфика
объекта исследования - живого микроорганизма, обладающего
индивидуальными особенностями. К наиболее значимым объективным
факторам, влияющим на результаты анализа, относятся следующие:
Наличие антимикробного действия самих лекарственных средств (ЛС) или
их компонентов, а также присутствие в некоторых из них консервантов,
препятствует выявлению микроорганизмов.
Опережающий рост сопутствующей микрофлоры, затрудняющий количественное или качественное определение отдельных микроорганизмов-контаминантов.
Возможно обнаружение микроорганизмов в «стрессовом» состоянии под воздействием условий технологического процесса производства НЛС и неравномерное распределение контаминантов в образцах.
4 Учитывая тесную связь микробиологических показателей с безопасностью
применения ЛС, результаты испытаний продукции должны быть максимально
точными и надежными.
Основными факторами, влияющими на вариабельность результатов микробиологических исследований, являются: специфичность пробы (физико-химические свойства НЛС и биологические особенности выделяемой популяции микроорганизмов), компетентность персонала и условия его работы, отбор образцов и подготовка пробы, условия- инкубации, характеристики используемых питательных сред. Последние три фактора подлежат обязательной стандартизации (ИСО 13843:2000) и валидации, что подтверждается общей тенденцией по совершенствованию фармакопейных микробиологических методов контроля.
Проблема разработки, обоснования и установления нормативов допустимого содержания микроорганизмов в НЛС тесно связана с выбором методов- их выявления, и идентификации, обуславливающих эффективность анализа: Дальнейшее расширение номенклатуры. ЛП и субстанций, внедрение правил GMP и систем менеджмента качества, как на фармацевтических производствах, так и в контрольных лабораториях требуют стандартных подходов к определению качества НЛС по показателю «Микробиологическая чистота». Поэтому в настоящей работе решается научная проблема, заключающаяся в пересмотре фармакопейных требований к качеству ЛП, совершенствование методов количественного и качественного определения микроорганизмов, подготовки образцов перед испытанием, определения антимикробного действия и методов его нейтрализации. Актуальны вопросы, связанные с функционированием контрольной микробиологической лаборатории в свете современных требований.
С середины 60-х годов 20-го столетия после того, как микроорганизмы были обнаружены- в лекарственных средствах (ЛС), практически во* всех развитых странах разносторонне изучались вопросы микробиологической чистоты лекарственных препаратов (ЛП). Клиницистами установлено, что «лекарственная инфекция», связанная с контаминацией препаратов бактериями
5 и грибами, достаточно опасна, особенно для новорожденных, ослабленных
пациентов, для больных пожилого возраста, с хроническими заболеваниями и
после применения средств современной терапии. В конце прошлого века
появилось много публикаций о микроорганизмах, контаминирующих ЛС
(Имшенецкий А.Л. и др., 1984, Flaum L, 1978). Клинические данные об
ухудшении здоровья пациентов после приема ряда препаратов получили
объяснение в работах микробиологов, обнаруживших в них бактерии и грибы
(Railings L.O., 1966, Savin J.А., 1967). Среди описанных случаев лекарственной
инфекции выделяется заражение грибами новорожденных в одном из роддомов
Японии, приведшее к летальному исходу в результате использования
контаминированной детской присыпки (Курата X. и др., 1980). Имеются
описания кожных заболеваний, вызванных применением медицинского крема,
загрязненного патогенным дрожжеподобным грибом С.albicans и синегнойной
палочкой P. aeruginosa (Bruck К.А., 1971). В' клинической микробиологии
уделялось большое внимание микрофлоре глазных контактных линз.и растворов»
для их промывания (Butrus S., 1986, Pitsigavdaki Е, 1990). Были доказаны
мутагенные, тератогенные и канцерогенные свойства метаболитов плесневых
грибов (Тутельян 1981, Тутельян 1985, Волгарев 1985, Дурнев 1999, Столярова
2002).
В связи с актуальностью проблемы микробной загрязненности НЛС в 1972 г. были опубликованы рекомендации Всемирной Организации Здравоохранения и Международной Федерации Фармацевтов, содержащие общие принципы к установлению норм, лимитирующих допустимый уровень количественного и качественного состава микрофлоры в лекарственных средствах.
Во второй половине 20-го века допустимые пределы микробиологической чистоты ЛС и методы количественного и качественного определения микроорганизмов были разработаны и вошли в официальные нормативные документы, в первую очередь в фармакопеи (ЕР 2005, British Р. 2003 USP 2006, JP XIY 2001, P. of China 2000).
Сравнительный анализ структуры ведущих фармакопеи и действующего издания отечественной фармакопеи показал, что по своей направленности
существующая в Государственной Фармакопее СССР XI изд. общая
фармакопейная статья аналогична монографиям Европейской, Американской и
Японской фармакопеи. Вышесказанное иллюстрировано таблицей 1.
Таблица 1 Данные ведущих фармакопеи по микробиологическим показателям качества лекарственных средств
Сравнение материалов, указанных в представленных статьях, показывает, что содержание статей требует гармонизации, например: введение преинкубации испытуемых образцов для восстановления жизнедеятельности контаминантов, включение метода наиболее вероятных чисел, использование в испытаниях питательных сред с более воспроизводимыми ростовыми свойствами (без применения мясной воды) и др. Мировой опыт показывает реальность
7 попадания в ЛС микроорганизмов, работа в контрольной службе подтверждает
это положение.
Введение в отечественную Государственную Фармакопею (ГФ XI изд., 1990г.)
испытания, лекарственных средств на стерильность и микробиологическую
чистоту открыло перспективу для развития нового направления в
микробиологии - фармацевтической микробиологии: Однако возможности
улучшения микробиологического контроля? качества ЛС сдерживались рядом
объективных трудностей:
в учебных программах, профильных вузов отсутствовали целевые разделы фармацевтической микробиологии,
постдипломная профессиональная подготовка и усовершенствование-специалистов проводилась в рамках Государственного образовательного стандарта по специальности «бактериология»- для сотрудников, окончивших только медицинские ВУЗы,
не было;должной гармонизации с базовыми материалами:mположениями^ Европейской Фармакопеи5 в отношении классификации, лекарственных средств с учетом их происхождения и. способа применения,
не было системного и в равной степени универсального алгоритма микробиологического контроля различных категорий лекарственных препаратов, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ.
отсутствовали адаптированные к целям исследования методики и схемы определения качества лекарственных растительных средств по показателю «Микробиологическая чистота»,
немногочисленные отечественные публикации оставались разрозненными и монопрофильными по информации. Представленные в них результаты в силу различного методического подхода и лабораторного оснащения авторов были часто несопоставимы,
без должной; научно-практической оценки оставался видовой состав грибов-контаминантов лекарственных средств;
Таким образом, возникла необходимость комплексного решения на современном уровне (с учетом требований GMP и GLP) организационно-
8 методических, теоретических и практических вопросов, связанных с
микробиологическим анализом качества лекарственных средств. Это в свою
очередь должно обеспечить существенное повышение эффективности системы
Государственного контроля- качества лекарственных средств по
микробиологическим показателям.
Анализ и перечень приведенных выше положений определяет актуальность проблемы и практическую значимость темы настоящей работы.
Цель, работы. Целью настоящего исследования является формирование теоретических основ и разработка современных методологических подходов к микробиологическому контролю качества ЛС, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ с учетом положений GMP' и GLP в Российской Федерации.
Задачи исследования:
Изучить качество ряда ЛП; в том числе не контролируемых ранее растительных ЛС, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ по ведущему показателю безопасности - «Микробиологическая чистота».
Определить состав основной микрофлоры, содержащейся в различных лекарственных формах, и идентифицировать выделенные грибы.
Гармонизировать с Европейской Фармакопеей нормы допустимой микробной загрязненности ЛП; разработать требования к качеству ЛРС, субстанций и вспомогательных веществ по показателю «Микробиологическая чистота».
Усовершенствовать методы определения антимикробного действия ЛС и изучить антимикробное действие ЛС различных лекарственных форм и фармакотерапевтических групп.
Обосновать и внедрить в практику микробиологических исследований при контроле качества ЛС высокоэффективные методы количественного определения микроорганизмов, а также способы выделения и идентификации отдельных видов бактерий-контаминантов ЛС.
Сравнить базовые характеристики питательных сред отечественного' и импортного производства, используемых для контроля качества ЛС; обосновать
9 рецептуры и изучить качество соево-казеинового агара, агара с бриллиантовым
зеленым и среды типа агара Мак-Конки.
7. Создать систему микробиологического контроля качества (СМКК) ЛС,
фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ, выработать
концепцию рационального построения и функционирования, определить ее
структуру.
Научная новизна. Создана система микробиологического контроля качества (СМКК) ЛС, определена ее структура и концепция рационального построения и функционирования. Выполнен дифференцированный подход к установлению предельных норм допустимой микробной загрязненности ЛС, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ. Осуществлена классификация препаратов, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ по категориям с учетом происхождения, и способа применения. Определены пути повышения информативности микробиологических исследований при контроле качества ЛС.
Установлены особенности исследования микробиологической чистоты ЛРС в соответствии с их физико-химическими, биологическими свойствами, назначением и нормами микробной загрязненности для каждой категории растительных препаратов.
Выявлено антимикробное действие у ряда ЛС из различных фармакотерапевтических групп: нейротропные, антидепрессанты, седативные, антигистаминные, спазмолитические, гипотензивные, сосудорасширяющие, не наркотические противовоспалительные, болеутоляющие и жаропонижающие ЛС.
Впервые- проведена углубленная микологическая экспертиза грибов-контаминантов ЛС, при этом выявлена их обсемененность 74 видами грибов из 16 родов, в 28,9% изученных серий ЛС содержание грибов превышало допустимые нормы.
10 Теоретическая и практическая значимость работы. Разработанные,
усовершенствованные и внедренные в процессе выполнения работы алгоритм,
этапы, схемы и методы микробиологических исследований позволили
стандартизовать условия испытаний и обеспечить повышение эффективности
контроля качества ЛС на фармацевтических предприятиях России и* в
контрольной службе.
Предложен современный методологический подход к
микробиологическому анализу качества ЛС, основанный на использовании комплекса стандартных методов, позволяющих: достоверно установить количество аэробных бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, выделить из ЛС и идентифицировать отдельные виды нормируемых микроорганизмов^
Разработан эффективный и экономичный чашечный агаровый метод (модифицированный глубинный) количественного определения в ЛС аэробных бактерий, дрожжевых и плесневых грибов. Валидация предложенного' метода позволила рекомендовать его использование наравне с двухслойным, поверхностным и глубинным методами для* получения достоверных, воспроизводимых количественных результатов контроля качества ЛС. Предложены методы количественного и качественного определения микроорганизмов-контаминантов различных лекарственных форм медицинских препаратов с учетом подготовки образцов перед анализом (материалы исследований внедрены в ОФС 42-0067-07 ГФ XII изд.).
Усовершенствованы методы определения антимикробного действия различных ЛС, включая разработку альтернативного метода репликаций для водонерастворимых и окрашенных ЛП. Детализированы подходы к нейтрализации антимикробного действия (материалы внедрены в Изменении №2 к Государственной Фармакопее XI изд. от 14.08.01 и в ГФ РФ XII изд.).
Данные сравнительного изучения ряда сухих питательных сред для контроля микробной загрязненности ЛС различных отечественных производителей свидетельствуют о возможности их использования наравне с
импортными сухими и готовыми к употреблению- питательными средами (материалы включены в ОФС 42-0067-07 ГФ РФ XII изд.).
На основании проведенных исследований разработаны и утверждены Изменения №1, №2, №3 к ГФ XI изд., ВФС 42-3455-99 «Определение ростовых свойств питательных сред, используемых для испытания на стерильность, и микробиологическую чистоту лекарственных средств»; ВФС 42-3454-99 «Метод наиболее вероятных чисел»; ОФС 42-0016-04 «Методы микробиологического контроля лекарственных растительных средств, состоящих из одного вида сырья или нескольких (сборы)- фасованная продукция, а также растительного сырья «ангро»»; ОФС 42-0066-07 «Стерильность»; ОФС 42-0067-07 «Микробиологическая.чистота»; ОФС 42-0069-07 «Определение эффективности антимикробных консервантов ЛС» ГФ РФ XII изд.
Методы микробиологического' контроля качества ЛС апробированы и внедрены на фармацевтических предприятиях: ОАО «Красногорсклексредства» (акт о внедрении от 26.12.2006), ООО «Бион» (акт о внедрении исх. №458 от 31.10.2006), ЗАО «ФПК ФармВИЛАР» (акт о внедрении исх. №28 от 31.01.07), ОАО «АЗТ Фарма К.Б.»(акт о внедрении исх.№288 от 15 сентября'2006г).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена в микробиологических лабораториях ИСКЛС ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора в рамках отраслевой научно-исследовательской программы НЦ ЭГКЛС «Экспертиза и Государственный контроль лекарственных средств», утвержденной 8 декабря 2000 г. начальником Управления научно-исследовательских медицинских учреждений МЗ РФ Ткаченко СБ. и в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Пермская государственная академия» (номер государственной регистрации 01.9.50007417).
Положения, выносимые на защиту:
1. Методологический подход к исследованию качества ЛП, растительных
лекарственных средств, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ по ведущему показателю безопасности - «Микробиологическая чистота».
Разработка норм и методов определения микробиологической чистоты ЛРС, позволяющие объективно оценить их качество.
Микологическая экспертиза при микробиологическом анализе ЛС.
Определение антимикробного действия ЛС - необходимый этап исследований для снижения риска ложных результатов микробиологических исследований фармацевтических препаратов и субстанций.
Разработка эффективного и экономичного метода количественного определения микроорганизмов-контаминантов ЛС.
Экспериментальное обоснование базовых характеристик питательных сред импортного и отечественного производства для контроля загрязненности ЛС.
Концептуальная модель СМКК ЛС в сферах регистрации, производства и контроля качества ЛС.
Необходимость наличия специализированной лаборатории
Рассмотренные: источники: контаминации, характеристики контаминированных препаратов и потенциальную опасность выделяемых бактерий и грибов затрагивают целый: комплекс вопросов, связанный с условиями производства, и контроля: качества JIG, т.е. вопросы создания; и функционирования контрольных лабораторий.
Из. многих жизненных благ большинство людей ставят во. главу угла здоровье, следовательно, вопросы; лечения и- лекарственного- обеспечения, возникают достаточно" остро. Лекарство называют материальным регулятором жизни: страдающего недугом человека наравне с пищей, воздухом, светом: ш пр.. Поэтому качество лекарственных средств:,, их эффективность и безопасность нужно? гарантировать условиями производства и; подтверждать контрольными испытаниями;согласно современным методикам.
Контроль качества, лекарственных средств; на; производстве: и в, контрольных, лабораториях переходит в обширную- систему, обеспечения качества (Каграманова К.А.). Именно поэтому так; важны: материалы, касающиеся? вопросов: в: каких условиях будут производиться, и в каких лабораториях будет контролироваться качество лекарственных средств?
С целью обеспечить проведение контрольных испытаний создаются новые и модернизируются уже имеющиеся на производствах ив контрольных организациях микробиологические лаборатории согласно современным требованиям ( ГОСТ Р ISO/ МЭК 17025-2000,.СП 1.3.1318-03, Руководство по аккр: 1996, МУ 2.1.4.1057-01 2001, СП 1.2.731-99). При проектировании новых или перепланировке имеющихся помещений микробиологических лабораторий учитываются особенности,. без» . которых невозможно дальнейшее функционирование..При планировании, лаборатории важно представлять, какие лекарственные средства (стерильные, нестерильные или те и другие): будут контролироваться и В; каком количестве. От этого будет зависеть количество сотрудников расходных материалов, размеры специализированного оборудования. Однако набор помещений и оборудования для любой микробиологической лаборатории постоянный, исходя из специфики выполняемых исследований. Обеспечение их качества возможно только при наличии квалифицированного персонала. Круг обязанностей любого сотрудника не должен быть слишком обширным, чтобы исключить риск снижения качества контроля (ОСТ 42-510-98). Поэтому для четкой и своевременной работы необходимо достаточное количество как специалистов с высшим образованием, так и технических работников. При этом каждый сотрудник должен ясно понимать задачи своей работы и персональную ответственность, которая должна быть обязательно документирована. Оценка работы персонала была и остается одним из важнейших направлений повышения эффективности любого рода деятельности (Алексеев 2001, Клеменс 1998, Магура 2001, Шарахова 2002), в частности повышения эффективности контроля качества ЛС. Периодическая комплексная оценка работы персонала — это аттестация. Основной смысл этой процедуры состоит в определении соответствия» знаний и квалификации работников занимаемой ими должности, которая проводится при отборе на работу персонала определенной квалификации, специальном обучении персонала перед назначением на работу, оценке работы сотрудников в процессе производственной деятельности.
При функционировании современной микробиологической лаборатории высоко квалифицированный и специально обученный персонал обязаны проводить валидационные испытания согласно требованиям GMP. На протяжении последних 30-и лет валидация была и остается одним из наиболее обсуждаемых разделов GMP и элементов системы обеспечения качества на фармацевтическом предприятии (Аладышева 2005). В разделе 7 ОСТ 42-510-42 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств» сформулировано следующее: «Валидация заключается в документированном подтверждении соответствия оборудования, условий производства, технологического процесса, качества полупродукта и готового продукта действующим регламентам и/или требованиям нормативной документации». Более подробно все элементы валидации описаны МУ 64-04-001-2002 и включают валидацию процессов (например, процесса стерилизации), валидацию аналитических методик (например, количественного определения микроорганизмов), валидацию очистки (например, оборудования при контаминации микроорганизмами), валидацию компьютерных систем. Представляется очевидным, что микробиологическая составляющая валидации играет существенную роль (Люлина 2001, Люнгквист Б. 1998, Попов 2003№3, Parenteral Drug Ass, 2000, Validation of analytical 1992). Однако, валидация микробиологических методик детально рассмотрена лишь в некоторых литературных источниках (Scott Cutton 2005, Carleton 1999, Akers 2003, Berry 2003).
Таким образом, проблема микробиологической контаминации ЛС необычайно актуальна как для пациентов, так и для производителей фармацевтической продукции. Производителям важно- знать причины контаминации и пути ее устранения. При всем многообразии технологических схем получения разных по происхождению ЛС основными источниками попадания микроорганизмов являются: сырье и вспомогательные вещества, технологический и вентиляционный воздух, технологическое оборудование, вода, используемая в производстве, персонал.
Для устранения подобного рода влияний и снижения риска получения некачественной продукции предприятия-изготовители переходят на работу в условиях GMP. В этой связи на фармацевтических производствах необходимо функционирование контрольных микробиологических лабораторий, подтверждающих качество ЛС на всех этапах технологической цепи. Требуется постоянный микробиологический мониторинг, демонстрирующий, что заданные значения концентрацию микроорганизмов не превышены. Мониторинг воздушной среды является существенной проблемой в мире на сегодняшний день. С одной стороны разработано достаточное количество- различных пробоотборников, с другой стороны требуется их валидация, а выполнение методик валидации не всегда дает положительные результаты. Особое значение среди причин микробиологической контаминации имеет персонал.
Для получения гарантрованного качества лекарственных средств важно не только контролировать готовый продукт, но и создавать систему обеспечения качества на производстве и в контрольных лабораториях.
Сравнительная характеристика степени микробиологической чистоты различных лекарственных средств
Для получения достоверных результатов первоначально мы рассчитывали минимальный: объем необходимых исследований. Категория Применение Бактерии(в 1 г или1 мл среды) Грибы(в 1 г или1 мл среды) Enterobacteriaceae,Pseudomonasaeruginosa,Staphylococcusaureus Escherichiacoli,Salmonella Другиекишечныебактерии 1 -Для инъекций, нфузий и других видов парентеральноговведения-В полость тела, где отсутствуют микроорганизмы-Глазные препараты-На открытые раны, ожоги Стерильность 2 -Местно, трансдермально, инотравагинально -В полость уха, носа -Для ингаляций Не более 100 суммарно Отсутствие 3 Для приема внутрь За -Детские лекарственные средства (от 0 до 1 года) Не более 50 суммарно Отсутствие 36 -Детские лекарственные средства Не более 500 и 50 дрожжевых и аэробных плесневых бактерий грибов Отсутствие Зв Жидкие лекарственные средства из синтетического сырья (растворы, сиропы, капли и др.) Не более 500 и 50 дрожжевых и аэробных плесневых бактерий грибов Отсутствие Не более 100 Зг - Лекарственные средства из синтетического сырья (таблетки, драже, капсулы, гранулы и др.) Не более 10 и 100 дрожжевых и аэробных плесневых бактерий грибов Отсутствие Не более 100 Зд -Жидкие лекарственные средства из сырья растительного, животного или природного происхождения Не более и 100 дрожжевых и 5 103 аэробных плесневых бактерий грибов Отсутствие Отсутствие Не более 100 Зе -Лекарственные средства из сырья растительного, животного или природного происхождения Не более 10J и 200 дрожжевых и аэробных плесневых бактерий грибов Отсутствие Отсутствие Не более 100 4 Препараты для ректального введения Не более 103 и 100 дрожжевых и аэробных плесневых бактерий грибов Отсутствие Микробиологическая чистота основного сырья (субстанций) и вспомогательных материалов Таблица 14
Категория Применение Бактерии(в 1 г или1 млсреды) Грибы(в 1 г или 1 мл среды) Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus Escherichiacoli,Salmonella Другиекишечныебактерии 1.2 Основное сырье (субстанции) тдля производства стерильных препаратов Не более 100 бактерий и грибов суммарно Отсутствие 2.2 Основное сырье (субстанции-) -для производства нестерильных средств Не более103аэробныхбактерий Не более 100 дрожжевых и плесневых грибов Отсутствие 3.2 Вспомогательные материалы (мука пшеничная, крахмал, тальк и др) Не более 103 аэробных бактерий Не более 100 дрожжевых и плесневых грибов Отсутствие Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus Отсутствие Не более 102 4.2 Сырье растительного, животного и природного происхождения, уровень микробной загрязненности которого невозможно снизить во время технологического процесса Не более 103 аэробных бактерий Не более 200 дрожжевых и плесневых грибов Отсутствие Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus Отсутствие Не более 102 5.2 - Лекарственное растительное сырье, которое подвергается обработке с использованием нагревания для приготовления лекарственной формы Не более 107 аэробных бактерий Не более 104 дрожжевых и плесневых грибов Отсутствие Не более 102 В таблице 15 все ЛС разделены по категориям Изменения № 1, по лекарственным формам и по полученным результатам определения микробиологической чистоты, а именно: менее 10 — в 1г (мл) ЛС микроорганизмы не были выявлены; 10 — N - выявленное количество микроорганизмов не превышает допустимого предела, обозначенного как N-более N - количество микроорганизмов превышает предельно допустимый уровень. Таблица 15 Микробиологическая чистота ЛС, исследованная в 2001 году категория Лек. форма Менее 10 10-N Более N Отечест Импор. Отечест. Импор. Отечест Импор. 1.Кат.2 МазьКапли в ухо Капли в нос Лейкопластырь Суппоз. вагин. 321 15 19 65 22044 814 27 18 1 6 Итого:394 отеч. 310 импорт. 36692,9% 28692,3% 27 6,9% 185,8% 10,25% 6 1,9% 2.Кат.3.а Гранулы Капли - 11 3 - 4 1 - Итого:19 импорт. 1473,7% 5 26,3% . З.Кат.3.бТаблеткиПорошокмикстСуспензияСиропКапли 2 1 1 65 50 16 34 9 2 5 5 8 5
Количество серий лекарственных препаратов для детей, проконтролиро ванных по показателю «Микробиологическая чистота» за 2001 г. Менее 10 10- N Более N Итого: 192 (86,4%) 25 (11,3%) 5 (2,3%) 222 (100%) И. Из 160 исследованных жидких ЛС на основе синтетических субстанций (кат. Зв) импортного производства были забракованы 8 серий (5%), а именно: Бронхолитин сироп-и Альмагель суспензия, производства фирм «Трояфарм» и «Софарма» Болгария. Жидкие ЛС, с точки зрения микробиологической чистоты, представляют большую опасность по сравнению, например, с твердыми, что объясняется более благоприятными условиями для развития микроорганизмов 90 контаминантов. Это не противоречит данным литературы, а только подтверждает их.
В материалах «Микробиологическая чистота субстанций и вспомогательных материалов для производства лекарственных препаратов» количество категорий сокращено с пяти до четырёх. Нормы на субстанции соотнесены с нормами на НЛС, производимые из этих субстанций. Требования, предъявляемые к микробиологической чистоте лекарственных средств, субстанций и вспомогательных материалов были утверждены в Изменении №2 к ГФ XI изд. (табл. 19 и 20).
Особености пробоподготовки различных лек. форм
Особенную трудность во время испытания микробиологической чистоты представляет подготовка перед анализом мягких лекарственных форм: мазей и кремов. Это связано и их физико-химическими свойствами (присутствием в их составе разнообразных, трудно эмульгируемых мазевых основ) и в некоторых случаях с наличием консервантов.
Мы проводили сравнение разных методик подготовки мягких ЛС перед испытанием на микробиологическую чистоту: 1 метод, рекомендованный в ГФ XI изд.: эмульгирование 10 г мази в 100 мл буферного раствора, подогретого до 42 С , содержащего 2,5% твина-80 и бусы. 2 метод, предлагаемый нами для. улучшения эмульгирования (изложен в проекте ОФС): перемешивание 10 г мази с5т стерильного твина-80, затем нагревание на водяной бане или-термостате до температуры не выше 40С в течение не более 30-мин. и добавление необходимого количества предварительно нагретого до температурки не выше 40 С стерильного фосфатного буферного раствора и стеклянные бусььдиаметром 5-6 мм. Далее перемешивание смеси для получения гомогенной эмульсии в разведении 1:10, которую используют для количественного и качественного определения микроорганизмов в 1 г ЛС. В качестве объектов сравнения были взяты мягкие лекарственные формы, в состав которых входит вазелиновое масло, т.е. трудно смешиваемые с водой, о Алвипсал мазь для наружного применения производства ЗАО «Алтайвитамины» о Преднизолоновая мазь для наружного применения 0,5% производства ОАО «Нижфарм» о Мазь гидрокортизоновая 1 % производства ФГУП «Муромский приборостроительный завод» Опыты проводили в разных условиях переамешивания: в ступке, истирая пестиком, во флаконе со стерильными бусами. Результаты представлены в таблице 38.
Примечание: В таблице использовали результаты, полученные после 12 кратной повторности одной и той же пробы. Исходя из представленных числовых данных, следует отметить возможность использования двух описанных методов подготовки мягких ЛС перед анализом. При контроле качества ЛС по показателю «Микробиологическая» чистота» особое значение имеет правильный; выбор метода, количественного- определения; микроорганизмов, выделяемых из исследуемых образцов. Среди применяемых методов- выделяют:; чашечные агаровые, пробирочный метод наиболее вероятных чисел и метод мембранной фильрации.
Согласно правилам; GMP методы, используемые: для контроля качества лекарственных средств, должны быть валидированы. Цель, валидации метода. -показать посредством оценки специфических характеристик, что предлагаемый; метод посева- препаратов; контролируемых по. показателю «Микробиологическая;; чистота»? соответствует предназначенным целям, а именно; .позволяет количественно определить те аэробные бактерии и . грибы, которые контаминируют; лекарственные препараты. Вшредставленношработе нами; была проведена- валидация разработанного метода количественного определения бактерий и грибов, разработанного и названного нами «модифицированный глубинный». Стандартным на сегодняшний день является метод, рекомендованный FO Ж изд:, - двухслойный. В последних изданиях Европейской и Американской фармакопеи рекомендованы глубинный и поверхностный чашечные агаровые методы. Однако, в ряде случаев их использование затруднено и мало эффективно. Например, при определении: спорообразующих бактерий- крупных, волокнистых, вязких, слизистых, склонных кхлиянию уже через 24-48ч инкубации грибов;из родов Mucor, RhizopusH др:, рост которых негзаметешчерез 24: ч инкубации, а через 48- ч даже единичные колонии покрювают всю поверхность 148 агара в чашке Петри, делая невожможным подсчет отдельных колониеобразующих единиц (КОЕ). медленно растущих микроорганизмов, напротив, образующих колонии лишь через» 5-7 суток, удлиняя, таким образом, сроки микробиологического контроля. Трудности подобного рода при количественном определении микроорганизмов. побудили нас совершенствовать метод посева для получения достоверных результатов в тех случаях, когда рутинные методы неэффективны. Для полноправного его использования требуется валидация.
Валидационные испытания выполнялись в следующей последовательности: написание протокола; выполнение задач, перечисленных в протоколе; внесение в документацию результатов испытаний; оценка результатов испытаний для того, чтобы подтвердить, что они соответствуют требованиям протокола; написание отчета по валидации. Последовательное выполнение перечисленных выше операции позволило обосновать применение малого глубинного метода посева микроорганизмов в качестве альтернативного при количественном определении бактерий и грибов, контаминирующих лекарственные средства.
Далее приводятся фактические данные по валидации альтернативного агарового метода количественного определения аэробных бактерий и грибов в нестерильных лекарственных средствах, названного нами модифицированным глубинным (МГ). При валидации метода качество используемых питательных сред были доказано собственными исследованиями, средства измерения поверены, качество тест-микроорганизмов подтверждено сертификатами коллекций.
Создание и совершенствование методов выделения и идентификации определенных микроорганизмов
Наг новом? этапе: развития в связи; с гармонизацией- методов , микробиологического контроля- НЛЄ с действующими; фармакопеями зарубежных стран: к определенным;видам?бактерий; идентифицируемых из ЛЄ, относятся: ЕхоШ, Salmonella . sp:, другие кишечные бактерии; Pi aeruginosa, S. aureus. Разработка методов; выделения w идентификации перечисленных бактерий проводилась, нами в настоящем исследовании. Разработанные методы? были утверждены в Изменении №2 к Ф XI изд. Определенные трудности представлялись в стандартизации питательных сред, так как отечественные производители выпускают сухие питательные среды; на различных белковых основах. Учитывая трудности для отечественной фармацевтической, промышленности в приобретении сред зарубежных производителей, мы провели сравнение различных питательных, сред в алгоритме микробиологического анализа, качества? НЛЄ. Использованные зарубежные питательные среды полностью совпадают с указанными в Европейской1 фармакопее. Исключением является агар ФогелягДжонсона; рекомендованный- фармакопеей, США: для; выделения;»!), aureus.
Далее представлены схемы выделения и идентификации отдельных видов бактерий, включающие использование селективных и дифференциально-диагностических питательных сред, а также сред для предварительной инкубации исследуемых образцов.
Для сравнения эффективности схем испытания на наличие E.coli и Salmonella sp., различающихся питательными средами были использованы искусственно контаминированные образцы лекарственных препаратов: -Альмагель А, Фестал таблетки, покрытые оболочкой, Микстура от кашля для детей сухая. В качестве объектов для искусственной контаминации выбрали Альмагеля А из-за гомогенности эмульсии, Фестал таблетки, покрытые оболочкой и Микстуру от кашля для детей- сухую из-за возможной высокой вероятности контаминации препаратов из животного и растительного сырья. Искусственная контаминация исследуемых образцов проводилась из расчета 50 КОЕ на 1 г (мл) препарата. После искусственной контаминации выделение E.coli проводили по представленной ниже схеме. 10 мл инокулированной суспензии из разведения 1:10 вносили в 100 мл соево-казеинового бульона, 10 мл - 100 мл среды №8, 10 мл - в 100 мл соево-казеинового бульона из диагностического набора фирмы Хаймедиа. Через 24 ч инкубации отмечали рост на всех средах в виде сильного помутнения всех жидких сред и переносили 1 мл в 10 мл бульона Мак-Конки фирмы Мерк, 1 мл в 10 мл среды №3 и 10 мл во флакон диагностического набора, содержащий 100 мл и 20 мл жидкой и плотной сред Мак-Конки соответственно.
Через 24 ч инкубации наблюдали газообразование и изменение рН жидких сред, т.е. изменение цвета бульонов из красного в желтый. Для выделения E.coli пересевали петлей на плотные среды: агар Мак-Конки фирмы Мерк, агар Мак Конки НПО «Питательные среды» г. Махачкала и агар Эндо (среду №4) и инкубировали при той же температуре 24ч. После окончания срока инкубации на всех засеянных чашках был обнаружен типичный рост микроорганизмов Через 24 ч в бульоне Мак-Конки диагностического набора фирмы Хаймедиа: наблюдалось аналогичное изменение, цвета среды и газообразование; на агаре Мак-Конки - рост крупных колоний 3-4 мм в диаметре красно-малинового цвета: Таким образом; использование флакона, содержащего и: жидкую и плотную (в данном случае среду Мак-Конки) сокращает сроки анализа, не требуя отдельного пересева, на плотную среду. Однако для; целей контроля лекарственных средств имеется существенный недостаток при использовании подобных наборов: невозможна дальнейшая: идентификация выросших колоний на плотной среде во флаконе с жидкой; особенно когда из ЛС , выделяются различные. микроорганизмы,а схемы; идентификации, требуют сначала: микроскопирования, а затем пересева, на дифференциально-диагностические питательные среды. Выросшие на агаре МакгКонки и среде №4: колонии микроскопировали, в мазках отмечали наличие грамотрицательных палочек. Для; дифференциальной диагностики выделенных бактерий использовали биохимические тесты. Из пробирок с чистой культурой пересевали петлей на агар Симмонса; (среда №14) и соево-казеновый бульон или среду № 15, а также проводили тест на наличие фермента цитохромоксидазы. Через 18-24 ч стандартной инкубации отмечали бактериальный рост или его отсутствие на агаре Симмонса (среда № 14). Утилизацию цитрата устанавливали по смещению рН среды в щелочную сторону (изменению цвета среды из зеленого в синий). Наличие индола определяли по появлению красного кольца на поверхности соево-казеинового бульона или среды № 15 при добавлении реактива Ковача.
После проведения всех исследований в контаминированных образцах Альмагеля Ау Фестала таблеток, покрытых оболочкой и; микстуры от кашля для детей были обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не утилизирующие цитрат натрия и образующие индол. В результате выполнения последовательных действий по схеме, представленной ниже, было доказано, что лекарственные средства контаминированы Е. coli.
![Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс]](/i/i/4375/184827.png "Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс] Коновалов Андрей Александрович")